不可忽视的细节—血液基因组提取课件.ppt

1、不可忽视的细节不可忽视的细节 血液基因组提取血液基因组提取天根生化科技（北京）有限公司天根生化科技（北京）有限公司DNADNA提取的原则提取的原则基因组提取方法基因组提取方法样本保存和前处理样本保存和前处理基因组提取流程基因组提取流程DNADNA保存及检测方法保存及检测方法试剂选择原则试剂选择原则 内容内容没有严格要求没有严格要求:PCR Southern Blots RFLP严格要求片段长度严格要求片段长度:构建文库构建文库 PFGE(脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳)DNA LengthDNA提取原则提取原则1：DNA片段长度片段长度没有严格要求没有严格要求 常规常规PCR严格要求产物纯度严格

2、要求产物纯度 存档、产物长期保存存档、产物长期保存 Southern杂交杂交 荧光定量荧光定量PCR SNP Microarray CGH(比较基因组杂交比较基因组杂交)DNA提取原则提取原则2：DNA产物纯度产物纯度DNADNA提取的原则提取的原则基因组提取方法基因组提取方法样本保存和前处理样本保存和前处理基因组提取流程基因组提取流程DNADNA保存及检测方法保存及检测方法试剂选择原则试剂选择原则 内容内容基因组提取方法基因组提取方法溶液盐析法：溶液盐析法：无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高硅胶膜吸附法：硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸利

3、用硅胶膜特异吸附核酸的原理来纯化核酸磁珠法：磁珠法：独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而当独特包埋的磁珠，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目的。条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目的。传统酚氯仿法：传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害身传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害身体健康。体健康。DNADNA提取的原则提取的原则基因组提取方法基因组提取方法样本保存和前处理样本保存和前处理基因组提取流程基因组提取流程DNADNA保存及检测方法保存及检测方法试剂

4、选择原则试剂选择原则 内容内容样本保存和前处理样本保存和前处理抗凝血液抗凝血液保存保存 柠檬酸、柠檬酸、EDTAEDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害作用作用,采血时如没有特殊要求采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或请使用柠檬酸或EDTAEDTA处理血样。处理血样。加入抗凝剂混匀后加入抗凝剂混匀后2-82-8保存一周；保存一周；2020保存一个月；保存一个月；7070长期保存。长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。尽可能保证样本不经过反复冻融。样本前处理样本前处理 1.1.冻存的抗凝血液使用前溶解应在冻存的抗凝血液使用

5、前溶解应在3737水浴迅速溶解。水浴迅速溶解。2.2.抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸取实验所需的体积。样本保存和前处理样本保存和前处理非抗凝血非抗凝血保存保存 非抗凝血即血凝块。非抗凝血即血凝块。-20-20保存一个月；保存一个月；-70-70长期保存。尽可能保证样本长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。不经过反复冻融。样本前处理样本前处理1.1.冻存的血凝块使用前应在冻存的血凝块使用前应在3737水浴溶解，轻柔颠倒混匀。水浴溶解，轻柔颠倒混匀。2.2.血凝块取出后先采取机械破碎的方法（例如：放入无粉橡胶手套中捏血凝块取出后先采取机械破碎的方法

6、（例如：放入无粉橡胶手套中捏碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再根据自己的实验取适量样本。血凝块前期破碎程度越高，提取基因组就越容易！血凝块前期破碎程度越高，提取基因组就越容易！样本保存和前处理样本保存和前处理白膜层白膜层保存保存 全血分离得到的白膜层放置全血分离得到的白膜层放置-20-20或或-70-70长期保存。尽可能保证样本不经长期保存。尽可能保证样本不经过反复冻融。过反复冻融。样本前处理样本前处理 1.1.白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解红细胞后得到

7、的沉淀。红细胞后得到的沉淀。2.2.冻存的白膜层使用前应在冻存的白膜层使用前应在3737水浴溶解，轻柔颠倒混匀。水浴溶解，轻柔颠倒混匀。3.3.虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液虽然得到的是白膜层，但是会有少量红细胞存在，所以红细胞裂解液 还是必要的，但用量减半。还是必要的，但用量减半。4.4.采用白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行采用白膜层提取核酸时，所用到的提取溶液体积需按照全血体积进行操作。即：操作。即：1ml1ml全血得到的白膜层提取时需要加入提取全血得到的白膜层提取时需要加入提取1ml1ml全血的试剂量。全血的试剂量。样本保存和前处理样

8、本保存和前处理血清血清/血浆血浆保存保存 现在很多科研者使用血清现在很多科研者使用血清/血浆提取游离核酸进行研究，例如：肿瘤研究。血浆提取游离核酸进行研究，例如：肿瘤研究。分离得到的血清分离得到的血清/血浆放置血浆放置-70-70保存。尽量避免样本反复冻融。保存。尽量避免样本反复冻融。样本前处理样本前处理1.1.冻存的血清冻存的血清/血浆使用前溶解应在血浆使用前溶解应在3737水浴溶解，轻柔颠倒混匀。水浴溶解，轻柔颠倒混匀。2.2.血清血清/血浆核酸提取时无需红细胞裂解。血浆核酸提取时无需红细胞裂解。3.3.只需只需100-200ul100-200ul样本，基本能满足下游常规样本，基本能满足下

9、游常规PCRPCR或荧光定量或荧光定量PCRPCR检测。检测。样本保存和前处理样本保存和前处理微量血液微量血液/干血点干血点/羊水羊水/胸水胸水保存保存 微量血液：抗凝血液微量血液：抗凝血液-20-20或或-70-70保存；保存；干血点：干燥后室温或干血点：干燥后室温或44保存；保存；羊水：羊水：-20-20或或-70-70保存。保存。样本前处理样本前处理1.1.微量血液处理同抗凝血液，不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。微量血液处理同抗凝血液，不同之处是无需进行红细胞裂解步骤。2.2.干血点加入缓冲液直接进行提取。干血点加入缓冲液直接进行提取。3.3.羊水羊水/胸水提取时先离心得到沉淀，再进行

10、裂解提取核酸。胸水提取时先离心得到沉淀，再进行裂解提取核酸。样本保存和前处理样本保存和前处理口拭子口拭子/漱口水漱口水保存保存 口拭子：干燥后室温保存口拭子：干燥后室温保存漱口水：漱口水：44保存或离心得到沉淀保存或离心得到沉淀-20-20或或-70-70保存保存样本前处理样本前处理1.1.拭子将拭子棉头剪入到离心管里，加入缓冲液直接进行提取。拭子将拭子棉头剪入到离心管里，加入缓冲液直接进行提取。2.2.有些拭子的棉头剪不下来，可以将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心有些拭子的棉头剪不下来，可以将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心得到沉淀再进行核酸提取。得到沉淀再进行核酸提取。3.3.漱口水先进行离心

11、得到沉淀再进行核酸提取。漱口水先进行离心得到沉淀再进行核酸提取。DNADNA提取的原则提取的原则基因组提取方法基因组提取方法样本保存和前处理样本保存和前处理基因组提取流程基因组提取流程DNADNA保存及检测方法保存及检测方法试剂选择原则试剂选择原则 内容内容基因组提取流程基因组提取流程加入吸附柱缓冲液漂洗DNA洗脱收集样本裂解纯化去蛋白沉淀核酸洗涤去盐溶解DNA沉淀样本裂解溶液法（盐析法）溶液法（盐析法）吸附柱法吸附柱法红细胞裂解红细胞裂解 哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞哺乳动物血液的红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞对核酸提取非常重要。红细胞

12、裂解有两种方式：对核酸提取非常重要。红细胞裂解有两种方式：采用红细胞裂解液进行裂解（通常红细胞裂解液按照采用红细胞裂解液进行裂解（通常红细胞裂解液按照3 3倍全血体积加倍全血体积加入进行裂解入进行裂解).).采用细胞裂解液进行裂解（采用细胞裂解液进行裂解（TIANGENTIANGEN的细胞裂解液的细胞裂解液CLCL是按照是按照2.52.5倍全血倍全血体积），细胞裂解液将红细胞裂解的同时可以裂解白细胞，得到的为体积），细胞裂解液将红细胞裂解的同时可以裂解白细胞，得到的为细胞核沉淀，更方便基因组细胞核沉淀，更方便基因组DNADNA的提取。的提取。红细胞裂解充分的现象：红细胞裂解充分的现象：得到的沉

13、淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进得到的沉淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进行两次裂解，注意第二次加入裂解液后需要将沉淀行两次裂解，注意第二次加入裂解液后需要将沉淀votexvotex彻底混匀。彻底混匀。核细胞裂解核细胞裂解如果有裂红的步骤，请尽量将上清去除再加入裂解液。如果有裂红的步骤，请尽量将上清去除再加入裂解液。加入裂解液（如：加入裂解液（如：TIANGENTIANGEN试剂盒中的试剂盒中的GBGB或或FGFG）和蛋白酶）和蛋白酶K K需要彻底混匀。需要彻底混匀。将沉淀打散混匀后再进行水浴。将沉淀打散混匀后再进行水浴。水浴时看到溶液变清，没有粘稠物或沉淀时即可进行下步操作

14、，通常水浴水浴时看到溶液变清，没有粘稠物或沉淀时即可进行下步操作，通常水浴时间时间10-30min.10-30min.若采用有机（酚若采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，动作要轻柔。离心分离两相氯仿）抽提时应充分混匀，动作要轻柔。离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时注意不要吸取到中间层及有时，应保证一定的转速和时间，且吸取上清时注意不要吸取到中间层及有机相。机相。核酸吸附或沉淀核酸吸附或沉淀硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法1.1.加入乙醇颠倒混匀后可能会出现絮状沉淀，动作要轻柔。加入乙醇颠倒混匀后可能会出现絮状沉淀，动作要轻柔。2.2.将裂解的溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱里，此时的

15、溶液应是高盐将裂解的溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱里，此时的溶液应是高盐低低pHpH值的。通过硅胶膜特异吸附核酸的特性将裂解溶液中的核酸吸附到硅值的。通过硅胶膜特异吸附核酸的特性将裂解溶液中的核酸吸附到硅胶膜上。胶膜上。溶液法溶液法1.1.当沉淀时间有限时，用预冷的异丙醇沉淀，沉淀会更充分。当沉淀时间有限时，用预冷的异丙醇沉淀，沉淀会更充分。2.2.加入异丙醇颠倒混匀后应出现丝状沉淀，动作要轻柔，避免基因组因加入异丙醇颠倒混匀后应出现丝状沉淀，动作要轻柔，避免基因组因过于猛烈的外力而降解。过于猛烈的外力而降解。3.3.分离沉淀的方法：分离沉淀的方法：a.a.用枪头小心地将丝状沉淀挑出；用枪头小

16、心地将丝状沉淀挑出；b.b.离心分离，应离心分离，应保证一定的转速和时间。保证一定的转速和时间。核酸洗脱或溶解核酸洗脱或溶解硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法1.1.用去蛋白液、漂洗液将膜上的核酸漂洗后，将不加溶液的吸附柱离心用去蛋白液、漂洗液将膜上的核酸漂洗后，将不加溶液的吸附柱离心以去除残留的液体及挥发乙醇成分。加入适量洗脱液以去除残留的液体及挥发乙醇成分。加入适量洗脱液TB bufferTB buffer（或自己（或自己配制的配制的bufferbuffer）后放置）后放置5-10 min5-10 min后再进行离心得到基因组后再进行离心得到基因组DNADNA。溶液法溶液法1.1.使用使用70-75

17、70-75乙醇对核酸沉淀进行洗涤。溶解乙醇对核酸沉淀进行洗涤。溶解DNADNA前需要室温或前需要室温或3737放放置几分钟晾干核酸（使乙醇挥发），然后再加入适量的置几分钟晾干核酸（使乙醇挥发），然后再加入适量的TB bufferTB buffer（或自（或自己配制的己配制的bufferbuffer）溶解）溶解DNADNA。DNADNA提取的原则提取的原则基因组提取方法基因组提取方法样本保存和前处理样本保存和前处理基因组提取流程基因组提取流程DNADNA保存及检测方法保存及检测方法试剂选择原则试剂选择原则 内容内容浓度：浓度：100100300ng/ul300ng/ul纯度：任何杂质都可能导致纯

18、度：任何杂质都可能导致DNADNA在储存过程中的降解，因此要确保纯化得在储存过程中的降解，因此要确保纯化得到的核酸的纯度。到的核酸的纯度。温度：纯化得到基因组温度：纯化得到基因组DNADNA之后需将之后需将DNADNA溶液分装保存到溶液分装保存到-20-20，反复冻溶，反复冻溶会导致会导致DNADNA的降解。的降解。溶解溶解DNA BufferDNA Buffer：纯化得到的基因组：纯化得到的基因组DNADNA最好溶解在最好溶解在TB Buffer(TIANGEN)TB Buffer(TIANGEN)或者或者TrisTris缓冲液里，因为大片段的基因组缓冲液里，因为大片段的基因组DNADNA在

19、酸性水溶液中不稳定，易在酸性水溶液中不稳定，易水解。水解。核酸保存核酸保存纯度（纯度（OD260-320/OD280-320 OD260-320/OD280-320）紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在值在0.11.0之间，通常离心柱法稀释之间，通常离心柱法稀释45倍；溶液裂解法稀释倍；溶液裂解法稀释2030倍）倍）OD260-320/OD280-320 1.9 说明有部分降解或有说明有部分降解或有RNA污染污染得率得率 紫外分光光度计进行测量紫外分光光度计进行测量YieldYield OD260OD26050ng/u

20、l50ng/ul稀释倍数稀释倍数DNA检测方法检测方法紫外分光光度法紫外分光光度法Tiangen 产品提取得率产品提取得率产品详细细节请直接点击产品名称产品详细细节请直接点击产品名称样本样本处理量处理量DNA/RNA得率得率（g）推荐试剂盒推荐试剂盒哺乳动物全血哺乳动物全血100l2DP327-磁珠法基因组提取试剂盒磁珠法基因组提取试剂盒DP316-微量样品基因组微量样品基因组DNADNA提取试剂盒提取试剂盒200l 4-12DP318-血液基因组提取试剂盒血液基因组提取试剂盒(0.1-1ml)600l12-2012-201ml4-304-30DP319-血液基因组提取试剂盒血液基因组提取试剂

21、盒(0.1-20ml)5ml100-20020ml300-700禽类、两栖类全血禽类、两栖类全血5-205-40DP318-血液基因组提取试剂盒血液基因组提取试剂盒(0.1-1ml)血凝块血凝块200-500ul1-81-8DP318/DP319500-1000ul8-158-15DP318/DP3191ml-5ml5-150DP319口腔拭子口腔拭子1个个0.5-3.5DP322-口腔拭子基因组提取试剂盒口腔拭子基因组提取试剂盒DNA检测方法检测方法电泳检测电泳检测取取2l 洗脱液洗脱液1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳,检测检测DNA分子大小，纯度以及完整性分子大小，纯度以及完整性TIANa

22、mpTIANamp 血液基因组血液基因组DNADNA提取试剂盒提取提取试剂盒提取相同血样不同起始体积的相同血样不同起始体积的DNADNA电泳图电泳图电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象，影响电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象，影响正确判断。正确判断。如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明书基因组若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明书基因组DNADNA有降解。有降解。TIANampTIANamp微量样本基因组微量样本基因组DNADNA提取试剂盒提取试剂盒样本来源一致，分别取

23、样本来源一致，分别取1l，10l，50l，100l为起始样本提取基因组为起始样本提取基因组。各取。各取2l2l基因组基因组DNADNA为模板，扩增为模板，扩增GAPDHGAPDH基因，基因，荧光定量荧光定量PCRPCR分析实验结果。分析实验结果。DNA检测方法检测方法荧光定量荧光定量PCR检测检测微量样本基因组微量样本基因组DNADNA的检测通常采用荧光定量的检测通常采用荧光定量PCRPCR检测，例如：干血点、检测，例如：干血点、微量血液等。微量血液等。DNADNA提取的原则提取的原则基因组提取方法基因组提取方法样本保存和前处理样本保存和前处理基因组提取流程基因组提取流程DNADNA保存及检测

24、方法保存及检测方法试剂选择原则试剂选择原则 内容内容试剂选择指南试剂选择指南硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法微量样本微量样本（DP316）口拭子口拭子（DP322）0.2-1ml血液血液(DP318)应用：应用：1.1.HLAHLA分型、亲子鉴定及芯片检测实分型、亲子鉴定及芯片检测实验：对验：对DNADNA的纯度、浓度均有要求。的纯度、浓度均有要求。2.2.口拭子等特殊样本的提取口拭子等特殊样本的提取适合样本：适合样本：全血、白膜层、血细胞、全血、白膜层、血细胞、血凝块、白细胞、口拭子、干血点、血凝块、白细胞、口拭子、干血点、羊水、血清羊水、血清/血浆、漱口水、微量组织血浆、漱口水、微量组织等等溶液法溶液法(DP319)应用：应用：下游实验所需下游实验所需DNADNA量较大，例量较大，例如如SNPSNP适合样本：适合样本：全血、全血、白膜层、血细胞、白膜层、血细胞、血凝块、白细胞血凝块、白细胞等等磁珠法磁珠法(DP327)应用：应用：微量样本微量样本DNADNA提取，可配合工提取，可配合工作站使用。作站使用。适合样本：适合样本：微量微量血液、干血点、血液、干血点、微量组织微量组织