医学精品课件：20180328 扫描电子显微镜.ppt

1、core高红阳1扫描电子显微镜扫描电子显微镜Scanning Electron Microscope（SEM）复旦大学基础医学院电镜室复旦大学基础医学院电镜室 高红阳高红阳core高红阳 2023年2月2 引言 扫描电镜的特点 扫描电镜的基本结构与原理 扫描电镜的生物样品制备技术 扫描电镜图片core高红阳 2023年2月3引引 言言core高红阳 2023年2月4 不少工作要求能在保持自然形态的条件下，对样品表面不少工作要求能在保持自然形态的条件下，对样品表面形态特征进行直接观察，如植物花粉、孢子、昆虫等，这形态特征进行直接观察，如植物花粉、孢子、昆虫等，这些观察要求电镜有较大的景深、较大的

2、观察范围和简单的些观察要求电镜有较大的景深、较大的观察范围和简单的样品制备过程或不经过任何处理立即进行观察，因此诞生样品制备过程或不经过任何处理立即进行观察，因此诞生了扫描电镜。了扫描电镜。1935年德国人年德国人Kholl提出了提出了SEM的设计思想与工作原理的设计思想与工作原理 1942年英国剑桥大学在年英国剑桥大学在CW Oatley指导下制成世界上第指导下制成世界上第一台一台SEMcore高红阳 2023年2月5 电子显微镜电子显微镜：一种高精密度的电子光学仪器，用电：一种高精密度的电子光学仪器，用电子束成像，具有较高分辨率和放大倍数，是观察和研究子束成像，具有较高分辨率和放大倍数，是

3、观察和研究物质微观结构的重要工具。物质微观结构的重要工具。扫描电子显微镜（扫描电镜，扫描电子显微镜（扫描电镜，SEM）：用极细的电子）：用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探扫描束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探扫描式测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显式测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体（细胞、组织等）表面的立体构像，可摄制成照示物体（细胞、组织等）表面的立体构像，可摄制成照片。用于观察样品表面的形貌结构。片。用于观察样品表面的形貌结构。core高红阳 2023年2月6core高红阳 2023年2月7扫描电镜的特点扫描电镜的特点core

4、高红阳 2023年2月8 电子束冲击样品，利用从样品表面发射的二次电电子束冲击样品，利用从样品表面发射的二次电子成像，这样所观察的就不是样品的内部结构，子成像，这样所观察的就不是样品的内部结构，而是表面的特征。而是表面的特征。观察表面形貌，富于立体感core高红阳 2023年2月9景深长，立体感强“景深景深”是用以表达纵深方向层次细节程度的度是用以表达纵深方向层次细节程度的度量，数值不固定，与放大倍数和分辨率有关。扫量，数值不固定，与放大倍数和分辨率有关。扫描电镜景深大，图像立体感强。扫描电镜的景深描电镜景深大，图像立体感强。扫描电镜的景深比光学显微镜大几百倍，比透射电镜大十倍左右比光学显微镜

5、大几百倍，比透射电镜大十倍左右，并且可不受样品大小和厚度的限制。，并且可不受样品大小和厚度的限制。core高红阳 2023年2月10放大范围广，分辨率高 光学显微镜的放大倍数一般为光学显微镜的放大倍数一般为12000倍，最大分辨倍，最大分辨率为率为0.11微米。微米。透射电镜的放大倍数为透射电镜的放大倍数为2或或3千千100万倍，分辨率为万倍，分辨率为0.20.5纳米。纳米。扫描电镜的放大倍数可从数十倍、直到十几万倍，扫描电镜的放大倍数可从数十倍、直到十几万倍，它的有效放大范围广，使用方便。这样既可在低倍时它的有效放大范围广，使用方便。这样既可在低倍时观察一个蚊子的全貌，又能逐步放大后，不同程

6、度的观察一个蚊子的全貌，又能逐步放大后，不同程度的观察其某些局部的细微结构。分辨率可达几个纳米。观察其某些局部的细微结构。分辨率可达几个纳米。core高红阳 2023年2月11可观察块状标本 由于扫描电镜是收集样品的二次电子进行成由于扫描电镜是收集样品的二次电子进行成像，样品放在物镜强磁场以外，因此可有足够像，样品放在物镜强磁场以外，因此可有足够的空间来放置大块标本，标本体积一般可为的空间来放置大块标本，标本体积一般可为0.510cm3。core高红阳 2023年2月12样品制备简单 与透射电镜样品制备相比，制备过程较简单，与透射电镜样品制备相比，制备过程较简单，不需包埋、切片。有些样品含水分

7、较少，干燥过不需包埋、切片。有些样品含水分较少，干燥过程不易变形时，可不经任何处理或简单喷镀金属程不易变形时，可不经任何处理或简单喷镀金属后即可放于扫描电镜下进行观察。后即可放于扫描电镜下进行观察。core高红阳 2023年2月13可结合元素分析 可结合能谱仪或波谱仪进行可结合能谱仪或波谱仪进行X射线显微分析，射线显微分析，这样可在观察形貌的同时逐点进行细胞结构的元这样可在观察形貌的同时逐点进行细胞结构的元素分析，便于进行快速综合的研究。素分析，便于进行快速综合的研究。core高红阳 2023年2月14扫描电镜的基本结构和原理 core高红阳 2023年2月15扫描电镜重要组成部分 形成电子探

8、针的电子光学系统形成电子探针的电子光学系统 探针的电子束打击样品表面形探针的电子束打击样品表面形成信息信号成信息信号 检测系统检测系统 电子偏转系统电子偏转系统core高红阳 2023年2月16电子探针与样品的交互作用一束细聚焦的电子束轰一束细聚焦的电子束轰击样品表面时，入射电子击样品表面时，入射电子与样品的原子核和核外电与样品的原子核和核外电子将产生弹性或非弹性散子将产生弹性或非弹性散射作用，并激发出反映样射作用，并激发出反映样品形貌、结构和组成的各品形貌、结构和组成的各种信息，如：二次电子、种信息，如：二次电子、背散射电子、阴极发光、背散射电子、阴极发光、特征特征X 射线、俄歇过程和射线、

9、俄歇过程和俄歇电子、吸收电子、透俄歇电子、吸收电子、透射电子等。射电子等。core高红阳 2023年2月17二次电子成像原理 入射电子与样品相互作用后，使样品原子较外层电子电离产生的电子，入射电子与样品相互作用后，使样品原子较外层电子电离产生的电子，称二次电子。习惯上把能量小于称二次电子。习惯上把能量小于50eV电子统称为二次电子，仅在样品表电子统称为二次电子，仅在样品表面面5nm10nm的深度内才能逸出表面的深度内才能逸出表面 扫描电镜荧光屏上以亮度不同来反映物体表面的形貌。越亮，表面约突扫描电镜荧光屏上以亮度不同来反映物体表面的形貌。越亮，表面约突出；越暗，越凹陷。出；越暗，越凹陷。样品表

10、面高低参差，凹凸不平，而电子束中各个电子以几乎平行方向打样品表面高低参差，凹凸不平，而电子束中各个电子以几乎平行方向打击至样品表面，但在样品表面不同点上受电子作用力的角度不同，激发出击至样品表面，但在样品表面不同点上受电子作用力的角度不同，激发出的二次电子量亦不同。的二次电子量亦不同。二次电子是由固定位置的集电器所收集，由于电子束至样品表面各点的二次电子是由固定位置的集电器所收集，由于电子束至样品表面各点的入射角不同，引起二次电子向空间散射的角度也不同，结果进入集电器中入射角不同，引起二次电子向空间散射的角度也不同，结果进入集电器中二次电子的数量也有不同。二次电子的数量也有不同。因此进入集电器

11、的二次电子数量是样品表面特征和入射角的函数，图像因此进入集电器的二次电子数量是样品表面特征和入射角的函数，图像上的亮度也受上述二因素影响。在样品凸出的地方，以及面向集电器的方上的亮度也受上述二因素影响。在样品凸出的地方，以及面向集电器的方向，所成图像较亮，反之则较暗。向，所成图像较亮，反之则较暗。core高红阳 2023年2月18其他影响因素 原子序数的差异原子序数的差异原子序数高的元素，二次电子发射强；反之原子序原子序数高的元素，二次电子发射强；反之原子序数低的元素，二次电子发射弱。因此样品结构内元素数低的元素，二次电子发射弱。因此样品结构内元素的不同，在图像上也会形成一定的亮度差异。的不同

12、，在图像上也会形成一定的亮度差异。样品的边缘和尖端效应样品的边缘和尖端效应导电性能差的样品经常容易产生充、放电现像，以导电性能差的样品经常容易产生充、放电现像，以及样品的电磁特性等也会造成二次电子发射数量上的及样品的电磁特性等也会造成二次电子发射数量上的差异和对电子轨迹产生偏折的影响。差异和对电子轨迹产生偏折的影响。core高红阳 2023年2月19二次电子检测二次电子检测core高红阳 2023年2月20core高红阳 2023年2月21扫描电镜生物样品制备技术 core高红阳22扫描电镜样品制作步骤扫描电镜样品制作步骤 取材：样品（如血细胞、组织）面积小于样品台，样品编号。清洗：清除样品表

13、面的黏液、油脂、蜡质、杂质等 蒸馏水；超声波；蛋白水解酶；磷酸缓冲液、生理盐水；脂溶剂；（不损伤样品表面细节）固定：2.5%戊二醛、1锇酸双固定 清洗：磷酸缓冲液 脱水及置换：乙醇、丙酮、醋酸异戊酯等 临界点干燥：临界点干燥仪 样品粘贴：样品台或载玻片上 金属镀膜：金、铂、金/铂（6/4）、铂/钯（7/3）、离子溅射法 真空镀膜法 扫描电镜观察core高红阳23几种常见生物扫描电镜样品的取样准备几种常见生物扫描电镜样品的取样准备 组织样本 血管腔、肺泡腔等，需将材料进行简单切割，保证腔面表面不受破坏。样品基底部尽量切割平整，便于样品粘台 含水量少的样品 花粉、药粉：干燥后，均匀地粘贴在样品台上

14、，直接喷金观察 头发、果壳：表面清洗干净，烘干，粘贴、喷金、观察 血细胞 一小片盖玻片用一小片盖玻片用1 1聚乙烯醇缩甲醛（聚乙烯醇缩甲醛（Formvar)Formvar)制膜；一小滴抗凝血滴制膜；一小滴抗凝血滴在制好膜的盖玻片上，自然静置在制好膜的盖玻片上，自然静置20min20min，用滤纸条吸干表面及四周多余，用滤纸条吸干表面及四周多余的液体；的液体；2.52.5戊二醛固定戊二醛固定1 12 2小时，以后步骤同普通样品制备。小时，以后步骤同普通样品制备。培养细胞 事先将细胞培养在适合大小的玻璃片（如圆形细胞爬片）上，停止培事先将细胞培养在适合大小的玻璃片（如圆形细胞爬片）上，停止培养时先

15、弃去细胞培养液，再用养时先弃去细胞培养液，再用0.1mol/L0.1mol/L的磷酸缓冲液漂洗；的磷酸缓冲液漂洗；2.52.5戊戊二醛固定二醛固定1 12 2小时小时core高红阳 2023年2月24core高红阳 2023年2月25经与未经临界点干燥细胞形态比较经与未经临界点干燥细胞形态比较core高红阳 2023年2月26某些溶液的临界温度和压力某些溶液的临界温度和压力 core高红阳 2023年2月27core高红阳 2023年2月28 离子溅射仪离子溅射仪core高红阳 2023年2月29 真空镀膜仪真空镀膜仪core高红阳 2023年2月30扫描电镜图片扫描电镜图片core高红阳31

16、血细胞扫描电镜照片血细胞扫描电镜照片core高红阳32昆虫昆虫扫描电镜照片扫描电镜照片core高红阳33培养细胞扫描电镜照片培养细胞扫描电镜照片core高红阳34培养细胞扫描电镜照片培养细胞扫描电镜照片core高红阳35培养细胞扫描电镜照片培养细胞扫描电镜照片core高红阳36血管内表面扫描电镜照片血管内表面扫描电镜照片core高红阳 2023年2月37 花粉花粉core高红阳 2023年2月38 破壁灵芝孢子粉破壁灵芝孢子粉core高红阳 2023年2月39 细菌细菌core高红阳 2023年2月40 滤纸滤纸core高红阳 2023年2月41 材料材料core高红阳 2023年2月42材料材料core高红阳 2023年2月43 鼻粘膜鼻粘膜core高红阳 2023年2月44角膜内皮细胞角膜内皮细胞core高红阳 2023年2月45头发头发core高红阳 2023年2月46 骨片陷窝骨片陷窝core高红阳 2023年2月47