大二生化实验张蕾实验九 用正交法测定几种因素对蔗糖.pptx

1、用正交法测定几种因素对用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响蔗糖酶活力的影响目的要求目的要求 1.初步掌握正交实验设计方法的使用 2.求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值实验原理实验原理 酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如：底物浓度、酶浓度、溶液的pH值和离子浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响催化反应的速度。通常是在其他因素恒定的条件下，通过对某因素在一系列变化条件下的酶活性测定，求得该因素对酶活力的影响，这是单因素的简单比较法。本实验用正交法测定温度、pH值、底物浓度和酶浓度四种因素对蔗糖酶活性的影响，这是多因素（3）的实验方法。正交法是通过正交表安排多因素实验，利用统计

2、数学原理进行数据正交法是通过正交表安排多因素实验，利用统计数学原理进行数据分析的一种科学方法，它符合分析的一种科学方法，它符合“以尽量少的试验，获得足够的、有效的信以尽量少的试验，获得足够的、有效的信息息”的实验设计原则。正交试验法的程序为下列八个步骤：的实验设计原则。正交试验法的程序为下列八个步骤：（1 1）确定试验目的。）确定试验目的。实验目的是多种多样的，如找出产品质量指标的最佳组合、确定最佳工艺条件等。本实验的目的是为了提高酶的反应速度，提高酶的活力。（2 2）选择质量特性指标。）选择质量特性指标。应选择能提高或改进的质量特性及因素效应。对于本实验来说就是产物（葡萄糖）生成量的多少。（

3、3 3）选定相关因素。）选定相关因素。即选择和确定可能对实验结果或质量特性值有影响的那些因素，可人为控制与调节的因素，如温度、pH等。这些因素之间有相互独立性。（4 4）确定水平。）确定水平。水平，又称位级，是因素的一个给定值或一种特定的措施，或一种特定的状态。水平也就是因素变化的各种状态。在确定水平时，应考虑选择范围、水平数和水平位置。如本实验的温度水平可以选择20、30、50 三个水平。（5 5）选用正交表。）选用正交表。应从因素数、水平数以及有无重点因素需要强化考察等各方面综合考虑选用正交表。一般情况下，首先根据水平数选用2或3系列表，然后，以容纳试验因素数，选用实验次数最少的正交表。如

4、有重点考察的因素，则根据其多考察的水平数，选混合型正交表。（6 6）配列因素水平，制定实验方案。）配列因素水平，制定实验方案。按随机原则，把因素配列于选用的正交表中，制定实验的顺序、时间等，即制定实验具体方案。（7 7）实施实验方案。）实施实验方案。按实验方案，认真、正确地试验，如实记录各种实验数据。（8 8）实验结果分析。）实验结果分析。对实验中取得的各种数据进行分析。如从数据中直接选出符合或接近质量特性期望值的实验条件组。如不能采用直观分析方法，则应采用其他分析方法，确定各因素主次地位可用极差分析方法，定量分析各个因素对实验结果的影响程度，则用方差分析方法。操作方法操作方法 1.实验设计：

5、1）确定指标：即实验的结果。本实验的指标是酶活力。这里，用A520值表示。2）制定因素水平表：考察四个因素（温度、pH值、底物浓度和酶浓度），每个因素取三个水平（如温度选择20、35 和50 三个水平）。水平是因素变化的范围（通常是根据专业知识确定。如无资料可借鉴，应先加宽范围再逐步缩小）内要进行实验的具体条件，如表1。表表1 1 因素水平表因素水平表 因素因素水平水平A温度温度（）BpH值值C底物浓度底物浓度（ml）D酶浓度酶浓度（ml）12030.100.022354.50.30.063506.50.60.1Note:各组可根据自己的设计选择相应因素的水平变化范围各组可根据自己的设计选择相

6、应因素的水平变化范围 如：温度的选择可为如：温度的选择可为25、35、55。3）选择正交表：可容纳三因素三水平的正交表有L9（34）、L27（313）、L18（366）和L27（389）。本实验不考察各因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数均为3的的四个因素，故选用L9（34）表，见表2。分析：A.判断各因素的水平范围是否选偏；B.判断各因素显著性大小的顺序；C.判断实验结果的置信度。4）实验安排:根据因素和各因素的水平条件设计实验。（见表3）表表2 2 正交表正交表L L9 9（3 34 4）（举例）（举例）列号试验号1（温度）2（pH）3（底物浓度）4（酶浓度）1111121222

7、31333421235223162312731328321393321表表3、实验安排（举例）、实验安排（举例）管号管号试剂试剂168249357蔗糖溶液蔗糖溶液Ml0.10.30.60.10.30.60.10.30.6缓冲液缓冲液pH体积？体积？4.01.886.01.645.0？5.0？4.0？6.0？6.0？5.0？4.0？温度温度（预热）（预热）252525353535505050酶液酶液Ml0.020.060.10.060.10.020.10.020.06温度温度5min252525353535505050准确反应准确反应5 5分钟分钟,加加0.5ml0.5ml二硝基水杨酸二硝基水杨

8、酸,2.5mlNaOH,2.5mlNaOH,沸水浴沸水浴5 5分钟分钟,冷水冲冷水冲3 3分钟分钟,以以“0 0”管管520nm520nm调调“0 0”测测A A值值.进行极差分析，找出何种条件下酶活力进行极差分析，找出何种条件下酶活力最高，影响最大的因素和最小的因素。最高，影响最大的因素和最小的因素。具体操作步骤：具体操作步骤：1 1、将已配制好的三种不同、将已配制好的三种不同pHpH的的0.2mol/L0.2mol/L的缓冲液于试管中。的缓冲液于试管中。2 2、将酶粉用蒸馏水溶解（适当体积、将酶粉用蒸馏水溶解（适当体积10-30ml10-30ml不等），离心去不等），离心去 除不溶物，除不

9、溶物，10,000rpm/min,10min,410,000rpm/min,10min,4。3 3、酶活预示实验，确定酶的稀释倍数。（可根据产物稀释的、酶活预示实验，确定酶的稀释倍数。（可根据产物稀释的 倍数来确定酶的稀释倍数）倍数来确定酶的稀释倍数）A A520520在在0.4-2.00.4-2.0之间即可。之间即可。4 4、准备、准备1010支试管。其中一支为支试管。其中一支为“0 0”号管，作为测量时的参号管，作为测量时的参 比溶液。其他九支试管根据前面的图表比溶液。其他九支试管根据前面的图表3 3加入相关的溶加入相关的溶 液，分别在不同的条件下进行酶反应。利用二硝基水杨酸液，分别在不同

10、的条件下进行酶反应。利用二硝基水杨酸 的方法测定不同管在的方法测定不同管在A A520520下的光密度值。下的光密度值。5 5、计算同一因素不同水平的级差，级差小代表离散度小，、计算同一因素不同水平的级差，级差小代表离散度小，表示该水平为酶反应的最适条件。表示该水平为酶反应的最适条件。1）数据记录：将上述两组平行实验的结果取平均值后的9个数据，填入表4中的Yi项内。2）数据整理及分析：对于一般的实验，可用极差分析，该分析方法简单、直观。对要求精细的实验，则要用方差分析，该方法可给出误差的大小估计，但有一定的计算量。对于有混合水平的正交实验，只能用方差分析。本实验，只使用极差分析极差分析：A.计

11、算出各水平实验结果总和，即第1、2、3、4列上的k1、k2、k3，并求出k1、k2、k3和k的R值（极差）。B.选出优水平组合：据R值的大小，排出因素显著性的顺序，并比较k值选出优水平组合（即好的实验条件）。由上述数据分析及验证实验，讨论在本实验条件下，温由上述数据分析及验证实验，讨论在本实验条件下，温度、度、pHpH值、底物浓度和酶浓度对蔗糖酶活性的影响；求出蔗值、底物浓度和酶浓度对蔗糖酶活性的影响；求出蔗糖酶的最适温度和最适糖酶的最适温度和最适pHpH值。值。数据记录和分析数据记录和分析因素因素水平水平A温度温度（）BpH值值C底物浓度底物浓度（ml）D酶浓度酶浓度（ml）120 K1 和

12、和 R2.5K1 和和 R0.10K1 和和 R0.02K1 和和 R235 K2 和和 R4.5K2 和和 R0.3K2 和和 R0.06K2 和和 R350 K3 和和 R6.5K3 和和 R0.6K3 和和 R0.1K3 和和 Rk1、k2、k3代表各水平测量结果的总和，代表各水平测量结果的总和，R代表各水平测量结果的级差。代表各水平测量结果的级差。数据的计算整理（举例）数据的计算整理（举例）讨讨 论论A.根据上述的计算结果，画出各因素的趋势图以判断各因素的水平范围是否选偏；B.对从9次实验结果中选出的较好实验条件、根据计算比较选出的优水平组合和综合比较后设计的较好方案，进行验证实验（今天不做，以后的科研中要做）。C.由上述数据分析及验证实验，讨论在本实验条件下，温度、pH值、底物浓度和酶浓度对蔗糖酶活性的影响；求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值。思思 考考 题题 1.正交试验设计法与简单比较法及全面试验法相比较，有何优缺点？2.设计实验方案时应遵循什么原则？