提取基因组DNA课件.ppt

1、核酸抽取及杂交核酸抽取及杂交上海交通大学医学院mRNAmRNA逆转录后逆转录后RT-PCRRT-PCR结果（结果（0 0、3 3、6 6个月）个月）A B C DA B C D血浆血浆DNADNA内源性循环内源性循环DNADNA外源性循环外源性循环DNADNA自身基因组来源自身基因组来源DNADNA入侵的病毒、细菌等病原体入侵的病毒、细菌等病原体死亡细胞死亡细胞活细胞释放活细胞释放破裂细胞破裂细胞、释放核酸、释放核酸(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA，40g/ml单链DNA或RNA，20g/ml单链寡核苷酸）各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱EB与DNA的结合500 l全血

2、提取的基因组全血提取的基因组DNA电泳电泳动物组织提取基因组动物组织提取基因组DNADNA酚抽提法示意图DNA玻棒缠绕法示意图Chromosome DNA genomePlasmid DNA具有更强的抗切割和抗变性能力具有更强的抗切割和抗变性能力超超螺旋螺旋DNA分子分子 线性线性DNA分子分子 半开环半开环DNA分子分子Exprssion vector细菌收集纯化质粒DNA细菌培养细菌裂解质粒质粒DNA的小量制备的小量制备 2-5ml质粒质粒DNA的大量制备的大量制备 500ml（一）碱裂解法（一）碱裂解法(Alkaline)碱裂解法示意图14ml培养细菌收集培养细菌收集细菌破裂溶解细菌破裂

3、溶解染色体基因组和蛋白质变性、质粒变性染色体基因组和蛋白质变性、质粒变性变性的细菌基因组形成网状、蛋白质变性、质粒复性变性的细菌基因组形成网状、蛋白质变性、质粒复性Solution ISolution IISolution III分离、纯化质粒分离、纯化质粒DNA1、小量一步提取法EBCsCl密度梯度离心法示意图RNA isolation and purificationRNA isolation and purification1.内源性内源性RNA酶酶（intrinsic RNase）OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制备：0.1%DEPC在37C处理1h，并高压灭菌15min。玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的DEPC水溶液中，37C处理1h或室温下过夜。DEPC非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化RNA的过程中不使用DEPC。TrizolRNA浓度（g/ml）=A26040 1/光径稀释倍数RNA纯度=A260/A280 比值为2.0表明RNA较纯 正常时，正常时，28S RNA的荧光强度的荧光强度约为约为18S RNA的的2倍，否则提示倍，否则提示RNA的降解的降解完整性鉴定：完整性鉴定：