第十章-花药培养课件.ppt

1、 第十章 花药培养杨柏云南昌大学生命科学学院花药培养的历史n利用离休培养花药的方法，诱导花粉形成单倍体植株的工作始于1964年（Guha et al.,1964）。n单倍体植物的主要特点是其孢子体细胞的染色体数目和配子体细胞染色体数目一致，对单倍体植物进行染色体人工加倍之后，即可得到同质结合的纯系，使育成的杂种不再分离，缩短育种年限，加快育种速度。花药培养的历史n在我国花药培养和单倍体育种方面做了大量的工作，如培养基的研制，雄核发育机理，培育新品种等。由于花药培养的方法日趋完善，培养效率也逐年提高，使这一技术开始被广泛应用于常规杂交育种，逐渐成为作物改良和新品种培育的一个重要手段。花药培养应注

2、意的问题n1材料的选择n用作花药培养的亲本植株的基因型、生长情况以及接种时花粉所处的发育时期，对花粉植株的诱导频率都有直接的影响。花药培养应注意的问题n（1）基因型：实验证明，供体植株的遗传背景对花药培养成败关系甚大。如水稻中粳稻比籼稻容易培养，前者花粉愈伤组织的诱导率平均可达10%，而后者只有12%。对各种基因型水稻的测试说明，花药培养力（愈伤组织诱导率和绿苗分化率）的顺序为糯型（粳籼）杂种粳型籼型杂交稻籼型。可见基因型在花药培养中起着关键的作用。花药培养应注意的问题n（2）生理状态：花药供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导率有直接影响。n对水稻、小麦和大麦等禾本科植物而言，大田植株比温

3、室植株、主茎穗比分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率都明显的要高。花药培养应注意的问题n不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有显著变化。如烟草、小麦早期的花药比晚期的要好，愈伤组织诱导率高，说明供体植株的生态环境，特别是温度和光周期可能对花粉发育及其对离体培养的反应有重要影响。花药培养应注意的问题n（3）花粉发育时期：不是任何发育时期的花粉都可在离体培养时诱导产生愈伤组织或胚状体，只有那些发育到特定时期的花粉，对离体刺激才最敏感。n实验证明，烟草、曼陀罗和水稻的花粉从单核中期到双核早期都可离体诱导产生愈伤组织。n小麦和玉米处于单核中期的花粉培养效果最好。n天竺葵和番茄分别为四分体和中期I的培养效果最好。花

4、药培养应注意的问题n可见不同植物的花粉对离体培养有其特定的、最敏感的发育时期。然而，对大多数植物来说，单核期的花粉比较容易培养成功。n检查和确定花粉的发育时期，通常将花粉用醋酸洋红涂片观察，但对水稻和玉米却用KII染色较好。花药培养应注意的问题n2预处理n为了获得最好的培养效果，在花药培养之前，可先对其进行预处理。n最常用的方法是低温冷藏。具体做法是将带有叶鞘的穗子或花蕾用湿纱布包裹后再用塑料袋套起，放在冰箱中冷藏。花药培养应注意的问题n不同材料对处理温度的高低有不同的要求，一般耐寒植物比喜温可耐受较低的温度。低温处理时间视使用的温度而定，较低的温度处理时间要短，反之则长。烟草79度下处理71

5、4天，水稻710度下处理1015天，大麦37度下处理714天，都可显著提高花药的出愈率。但低温处理对小麦的效果不稳定。花药培养应注意的问题n用冷处理可以增加诱导频率，其原因是：冷处理抑制纺锤体的形成，冷处理不能诱导花药的发育，但它有助于培养花粉的存活。并且阻止配子体分化，导致较高频率的花粉发育。冷处理的作用是间接的，因此不是离体花药成功培养的先决条件。花药培养应注意的问题n3材料的表面灭菌n对花药表面灭菌的方法很多，常用的方法有：用市售漂白粉饱和液浸泡1015分钟；用810%安替福民水溶液浸泡510分钟；用0.1%升汞浸泡10分钟。如果小花或花蕾包封严密，只须用70%酒精进行仔细擦拭即可。花药

6、培养应注意的问题n4获得花粉植株的一般程序n禾本科植物花粉植株的诱导，一般分二步进行。先是将花药接种到含2,4D12mg/l的诱导培养基上，形成愈伤组织。后是在花粉愈伤组织产生后的1015天，长到直径12mm时，及时将其转移到分化培养基上进行植株分化。转移太迟会降低成苗率。花药培养应注意的问题n分化培养基为去除2,4D，加入NAA或KT。在分化培养基是，愈伤组织会出现绿点，最后发育成绿色植株。此外，在禾本科植物的花药培养中，常会出现白化苗，目前还没有有效的控制方法。花药培养应注意的问题n5培养基成分n培养基成分包括无机盐、碳源、氨基酸、维生素和植物激素等。它们对花药的培养的成功率有明显的作用。

7、先前是用已有的培养基，如MS、Miller和Nitsch等，后来研制出适合不同植物的专用培养基。花药培养应注意的问题n适合烟草的H培养基（1967）；适合于禾谷类的N6培养基（1975）；适合小麦的C17培养基（1986）、W14培养基（1988）和马铃薯II培养基（1978）；适合水稻的合5培养基（1978）、通用培养基（1980）和SK3培养基（1978）；适合玉米培养的正14培养基和玉培培养基（1978）；适合大麦的FHG培养基（1988）等。花药培养应注意的问题n（1）无机盐：特别是硝态氮和铵态氮的浓度和比值，是影响花粉愈伤组织形成的重要因素，无论是N6还是C17、W14、FHG等都是

8、通过大幅度降低培养基中铵离子浓度和调整培养基中铵态氮和硝态氮的比值而使培养效率大大提高。花药培养应注意的问题n（2）碳源：作用有三，一是碳源，二是能量，三是渗透压。蔗糖是较好的碳源，烟草为3%，水稻为5%，小麦为10%，玉米为12%。在大麦的花药培养中，麦芽糖和纤维二糖的效果明显优于蔗糖。用过滤灭菌的方法，用葡萄糖代替蔗糖可明显地促进小麦花粉胚的形成和植株再生。碳源种类和浓度的改变，还有很多工作可做。花药培养应注意的问题n（3）植物激素：烟草可不用任何激素也能产生再生植株。但禾本科植物花药培养中，一般要加13mg/l的2,4D，但在玉米和燕麦的花药培养中，2,4D反而会产生抑制作用。细胞分裂素

9、类物质（KT、BA）可促进茄科植物的花粉植物的形成，但对禾本科植物花粉的培养不是必要条件。一般认为在诱导培养中加入KT有利于增强愈伤组织的胚胎发生能力。花药培养应注意的问题n（4）氨基酸和其他有机附加物：专为花药培养而设计的培养基如N6、C17、W14等都含有甘氨酸，这可能源于MS、Miller和White等常用培养基。此外，附加谷氨酰胺、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸和丙氨酸可以显著提高花粉胚及植株的获得率。酪蛋白水解物（LH）和乳蛋白水解物（CH）对花粉愈伤组织的形成和苗的分化表现出有利的作用。花药培养应注意的问题n（5）活性炭：在花药培养中常使用活性炭。实验证明，活性炭主要通过吸附而发

10、生作用，这种吸附作用是无选择的。因此，对那些离体花药不需要外源激素的植物（如烟草和燕麦），加入活性炭效果特别显著。而那些对外源激素有较强依赖的植物（如水稻和小麦），加入活性炭反而有不利影响。花药培养应注意的问题n6培养方式和培养条件n（1）培养方式：琼脂固体培养、液体培养、双层培养、分步培养等。n液体培养：不加琼脂，使接种的花药漂浮在液面进行培养，比在琼脂上培养效果更好。但随着愈伤组织的长大变重，容易深入底部，造成培养物通气不良。花药培养应注意的问题n为解决这一问题，可在培养基中加入30%Ficoll，以增加培养基的密度和浮力，便培养物浮出液面。处于良好的通气状态。花药培养应注意的问题n双层培

11、养：密度效应在花药培养中是很常见的现象。所谓密度效应是指在一定的花药接种密度范围内，花药愈伤组织的形成，随接种花药的密度增加而增加。n增加花药的密度有二种方法：一是在一定的体积的培养基中加大花药的接种数量；二是在花药数量一定的情况下，减少培养基的用量。花药培养应注意的问题n第一种方法容易造成污染，所以多采用第二种方法，即减少每个培养皿中的培养基至最少程度。如，在一个35mm10mm的培养皿内只注入0.5ml的培养基。但由于张力原因，培养基在培养皿内不易展平，再加上培养时间稍长，易干涸，影响培养效果。为克服这一缺点，可采用双层培养系统，即固体液体双层培养基。在培养皿中先加一层1mm琼脂培养基，凝

12、固后再加0.5ml液体培养基。花药培养应注意的问题n分步培养：将花药接种在液体培养基（含Ficoll）上进行漂浮培养时，花粉可以从花药中自然释放出来，散落在液体培养基中，然后及时用吸管将花粉从液体培养中取出，植株于琼脂培养基上，使其处于良好的通气环境中，使得花粉植株的诱导率大大提高。花药培养应注意的问题n条件培养基：所谓“条件培养基”即指预先培养过花药的液体培养基。用这种条件培养基再次来进行花药的培养，则可使花药的培养效率大大提高。用条件培养基培养单核中期的大麦花药，可使花粉愈伤组织的诱导率从对照组的5%提高到8090%。花药培养应注意的问题n条件培养基的制作方法如下：将培养过的培养基离心，收

13、集上清液，即为“条件培养基”。条件培养基不存在种的特异性。用培养过小麦花药的培养基对大麦同样有好的效应。花药培养应注意的问题n花药座位：花药接种在培养基的座位（方向），对培养效率也有明显的影响。花药“竖放”（即一个药爿接触培养基）比“平放”（即二个药爿接触培养基）效果更好。这可能是由于“平放”时两个药爿都接触培养基，造成通气不良所致。花药培养应注意的问题n而花药“竖放”时，只有一个药爿接触培养基，上部的一个药爿完全曝露于空气中，使其中的花粉处于良好的通气环境中。当花药“竖放”时，不但绝大多数的花粉愈伤组织都发生在上部药爿的两个药室中，而且这种愈伤组织的质量好，有较强的胚胎的发生能力。花药培养应

14、注意的问题n（2）培养条件：包括温度、湿度和光照n温度：离体培养的花药对温度很敏感。早期的培养温度一般为2528度，最近发现较高的温度有利于愈伤组织的诱导和绿苗的分化，一般在3032度之间。诱导愈伤的温度要比分化时的温度要高点好。花药培养应注意的问题n光照：离体花药对光照的反应在烟草和曼陀罗上是不同的，连续光照可明显增加烟草花粉胚的产量，但却强烈抑制曼陀罗的花粉胚胎的发生。对禾本科植物来说，一般主张愈伤组织的诱导期间进行暗培养或给以弱光或散射光处理效果较好。花药培养应注意的问题n愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行，但光照长度和给光时间不同植物要求不同。“先暗后光”是常用的方法之一，即愈伤组织

15、转入分化培养基之后，先在暗中培养35天，在愈伤组织适应天低生长素、高细胞分裂素的分化培养，并开始增长之后，再给每天14小时10002000lx的光照。花药培养应注意的问题n7.花药培养中的花粉发育过程n（1）营养细胞发育途径）营养细胞发育途径 在花药离体培养中，花粉第一次有丝分裂形成不均等的营养核和生殖核。生殖核较小，一般不分裂或只分裂1-2次，就逐步退化。而体积大的营养核经多次分裂且形成了细胞壁，最后变成了多细胞团，迅速生长，很快突破细胞壁，细胞团不断分裂，穿破药壁，可以产生胚状体或愈伤组织。花药培养应注意的问题n（2）生殖细胞发育途径）生殖细胞发育途径 在这种途径下，营养核只分裂1-2次就

16、退化了，而生殖核经多次分裂发育成多细胞团。花药培养应注意的问题n（3）营养细胞和生殖细胞同时发育的途径）营养细胞和生殖细胞同时发育的途径 花粉第一次有丝分裂形成的营养核和生殖核同时进行多次分裂，因此最后形成的多细胞团包括两部分，一部分细胞较大的是营养细胞分裂而来；另一部分细胞较小的是由生殖细胞分裂而来。花药培养应注意的问题n（4）花粉均等分裂途径）花粉均等分裂途径 花粉进行均等分裂形成两个均等的子核，以后二核间产生壁，形成两个子细胞，由两个子细胞形成多细胞团，迅速生长，穿破药壁而形成胚状体或愈伤组织。花药培养应注意的问题n8花粉植株的倍性及染色体加倍技术n（1）花粉植株的倍性：由花粉发育成的花

17、粉植株，并不象所期望的那样完全是单倍体，其中不但有二倍体，还有多倍体和非整倍体。花粉植株自然加倍主要是通过核内有丝分裂进行的。已经查明，核内有丝分裂与接种花粉的发育时间、培养基中激素的种类和水平、花粉植株发生的方式以及愈伤组织继代培养时间的长短有直接关系。花药培养应注意的问题n以烟草为例，接种二核期花粉比单核期花粉能获得更多的二倍体；在含有细胞分裂素的培养基上产生的愈伤组织比在不加激素的基本培养基上产生的愈伤组织的形成的二倍体比率显著增高；通过胚状体途径产生的花粉植株几乎都是单倍体，而经过由愈伤组织产生的花粉植株有不少是二倍体；愈伤组织继代培养的时间越长，二倍体的比例就越高。花药培养应注意的问

18、题n（2）染色体加倍技术：为了得到更多的纯合二倍体，要通过人工的方法，使单倍体植株的染色体加倍，成为纯合的二倍体。染色体人工加倍最有效的方法是用一定浓度的秋水仙素处理单倍体植物的生长点或分蘖节。对烟草来说，将具有34片真叶的试管苗置于灭过菌的0.4%秋水仙素溶液中浸泡2448小时，用无菌水洗净后再接种于新鲜培养基上，可使单倍体幼苗有25%左右加倍成为二倍体。花药培养应注意的问题n禾本科植物加倍的方法是：在分蘖盛期，从土壤中取出植株，洗净泥土，将分蘖节浸泡在加有助渗剂二甲基亚砜（12%）秋水仙素溶液中，时间在视植物而异，小麦是用0.04%秋水仙素处理8小时，水稻是0.2%的秋水仙素处理24小时。

19、花粉植株的鉴定最可靠的方法是对茎尖和根尖细胞进行染色体计数。花粉培养的优越性：n虽然已经证明花药培养对诱导单倍体十分有效，但花药培养存在的主要问题是：植株不仅来自花粉，也有来自花药的其它不同部分，结果得到不同倍数性水平的植株群体。而花粉人工培养可克服这个困难。此外还有以下的优越性：花粉培养的优越性：n1.消除了药壁和其它组织不能控制的影响，并能较好地调节支配发育的各种因素。n2.可观察到由单个细胞开始雄核发育的全过程。n3.由于花粉能均匀地接触化学的和物理的诱变因素，花粉是研究吸收、转化和诱变的理想材料。花粉培养的优越性：n4.它不象单个愈伤组织细胞那样，花粉能直接转变成胚，因此对了解雄核发育

20、的物理学和生物化学是最为适宜的。n5.还能从每个花药获得更多的单倍体植株。操作实例n1.小麦花药培养n（1）用醋酸洋红涂片镜检，选取花粉处于单核中期的小麦穗子。n（2）将叶子剪掉，只留下包裹穗子的叶鞘，用湿纱布包好放入塑料袋中，置于35度的冰箱中冷藏35天。操作实例n（3）用70%酒精棉球擦试叶鞘两遍，在无菌条件下去叶鞘，剥取花药，接种到N6（C11或W14）2,4D2.0mg/L+KT0.5mg/L的培养基上，蔗糖浓度为10%，如果用液体培养基则将蔗糖改为3.8%的葡萄糖，再添加谷氨酰胺1000mg/L，用过滤方法灭菌效果更好。操作实例n（4）将接种好的花药先置32度的环境中培养6天，再置2

21、830度的环境中培养，不加光或只给弱光。n（5）当愈伤组织长到1.52.0mm时，将基转移到含NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖3%的培养基中进行根芽分化，直加有人工光照的培养室中培养，每天光照时间为10小时，培养温度25度。操作实例n（6）在幼苗长出23片真叶时，或将其转入含多效唑3mg/L+NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖3%的培养基中诱导生根，然后及时放入38度的低温、弱光下进行蹲苗越夏。n（7）当室外气温降至6度时，将试管苗移至室外，在自然条件下炼苗57天，洗净琼脂，栽于苗床，搭棚保温，使麦苗处于不低于0度的条件下越冬。操作实例n（8）翌年早春气温回升23度时

22、，揭去薄膜n（9）早春花粉植株处于分蘖盛期时，用根尖染色体计数的方法或测量保卫细胞长度的方法（保卫细胞长度在65um以下时，为单倍体，以上为自然加倍的二倍体），确定花粉植株的倍性。n（10）将单倍体植株从土壤中取出，洗净泥土，将分蘖节浸泡在加有助渗剂二甲基亚砜（1.5%）秋水仙素（0.04%）溶液中，于18度下处理8小时，然后洗净药液，栽回土壤。操作实例n2.水稻花药培养n（1）选取处于单核中期至晚期的主茎或第一分蘖节的稻穗，保留上部叶子，用湿纱布包好，装入塑料袋中，置于710度冰箱中处理1015天。n（2）剪去叶片，用70%酒精擦拭叶鞘两遍（或用0.1%的升汞浸泡小穗10分钟），在超净工作台

23、上选取单核中期至晚期的小穗，用小剪刀从小穗基部连同花药将小穗剪下（注意不要损伤花药），收集要培养皿中。用镊子夹住小穗的顶部，切口向下，在三角瓶或培养皿边缘敲动，使花药散落在培养基上。操作实例n（3）培养基为N6的大量元素，MS的微量元素及有机成分，附加2,4D2mg/L+NAA1.5mg/L，蔗糖5%，培养温度27度，暗培养。n（4）愈伤组织出现后10左右（米粒大小）即可转到分化培养基上。分化培养基为：MSNAA1IAA0.5KT2蔗糖3%。分化培养的最初35天为暗培养，之后置于10002000lx光强，每天14小时光照，温度为27度环境下培养。操作实例n（5）将分化培养基是陆续出现的绿苗分批

24、转至含有IAA0.2mg/L及秋水仙素4mg/L的1/2MS大量元素、铁盐和其他成分全量、蔗糖1.5%的培养基上进行壮苗和初步染色体加倍。n（6）当试管苗长出3片以上真叶，并有发达根系时，将其从试管中移出，洗掉琼脂，去老根黄叶，浸泡中清水中炼苗35天，当有新生根叶长出时，即可移入土壤中，白天保持在25度，晚上不低于15度，相对湿度85%以上。操作实例n（7）当单倍花粉植株处于分蘖旺盛期，将其从花盆中挖出，洗去泥土，将分蘖节以下的部分浸入含有1.5%二甲基亚砜的0.2%秋水仙素溶液中24小时，进行染色体加倍。然后洗去药液，种回花盆中。操作实例n3.烟草花药培养n（1）取花萼与花冠等长的花蕾，并用

25、醋酸洋红涂片观察花粉的发育时期，选用花粉处于单核晚期至双核早期的花药进行接种。n（2）将花蕾去萼片，先用70%酒精浸泡10秒，再用0.1%升汞灭菌10分钟，最后无菌水洗4次。操作实例n（3）在无菌条件下去花冠，将花药接种到不含激素只附加1%活性炭的H培养基中，蔗糖浓度为3%，培养温度为2628度，弱光下培养。n（4）接种后3周左右，可见药室开裂，在裂口处可见乳黄色胚状体，见光后很快变绿，然后逐渐发育成单倍体小苗。当小苗有34片真叶时，即可进行染色体加倍。操作实例n（5）加倍时将无菌的0.4%秋水仙素溶液在超净工作台上倒入培养瓶中，浸泡小苗2448小时。倒掉药液，无菌水清洗3次，再将小苗分株移到T培养基中，n（6）在T培养基上小苗生长很快，当小苗长出发达的根系时，即可移出试管移栽，移栽后注意保湿，一周后即可成活。