微生物的实验室培养.pdf

1、课题课题1 1微生物的实验室培养微生物的实验室培养专题专题2 2微生物的培养与应用微生物的培养与应用2022.01.14【学习目标】学习目标】1.通过自主学习和精讲点拨掌握培养基的种类和 成分。2.通过合作探究和精讲点拨掌握无菌操作技术及 常见灭菌、消毒方法。3.通过自主学习掌握固体培养基制备的方法步骤。从社会中来 向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。一般家庭自制酸奶可能会导致肠胃不适，主要原因是有杂菌混入。那么怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？这需要应用无菌技术和微生物的培养技术 微生物的基本培养技术2、实验室培养微生物条件1）提供微生物生长繁

2、殖所需营养和环境条件培养基2）确保其它微生物无法混入无菌技术1、微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。高压蒸汽灭菌一、培养基1、概念：人们按照微生物对人们按照微生物对营养物质营养物质的不同需求，配制出供其的不同需求，配制出供其生长繁殖的生长繁殖的营养基质营养基质。3、类型：固体固体培养基培养基液体液体培养基培养基有无 琼脂分离、分离、计数、计数、鉴定等鉴定等2、作用：用以用以培养培养、分离分离、鉴定鉴定、保存微生物保存微生物或积累其代谢物。或积累其代谢物。阅读P14回答（提供微生物繁殖所需各种营养，提供微生物繁殖所需各种营养，异养微异养微生物的能

3、源）生物的能源）液体培养基液体培养基表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长选择培养基选择培养基:在培养基中在培养基中加入（缺少）加入（缺少）某种化学物质某种化学物质,以以抑制抑制不需要的微生物的生长不需要的微生物的生长,促进促进所需要的所需要的微生物的生长。微生物的生长。用以菌种的用以菌种的分离分离。4.4.培养基的种类培养基的种类鉴别培养基鉴别培养基:在培养基中加入在培养基中加入某种指示剂或化学药品某种指示剂或化学药品。用以菌种的用以菌种的鉴别鉴别。按按用途用途不同划分不同划分:例：大肠杆菌例：大肠杆菌伊红和美蓝伊红和美蓝培养基培养基 菌落呈深紫色，并菌落呈深紫色，并带有金

4、属光泽带有金属光泽代谢产物代谢产物培养基中加培养基中加氨苄青霉素氨苄青霉素具有具有抗抗氨苄氨苄青霉素能力青霉素能力的菌落的菌落选择选择出出没有没有抗氨苄青霉抗氨苄青霉素能力素能力的的细细菌菌选择培养基培养基培养基+氨苄青霉素氨苄青霉素培养基培养基 没有没有抗氨苄青抗氨苄青霉素能力霉素能力的菌落的菌落被淘汰被淘汰怎样怎样选择选择出出没有抗氨没有抗氨苄青霉素能力苄青霉素能力的细菌的细菌?u加入加入青霉素青霉素：u加入加入高浓度食盐高浓度食盐：u不加不加氮源氮源：u不加不加含碳有机物含碳有机物：分离出酵母菌、霉菌等真菌分离出酵母菌、霉菌等真菌(青霉素能杀死细菌、放线菌青霉素能杀死细菌、放线菌)分离出

5、金黄色葡萄球菌分离出金黄色葡萄球菌分离出固氮菌分离出固氮菌 分离出自养型微生物分离出自养型微生物选择培养基举例选择培养基举例？牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。分析营养构成？培养基组分培养基组分提供的主要营养提供的主要营养牛肉膏牛肉膏 5g5g蛋白胨蛋白胨 10g10gNacl 5gNacl 5gH H2 2O O 定容至定容至1000ml1000ml琼脂琼脂 20.0g20.0g1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方碳源、氮源、磷酸盐和维生素碳源、氮源、磷酸盐和维生素氢元素

6、、氧元素氢元素、氧元素无机盐无机盐碳源、氮源和维生素碳源、氮源和维生素凝固剂凝固剂4、培养基的营养构成:（1 1）基本成分：）基本成分：碳源、氮源、水、无机盐1 1）碳源：）碳源：无机碳源：无机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2-、HCOHCO3 3-有机碳源：有机碳源：葡萄糖、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物2）氮源：氮源：无机氮源：无机氮源：NHNH4 4、NONO3 3-、NHNHNHNH3 3 3 3等等等等有机氮源：有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸等等注：含含C C、HH、OO、NN

7、的的有机物有机物是异养型微生物的是异养型微生物的碳源、氮源、能源碳源、氮源、能源3）无机盐：无机盐：CaCa、K K、MgMg为为大量元素大量元素ZnZn、CuCu、MnMn、CoCo、MoMo等等微量元素微量元素凡是能够为微生物提供凡是能够为微生物提供C C、NN等元素的营养物质。等元素的营养物质。表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成组分组分含量含量提供的主要营养提供的主要营养牛肉膏牛肉膏5g5g碳源、磷酸盐和维生素等碳源、磷酸盐和维生素等蛋白胨蛋白胨10g10g氮源和维生素等氮源和维生素等NaClNaCl5g5g无机盐无机盐H H2 2O O定容至定容至1000ml1000m

8、l水水特殊营养物质：特殊营养物质：维生素、氨基酸、维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶嘌呤、嘧啶嘌呤、嘧啶嘌呤、嘧啶等等（牛肉膏、蛋白胨中含有牛肉膏、蛋白胨中含有）（2 2）还需满足微生物对还需满足微生物对 pH、特殊营养物质特殊营养物质、氧气的需求例如例如:培养培养乳酸菌乳酸菌要添加维生素；培养要添加维生素；培养霉菌霉菌要调酸性；培养要调酸性；培养细菌细菌要调至中性或弱碱性要调至中性或弱碱性 ；培养；培养厌氧菌厌氧菌要提供无氧条件。要提供无氧条件。二、无菌技术二、无菌技术泛指在泛指在培养微生物的操作中，避免杂菌污染的方法培养微生物的操作中，避免杂菌污染的方法。主要包括消毒和灭菌两个方面：消毒对操作的空

9、间、操作者的衣着和手灭菌培养细菌用的培养基与培养皿玻棒、试管、烧瓶、吸管和接种环等还要注意：2.2.无菌范围：无菌范围：实验操作空间消毒实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验用具灭菌实验操作过程实验操作过程:酒精灯火焰旁操作酒精灯火焰旁操作超净工作台超净工作台二、无菌技术二、无菌技术泛指在培养微生物的操作中，所有泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染防止杂菌污染的方法。的方法。防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染1.1.无菌的意义：无菌的意义：（主要包括消毒和灭菌）1 1、消毒消毒使用较为温和的使用较为温和的物理、化学或生物物理、化学或生物等方法，杀死等方

10、法，杀死物体表面或内部一物体表面或内部一部分微生物部分微生物。（1 1）概念：）概念：（2 2）消毒的方法：）消毒的方法：煮沸消毒法煮沸消毒法：100煮沸5-6min。巴氏消毒法巴氏消毒法：62-65下煮30min或80-90下煮30s-1min。化学药剂消毒法化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源。紫外线消毒法：紫外线消毒法：常用的消毒和灭菌方法常用的消毒和灭菌方法2 2、灭菌、灭菌（1 1）概念：）概念：指使用强烈的理化方法杀死物体内外指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有所有微生物微生物，包括，包括芽孢和孢子芽孢和孢子。（2 2）灭菌的方法：）灭菌的方法：灼烧灭菌：灼烧灭菌：酒

11、精灯火焰灼烧酒精灯火焰灼烧效果：效果：效果：效果：最彻底最彻底最彻底最彻底 原理：原理：原理：原理：使微生物燃烧使微生物燃烧使微生物燃烧使微生物燃烧 对象：对象：对象：对象：接种工具如接种工具如接种工具如接种工具如接种环、接种针接种环、接种针接种环、接种针接种环、接种针，以及，以及，以及，以及接种过接种过接种过接种过 程中的试管口或瓶口程中的试管口或瓶口程中的试管口或瓶口程中的试管口或瓶口等易被污染部位等易被污染部位等易被污染部位等易被污染部位 有些细菌在一定的条件下，细胞里面有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的形成一个椭圆形的休眠体休眠体，叫做芽孢。，叫做芽孢。芽孢壁很厚，对干旱

12、、低温、高温等芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸的细菌的芽孢，煮沸3 3小时以后才死亡。小时以后才死亡。细菌、原生动物、真菌和植物等产生细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的的一种有繁殖作用的无性生殖细胞无性生殖细胞。能能直接发育直接发育成新个体成新个体。原理：原理：使微生物使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等质干燥等 对象：对象：耐高温，需保持干燥的物品，耐高温，需保持干燥的物品，适用于适用于 玻璃器皿玻璃器皿 (如试管、培养皿、吸管、注射器如试管、培养皿、吸管

13、、注射器)金属器具金属器具 (如针头、如针头、镊子、剪刀等镊子、剪刀等)的灭菌的灭菌干热灭菌：干热灭菌：干热灭菌：干热灭菌：干热灭菌箱内干热灭菌箱内干热灭菌箱内干热灭菌箱内160-170 160-170 160-170 160-170 下加热下加热下加热下加热1-2h1-2h1-2h1-2h 原理：原理：原理：原理：高温蒸汽高温蒸汽高温蒸汽高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性破坏蛋白质、核酸等结构使其变性破坏蛋白质、核酸等结构使其变性破坏蛋白质、核酸等结构使其变性 优点：优点：优点：优点：操作简便，效果可靠，操作简便，效果可靠，操作简便，效果可靠，操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括

14、最耐热的可以杀灭所有的生物，包括最耐热的 某些微生物的休眠体。某些微生物的休眠体。基本保持基本保持培养基培养基的营养成分不被破坏。的营养成分不被破坏。对象：对象：对象：对象：培养基培养基培养基培养基等等等等注：使用后的培养基必须灭菌后注：使用后的培养基必须灭菌后 才能丢弃，以免污染环境。才能丢弃，以免污染环境。湿热灭菌：湿热灭菌：湿热灭菌：湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅内内内内100kPa100kPa100kPa100kPa、121 121 121 121 下下下下维持维持维持维持15-30min15-30min15-30min15-30min高压蒸汽灭菌锅

15、高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅2 2、灭菌、灭菌（1 1）概念：）概念：（2 2）灭菌的方法：）灭菌的方法：灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌湿热灭菌湿热灭菌 160-170160-170下加热下加热2-3h2-3h。100kPa100kPa、121121下维持下维持15-30min.15-30min.类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100煮沸56min巴氏消毒法不耐高温的液体6265煮30min或80-90煮30s-1min化学药剂生物活体、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双

16、手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160170加热23h湿热灭菌培养基、培养皿等,生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121,1530min3.无菌的方法：消毒与灭菌接种室、接种箱，超净工作台【例3】关于灭菌和消毒的下列说法不正确的是()A灭菌是指杀死环境中的所有微生物，包括芽孢和孢子 B灭菌和消毒实质上是相同的 C接种环用灼烧法灭菌 D常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等课堂练习【例4】培养基、培

17、养皿、接种针、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依次是()化学消毒灼烧灭菌干热灭菌紫外线消毒高压蒸汽灭菌巴氏消毒法A.B C D微生物实验室培养的基本操作程序微生物实验室培养的基本操作程序1 1、器具的灭菌、器具的灭菌2 2、培养基的配制、培养基的配制3 3、培养基的灭菌、培养基的灭菌4 4、倒平板、倒平板5 5、微生物接种、微生物接种6 6、恒温箱中培养、恒温箱中培养7 7、菌种的保存、菌种的保存三、实验操作三、实验操作大肠杆菌的纯化培养大肠杆菌的纯化培养制备制备牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨固体培养基固体培养基纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌例如：例如：1000ml1000ml牛肉膏蛋白

18、胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H H2 2O O 定容至定容至1000ml1000mlNacl 5gNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g10g牛肉膏牛肉膏 5g5g琼脂琼脂 20.0g20.0g1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解 取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂、搅拌琼脂、搅拌 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、

19、分装、封口：分装、封口：5.5.灭菌灭菌：6.6.倒平板倒平板：加棉塞、包牛皮纸、橡皮筋勒紧加棉塞、包牛皮纸、橡皮筋勒紧培养基高压蒸汽灭菌，培养皿干热灭菌培养基高压蒸汽灭菌，培养皿干热灭菌制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基计算计算称量称量溶化溶化调节调节pHpH灭菌灭菌倒平板倒平板无菌检查无菌检查计算计算称量称量溶化溶化调节调节pHpH灭菌灭菌倒平板倒平板无菌检查无菌检查123 42.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。3.用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约1020mL)倒入培养皿，左手立即盖上皿盖。4.等待平板冷却凝固（约需510min）。然后

20、，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。1.1.将培养皿放在将培养皿放在火焰火焰旁旁的桌面上，右手拿的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。左手拨出棉塞。倒平板注意事项：温度：50左右操作：在酒精灯火焰附近冷凝后平板倒置防止皿盖上的水珠落防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染入培养基，造成污染灼烧灭菌，灼烧灭菌，防止瓶口的微生防止瓶口的微生物污染培养基物污染培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基7.7.无菌检查：无菌检查：37的恒温箱中培养12h24h，无杂菌污染才可用来接种.培养基灭菌后，需培养基灭菌后，需冷却冷却到到什么时候什么时候，才能用

21、来倒平板？才能用来倒平板？约约5050为什么这样操作？为什么这样操作？为什么为什么平板需倒置？方法步骤1 1、制备培养基、制备培养基1 1 1 1）配制培养基）配制培养基）配制培养基）配制培养基称取去皮马铃薯称取去皮马铃薯称取去皮马铃薯称取去皮马铃薯200g200g200g200g，切成小块，加水，切成小块，加水，切成小块，加水，切成小块，加水1000ml1000ml1000ml1000ml，加热煮，加热煮，加热煮，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g20g2

22、0g20g葡萄糖、葡萄糖、葡萄糖、葡萄糖、15-20g15-20g15-20g15-20g琼脂，用蒸馏水定容至琼脂，用蒸馏水定容至琼脂，用蒸馏水定容至琼脂，用蒸馏水定容至1000ml.1000ml.1000ml.1000ml.2 2 2 2）灭菌）灭菌）灭菌）灭菌将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌

23、锅中，在压力为皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa100kPa100kPa100kPa、温度为、温度为、温度为、温度为121121121121的条件下，灭菌的条件下，灭菌的条件下，灭菌的条件下，灭菌15-30min.15-30min.15-30min.15-30min.将将将将5-85-85-85-8套培养皿包成一包，用几套培养皿包成一包，用几套培养皿包成一包，用几套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170160-170160-170160-170灭菌灭菌灭菌灭菌2h.2h.2h.2h.包器材包器材