大二生化实验张蕾谷丙转氨酶活性的测定.pptx

1、谷丙转氨酶活性的测定 原原 理理 丙转氨酶（GPT）能催化丙氨酸和-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸在酸性条件下与2，4二硝基苯肼可缩合生成丙酮酸二硝基苯腙，其在碱性条件下呈现棕红色，在一定的浓度下，颜色的深浅符合比尔定律，在520nm处有最大吸收。根据颜色的深浅，通过比色法可计算出酶活性。应应 用用 GPT在肝脏中含量最多，当某种药物对肝脏早晨损害或病毒肝炎的急性阶段，由于肝细胞受损，GPT就释放到血液中，使血清中此酶水平明显升高。因此测定血清谷丙转氨酶的活性可作为诊断肝病的重要指标。实验方法实验方法1.标准曲线的制备0123452mM丙酮酸标准溶液丙酮酸标准溶液 （ml）0.000.05

2、0.100.150.200.25磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（ml）0.250.200.150.100.050.00GPT底物溶液（底物溶液（ml）0.50 0.500.500.500.500.50A.取干净试管6支，编号后按照下表添加试剂。B.将试管置于37水浴中保温10min，然后向每管中加入0.5ml2,4-二 硝基苯肼，再继续保温20min。C.然后分别向各管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml，室温下静止10min。D.用“0”号管作为空白对照，与520nm下测定吸收值。E.以各管吸收值为纵坐标，丙酮酸的浓度为横坐标做标准曲线。实验方法实验方法2.GPT活性的测定：取干净试管4支，按照

3、下表添加试剂。试剂试剂测定测定1对照对照1测定测定2对照对照2鱼肌肉匀浆液（鱼肌肉匀浆液（ml）0.250.250.250.25GPT底物溶液（底物溶液（ml）0.500.5037 水浴加热水浴加热30min（转氨基反应）（转氨基反应）2,4-二硝基苯肼（二硝基苯肼（ml）0.500.500.500.50GPT底物溶液（底物溶液（ml）0.500.50 37 水浴加热水浴加热20min（丙酮酸与（丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应）二硝基苯肼反应）0.4mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液（ml）5.005.005.005.00各管反应完成后混匀，室温静止10min后，以对照管1或者对照2调节零点，测定1和2号管的吸收值。实验数据计算 由标准曲线查出1号和2号反应管中的丙酮酸的量，根据下面的公式计算GPT的活性。GPT活力（单位）=反应管中丙酮酸的量（mM）0.5小时0.25mlGPT活力单位的定义：单位时间（每小时）内，单位体积（每ml）的酶反应生成的产物的量（mM）。实验注意事项实验注意事项1.在呈色反应中，2,4-二硝基苯肼与含有酮基的化合物反应形成苯腙。底物中的-酮戊二酸可以与2,4-二硝基苯肼反应，生成-酮戊二酸苯腙。因此在制备标准曲线的时候需要加入一定量的底物以抵消-酮戊二酸的影响。2.严格按照实验步骤进行，温度和时间均要严格控制。