临床PCR检测技术-课件.ppt
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- 临床 PCR 检测 技术 课件
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1、临床PCR技术Kary B.MullisUSA,for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)method 1930年提出了两种核酸DNA和RNA的概念1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构及其半保留复制模型。一、一、PCRPCR概述概述一、PCR概述(一)PCR概念PCR(polymerase chain reaction)是一种在体外通过重复DNA合成,以扩增特定核苷酸序列的方法。特点高灵敏度高特异性体外进行快捷PCR的概念核心技术是从水栖高温菌中分离到能耐高温的Taq酶,使扩增反应不需要每一个循环加一次DN
2、A聚合酶,从而实现了自动化。应用领域迅速扩大,PCR技术成为了分子生物学中的一项突破性技术。PCR概述2000至2013年发表论文1280748篇一、PCR概述(二)原理双链DNA 变性 退火 链延伸 (膜板)(双链分成单链)(膜板与引物杂交)(DNA合成)不断重复二、实验步骤(一)核酸提取1.DNA提取100ul浓缩液100ul血清吹打混匀12000g离心5min弃上清20ul提取液100煮10min模板二、实验步骤2.RNA提取10ulA液200ulB液震荡混匀8000g离心1min200ulDEPC乙醇65干燥10minRNA模板8000g离心1min逆转录为cDNA弃上清重复洗2次50
3、ul血清3、细胞或组织剧烈震荡400ul试剂1加入400ul试剂2震荡混匀12000g离心5min完全弃上清加入试剂3模板加样扩增杂交显色(二)扩增HBV引物(168bp):上游:5-GAAGTGTGACGTTGACATCC下游:5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG扩增体系扩增体系:(50l体系)10*Buffer -5l dNTP -1l MgCl2 -3l Primer F -2l Primer R -2l DNA -2l Taq酶 -1l H2O -34l反应程序反应程序预变性 94C 3min循环延伸 72C 5min。注:每组实验阴性对照用无菌生理盐水代替模板30循环(三)结
4、果判读(四)PCR的常见问题及处理措施常见问题污染:污染:表现为阴性对照同样出现目的表现为阴性对照同样出现目的条带或条带或阴性对照出现阴性对照出现S形曲线。形曲线。污染的来源:污染的来源:来自其他测试样品的来自其他测试样品的DNA来自试验材料如重组克隆的来自试验材料如重组克隆的DNA外外源源DNA污染污染来自同一靶序列前一次来自同一靶序列前一次PCR的扩增的扩增产物。产物。(三)PCR的常见问题及处理措施如何减少污染实验室分区实验室分区酶法控制酶法控制尿嘧啶尿嘧啶DNA糖基化酶(糖基化酶(UNG)短于短于100bp的的PCR产物不能用产物不能用UNG完全消除污完全消除污染。染。紫外线表面照射紫
5、外线表面照射消除试剂、加样头中的消除试剂、加样头中的DNA污染。污染。对短对短PCR产物效果不好产物效果不好以预防污染为主以预防污染为主良好的实验室操作良好的实验室操作三、荧光定量三、荧光定量PCR(一)荧光(一)荧光PCR定量的概念定量的概念 以外参已知数量拷贝数的标准品为标准,通过扩增及对荧光值的监测,对PCR起始模板量的定量。(二)荧光定量(二)荧光定量PCR原理原理染料染色染料染色SYBR Green I溴乙锭(Ethidium Bromide)探针标记探针标记TaqManTM 分子信标(Molecular beacons)TaqManTaqMan探针reverse primerRQf
6、orward primer33553551.PolymerisationprobeRQ33553552.Strand displacementQ33553553.CleavageR3553554.Polymerisation completedQRR=ReporterQ=Quencher3(三)定量(三)定量PCRPCR的数学原理的数学原理PCR 理理 论论 方方 程程N=N0 x(1+E)nN:扩增数量扩增数量N0:起始模板数量起始模板数量E:扩增效率扩增效率n:循环数循环数 指数期指数期PCRPCR定量方程才有效定量方程才有效循环数循环数线性增长期Linear平台期Plateauy=x(1
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