《动物毒理学》课件：第六章-特殊毒性作用-.ppt

1、第六章第六章 特殊毒性作用特殊毒性作用第一节第一节 致突变作用及其评价致突变作用及其评价（一）概述（一）概述遗传学和遗传毒理学遗传学和遗传毒理学 1.基本概念基本概念 2.遗传损伤的类型遗传损伤的类型（二）致突变物的检测方法（二）致突变物的检测方法 1.细菌回复突变试验细菌回复突变试验(Ames)试验试验 2.微核试验微核试验 3.小鼠精子畸形试验小鼠精子畸形试验 4.显性致死试验显性致死试验 5.染色体畸变分析染色体畸变分析（一）概述（一）概述1.基本概念基本概念v遗传毒性遗传毒性 泛指对遗传物质的毒性泛指对遗传物质的毒性v遗传毒理学遗传毒理学(genetic toxicology)研究研究

2、化学物化学物及其他及其他环境因素环境因素对生物体对生物体遗传物质遗传物质的损害作的损害作用及其规律。用及其规律。变异变异(variation)指同一物种的个体间和历代间的差异。指同一物种的个体间和历代间的差异。突变突变(mutation)指遗传物质指遗传物质发生可遗传的变异，分为发生可遗传的变异，分为自发自发突变突变和和诱发突变诱发突变。v致突变作用致突变作用(mutagenesis)指外来因素引起指外来因素引起生物体细胞核生物体细胞核中中的的遗传物质遗传物质发生改变的能力，即突变的发生及其过程，发生改变的能力，即突变的发生及其过程，又称又称诱变作用诱变作用。v诱变剂诱变剂(mutagen)指

3、能引起突变的物质，又称指能引起突变的物质，又称致突变物致突变物或或遗传毒物遗传毒物(genotoxic agent)。2.遗传损伤的类型遗传损伤的类型碱基置换碱基置换移码突变移码突变整码突变整码突变片断改变片断改变染色体分离异常染色体分离异常非整倍体非整倍体整倍体整倍体染色体畸变染色体畸变插入、复制插入、复制倒倒 位位环状、无着丝微环环状、无着丝微环断片、缺失、微小体断片、缺失、微小体易易 位位辐辐 射射 体体断断 裂裂基因突变基因突变突变的后果突变的后果体细胞体细胞突变突变良性肿瘤良性肿瘤恶性转化恶性转化细胞衰老细胞衰老已分化胚胎细胞受损已分化胚胎细胞受损未分化胚胎细胞受损未分化胚胎细胞受损

4、动脉硬化动脉硬化癌变癌变未知疾病未知疾病老化老化流产与死胎流产与死胎功能或结构畸形功能或结构畸形胚胚胎胎综综合合症症显性致死显性致死突变的后果突变的后果生殖细胞生殖细胞 突变突变显性致死显性致死隐性致死隐性致死存活突变存活突变流产与死胎流产与死胎胚胎综合症胚胎综合症功能和结构畸形功能和结构畸形生育功能障碍生育功能障碍遗传性疾病遗传性疾病基因负荷基因负荷（二）致突变物的检测方法（二）致突变物的检测方法 致突变物一般通过致突变物一般通过致突致突变试验变试验检测。检测。致突变试验中应注意：致突变试验中应注意：v观察的观察的效应终点类型效应终点类型v试验配套试验配套vDNA完整性改变完整性改变vDNA

5、重排或交换重排或交换vDNA碱基序列改变碱基序列改变v染色体完整性改变染色体完整性改变v染色体分离异常染色体分离异常 不同类型的遗传学终点不同类型的遗传学终点 原核细胞和真核细胞原核细胞和真核细胞 体内试验和体外试验体内试验和体外试验 体细胞和生殖细胞体细胞和生殖细胞主要致突变试验主要致突变试验vAmes试验试验v微核试验微核试验v显性致死试验显性致死试验v染色体畸变试验染色体畸变试验v姐妹染色单体交换试验姐妹染色单体交换试验v小鼠淋巴瘤试验小鼠淋巴瘤试验v程序外程序外DNA合成试验合成试验v果蝇伴性隐性致死试验果蝇伴性隐性致死试验v精子畸形试验精子畸形试验1.细菌回复突变试验细菌回复突变试验

6、(Ames)试验试验v原理原理 正向突变正向突变 野生型细菌野生型细菌 突变型细菌突变型细菌 （原养型）（原养型）回复突变回复突变 （组氨酸缺陷型）（组氨酸缺陷型）v不适用于具有不适用于具有杀菌或抑菌杀菌或抑菌作用的受试物；作用的受试物；v不适用于具有不适用于具有妨碍哺乳动物细胞复制系统妨碍哺乳动物细胞复制系统的受试物。的受试物。Ames试验设计试验设计v菌株菌株组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌 TA97、TA98、TA100、TA102各种各种移码型移码型诱变剂：诱变剂：TA97、TA98引起引起碱基对置换碱基对置换的诱变剂：的诱变剂：TA100检出其它测试菌株不能检出或

7、极少检出其它测试菌株不能检出或极少检出的诱变剂（如甲醛、过氧化氢检出的诱变剂（如甲醛、过氧化氢化合物等）：化合物等）：TA102菌株菌株检出突变类型检出突变类型TA97移码移码TA98移码移码TA1357移码移码TA1359移码移码TA100置换及移码置换及移码TA102置换及移码置换及移码TA104置换及移码置换及移码TA1535置换置换Ames试验设计试验设计v受试物受试物 最低剂量每皿最低剂量每皿0.1g，最高剂量每皿，最高剂量每皿5 mg，设，设45个剂量个剂量v方法方法 平板掺入法平板掺入法v质粒易丢失，故应尽可能质粒易丢失，故应尽可能减少传代减少传代；v鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌

8、是是条件致病菌条件致病菌，所，所以用过的器皿应放入石碳酸中或进以用过的器皿应放入石碳酸中或进行煮沸行煮沸灭菌灭菌，培养基也应经煮沸后，培养基也应经煮沸后倒弃；倒弃；v肝匀浆的提取应重视肝匀浆的提取应重视无菌操作无菌操作，并，并应做无菌测定，提取过程尽可能用应做无菌测定，提取过程尽可能用冰浴保持冰浴保持低温低温。vS-9混合液要在使用时混合液要在使用时随时配制随时配制。Ames试验结果评定试验结果评定v阳性阳性v诱发回变菌落数诱发回变菌落数/自发回变菌落数自发回变菌落数2v有有剂量剂量-反应关系反应关系或至少某一测试点有重复，或至少某一测试点有重复，并有统计学意义并有统计学意义v结果应是结果应是

9、至少至少2次独立试验次独立试验的重复结果的重复结果v阴性阴性v浓度达到浓度达到5 mg/皿皿为阴性者为阴性者Ames试验的特点试验的特点v快速快速v简便简便v敏感敏感v检出率高检出率高v有假阳性结果有假阳性结果 因微生物遗传信息较哺乳动因微生物遗传信息较哺乳动物数量少、且结构简单，无免疫机能物数量少、且结构简单，无免疫机能例：例：Ames试验检测喹赛多、喹乙醇试验检测喹赛多、喹乙醇v受试物：喹乙醇受试物：喹乙醇v菌种：菌种：TA97、TA98、TA100、TA102v实验动物：雄实验动物：雄Wistar大鼠大鼠5只，用于制备只，用于制备S9AmesAmes试验所需大鼠肝试验所需大鼠肝S9S9制

10、备制备雄性雄性Wistar大鼠大鼠5只只PCB溶于玉米油中溶于玉米油中500mg/kg b.w.剂量一次腹腔注剂量一次腹腔注射射5d后断头处死，无菌取肝脏后断头处死，无菌取肝脏制备肝匀浆制备肝匀浆低温低温9000g离心离心取上清，低温保存备用取上清，低温保存备用PCB：多氯联苯：多氯联苯S9无菌检查和活力测定结果无菌检查和活力测定结果（A）（B）（A）不加）不加S9的，（的，（B）加）加S9的的Ames试验试验 剂量设计和分组：剂量设计和分组：v药物：喹乙醇药物：喹乙醇25g/皿皿设阴性、溶剂、阳性对照、设阴性、溶剂、阳性对照、+S9和和S9平行平行试验方法：标准平皿掺入法试验方法：标准平皿掺

11、入法Ames试验结果试验结果 喹乙醇喹乙醇 25g/皿：皿：TA97,TA98,TA100(S9)TA102(+S9)TA102(S9)阳性阳性Ames试验结果试验结果(A)(B)(C)(D)(A)TA97阴性，阴性，(B)TA97阳性，阳性，(C)TA98阴性，阴性，(D)TA98阳性阳性Ames试验结果试验结果(E)(F)(G)(H)(E)TA100阴性，阴性，(F)TA100阳性，阳性，(G)TA102阴性，阴性，(H)TA102阳性阳性例：投加例：投加二氧化氯二氧化氯后水的后水的Ames变化变化 v水样处理步骤水样处理步骤 水样水样XAD树脂吸附树脂吸附乙酸乙酯洗脱乙酸乙酯洗脱KD浓缩

12、浓缩器浓缩器浓缩氮气吹干氮气吹干DMSO定容定容致突变试验致突变试验 菌株的选择菌株的选择v试验选用试验选用灵敏度较高灵敏度较高的带的带R因子的因子的TA98和和TA100菌菌株。这两种菌种对饮用水中复杂的混合物有较高的株。这两种菌种对饮用水中复杂的混合物有较高的敏感性。敏感性。v因饮用水中多为因饮用水中多为直接致突物直接致突物，故，故不加不加肝微粒体酶肝微粒体酶（S9）活化系统）活化系统。v每一受试物的剂量做每一受试物的剂量做两个平行样两个平行样v用用溶剂溶剂DMSO作作阴性对照阴性对照vTA100以叠氮化钠（以叠氮化钠（NaN3）做阳性对照）做阳性对照vTA98以灭滴灵（以灭滴灵（MDI）

13、为阳性对照。）为阳性对照。v致突结果用突变率（致突结果用突变率（MR）表示，）表示，突变率突变率MR（诱变菌落平均数皿）（诱变菌落平均数皿）/（空（空白对照菌落平均数皿）白对照菌落平均数皿）水样的水样的Ames试验结果试验结果Ames试验结果试验结果细菌名称细菌名称水样体积水样体积L原水突变率原水突变率出水突变率出水突变率TA100 2.01.51.00.5 3.152.781.871.55 1.461.401.201.04TA98 2.01.51.00.5 5.333.892.631.93 2.082.682.041.76二氧化氯二氧化氯对水样结果的分析对水样结果的分析vTA 100菌种：菌

14、种：原水的原水的4个水个水样中均出现阳性结果，其样中均出现阳性结果，其中有二个水样的突变率大中有二个水样的突变率大于于2。v图图1：剂量反应关系剂量反应关系基本为基本为直线，说明原水对直线，说明原水对TA100菌种有较强的致突变活性。菌种有较强的致突变活性。v出水的出水的4个水样中突变率均个水样中突变率均小于小于2.0，从图，从图1没有显示没有显示明显的线性关系，说明已明显的线性关系，说明已基本不存在致突变活性基本不存在致突变活性。对水样结果的分析对水样结果的分析vTA98菌种：菌种：原水的原水的4个水样个水样中中3个水样的突变率大于个水样的突变率大于2。v图图2：剂量反应关系基本为：剂量反应

15、关系基本为直线，因此说明原水对直线，因此说明原水对TA98菌种也有较强的致突菌种也有较强的致突变活性。变活性。vTA98菌种：出水的菌种：出水的4个水样个水样突变率均在突变率均在2左右，剂量反左右，剂量反应关系没有呈现明显的线性应关系没有呈现明显的线性关系，说明关系，说明出水中致突变活出水中致突变活性已大大降低性已大大降低。结论结论vAmes试验：被石油类物质污染的饮用水经过投加试验：被石油类物质污染的饮用水经过投加二氧化氯氧化后，致突变活性明显降低，二氧化氯氧化后，致突变活性明显降低，Ames值值由阳性转变为阴性。由阳性转变为阴性。v二氧化氯：对饮用水中石油类污染物具有较强的二氧化氯：对饮用

16、水中石油类污染物具有较强的去除作用，可使水中有毒有害有致癌性的萘系物去除作用，可使水中有毒有害有致癌性的萘系物和苯系物和苯系物氧化降解氧化降解为毒性较小、无致癌作用的物为毒性较小、无致癌作用的物质。质。露华浓染发剂等五品牌检出露华浓染发剂等五品牌检出含致癌物间苯二胺含致癌物间苯二胺v央视曝光央视曝光“一洗黑一洗黑”事件事件v2009年年3月：广东，月：广东，5批次染发剂样品均含有批次染发剂样品均含有间苯间苯二胺二胺。v“露华浓丽然染发剂露华浓丽然染发剂(黑色黑色)美国美国”；v“生态生态1号莹翠营养蛋白染发霜号莹翠营养蛋白染发霜”；v“雪完美延采护发染发霜雪完美延采护发染发霜(自然黑自然黑)”

17、；v“欧威雅植物彩色焗油欧威雅植物彩色焗油(自然黑自然黑)”；v“康臣康臣3in1新彩丝护染霜新彩丝护染霜”。v间苯二胺是一种工业染料，是一种国际公认的间苯二胺是一种工业染料，是一种国际公认的“三致三致”物质物质致癌、致突变、致畸。致癌、致突变、致畸。v根据国家根据国家 化妆品卫生规范化妆品卫生规范(2007年版年版)规定，规定，间苯二胺在染发剂中是禁用的。间苯二胺在染发剂中是禁用的。例：特殊用途化妆品的例：特殊用途化妆品的Ames试验试验v染发剂：长期使用、职业接触会导致多发性骨髓瘤、染发剂：长期使用、职业接触会导致多发性骨髓瘤、膀胱癌的发生；膀胱癌的发生；v王润洁：报导王润洁：报导2例因长

18、期使用染发剂染发诱发再生例因长期使用染发剂染发诱发再生障碍性贫血，分别死于脑出血和败血症；障碍性贫血，分别死于脑出血和败血症；v检验类型：检验类型：2004-2006年，进口及国产染发、育发、年，进口及国产染发、育发、美乳及健美四种；美乳及健美四种；v数量：数量：237份；份；v目的：研究其致突变的潜在危害性。目的：研究其致突变的潜在危害性。国产及进口染发剂的国产及进口染发剂的Ames试验比较试验比较小心：氧化型的染发剂小心：氧化型的染发剂能引起能引起Ames试验阳性的均为试验阳性的均为氧化型氧化型染发剂，其染发剂，其中绝大多数是中绝大多数是彩色染发剂彩色染发剂。2.微核试验微核试验v微核微核

19、(micronucleus)又称豪又称豪-杰氏小体杰氏小体(Ho-well-Jolly bodies)是染色体或染色单体的是染色体或染色单体的无着丝点断片无着丝点断片或或纺锤丝纺锤丝受损而丢失的整个染色体受损而丢失的整个染色体，在细胞有丝分裂后期滞，在细胞有丝分裂后期滞留在细胞质中的颗粒。留在细胞质中的颗粒。其大小为细胞直径的其大小为细胞直径的1/201/5，呈，呈圆形圆形或或杏仁状杏仁状，着色与细胞核一致。着色与细胞核一致。v微核试验即观察外源化学物能否使细胞产生微核微核试验即观察外源化学物能否使细胞产生微核的试验。的试验。v观察的遗传学终点观察的遗传学终点 染色体完整性改变染色体完整性改变

20、 染色体分离改变染色体分离改变微核试验的概念微核试验的概念v多染红细胞多染红细胞(polychromatic erythrocytes，PCE)是晚是晚幼红细胞最后一次分裂时，排出主核而幼红细胞最后一次分裂时，排出主核而未成熟未成熟的红的红细胞（细胞（灰蓝色灰蓝色）v正染红细胞正染红细胞(normochromatic erythrocytes，NCE)是是排出主核后排出主核后成熟成熟的红细胞（的红细胞（粉红色粉红色）试验材料试验材料v动物动物 小鼠小鼠712 周龄，体重周龄，体重2030g。v药物药物 环磷酰胺（阳性对照）、药物环磷酰胺（阳性对照）、药物1/2-1/30 LD50v剂量剂量v环

21、磷酰胺生理盐水溶液，环磷酰胺生理盐水溶液，2次腹腔注射，次腹腔注射，50mg/kg，间隔，间隔24h，第，第2次注射后次注射后6小时取材小时取材v环磷酰胺水溶液，环磷酰胺水溶液，80120mg/kg，经口染毒，经口染毒2次，间隔次，间隔24h操作步骤（操作步骤（1）v骨髓细胞液的制备骨髓细胞液的制备 在第在第2次给与受试物次给与受试物6h后，小后，小鼠脱颈椎处死，取鼠脱颈椎处死，取胸骨胸骨，用滤纸或纱布擦干血污，用滤纸或纱布擦干血污和肌肉和肌肉v涂片涂片 在洁净的玻片滴小牛血清在洁净的玻片滴小牛血清1滴，剪去骨骺，滴，剪去骨骺，用止血钳将骨髓挤到血清中，混匀，推片，干燥用止血钳将骨髓挤到血清中

22、，混匀，推片，干燥v固定固定 将干燥的涂片置甲醇液中固定将干燥的涂片置甲醇液中固定510 min，取，取出晾干出晾干 v染色染色 固定好的图片用固定好的图片用1 10的吉姆萨的吉姆萨-磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液（pH6.4）染色）染色1530min，蒸馏水冲洗，干燥，蒸馏水冲洗，干燥v镜检镜检 先用低、高倍镜粗检，选择细胞完整、分布均先用低、高倍镜粗检，选择细胞完整、分布均匀和染色好的区域，再以油镜检查计数匀和染色好的区域，再以油镜检查计数 制片优劣判断标准制片优劣判断标准 细胞形态完好，嗜多染红细胞细胞形态完好，嗜多染红细胞（PCE）呈灰蓝色，成熟的正染红细胞（）呈灰蓝色，成熟的正染红细胞（N

23、CE）呈）呈粉红粉红色或桔黄色。色或桔黄色。操作步骤（操作步骤（2）v计数计数 每只动物计数每只动物计数1000个个PCE，并计算含微核的，并计算含微核的PCE数，以千分率表示。数，以千分率表示。在一个在一个PCE中有中有2个或个或多个微核，仍按一个微核细胞计算。多个微核，仍按一个微核细胞计算。v在计数在计数PCE时，同时计数见到的时，同时计数见到的NCE，求，求PCE/NCE。操作步骤（操作步骤（3）结果分析与评价结果分析与评价v每组分别计算雌、雄动物微核每组分别计算雌、雄动物微核PCE的均值，与的均值，与对照组比较。对照组比较。v正常正常PCE/NCE约为约为1（正常范围（正常范围0.61

24、.2），如比），如比值小于值小于0.1，表示，表示PCE形成受到严重抑制；如比形成受到严重抑制；如比值小于值小于0.05，表示受试物剂量过大，实验结果不，表示受试物剂量过大，实验结果不可靠。可靠。PCENCE微核试验的不足微核试验的不足v有些化学物在骨髓中有些化学物在骨髓中难以达到损害浓度难以达到损害浓度v在在肝脏活化肝脏活化的中间产物可能在到达骨髓前的中间产物可能在到达骨髓前消失消失v骨髓中骨髓中PCE处于处于动态平衡动态平衡v一般观察一般观察体细胞体细胞，其结果外推至其他组织应，其结果外推至其他组织应慎重慎重机动车尾气对小鼠骨髓细胞机动车尾气对小鼠骨髓细胞的致突变性研究的致突变性研究v目的

25、目的：探讨机动车尾气对小鼠骨髓细胞的致突变性。：探讨机动车尾气对小鼠骨髓细胞的致突变性。v方法方法：健康昆明种小鼠：健康昆明种小鼠40只随机分只随机分4组，雌雄各半。组，雌雄各半。通过自制动式染毒装置将小鼠分别在新鲜空气、通过自制动式染毒装置将小鼠分别在新鲜空气、1：15、1：10、1：5不同浓度的机动车尾气中暴露，连不同浓度的机动车尾气中暴露，连续续5天，每天天，每天1小时。测定小鼠骨髓嗜多染红细胞小时。测定小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)中的微核率的变化。中的微核率的变化。v结果结果：染毒浓度与小鼠骨髓细胞微核率存在一定的：染毒浓度与小鼠骨髓细胞微核率存在一定的剂量反应关系。剂量反应关系。v

26、结论结论：机动车尾气对小鼠骨髓细胞有致突变作用。：机动车尾气对小鼠骨髓细胞有致突变作用。结论结论v骨髓细胞微核率骨髓细胞微核率：存在一定的剂量反应关系。：存在一定的剂量反应关系。v表明：机动车尾气中存在着某种能致突变的污染表明：机动车尾气中存在着某种能致突变的污染物，具有较强的致突变作用。物，具有较强的致突变作用。v动物或人：长期在高浓度机动车尾气污染的大气动物或人：长期在高浓度机动车尾气污染的大气环境中，将会导致不良的遗传学效应。环境中，将会导致不良的遗传学效应。v小孩：在机动车多的地方要抱起来。小孩：在机动车多的地方要抱起来。3.小鼠精子畸形试验小鼠精子畸形试验 精子畸形试验是检测受试化学

27、毒物能否破坏哺精子畸形试验是检测受试化学毒物能否破坏哺乳动物乳动物精子正常形态精子正常形态的实验方法。的实验方法。v适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的遗传毒性；可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的遗传毒性；v检验对象：食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、检验对象：食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留

28、、食品工业用微生物等。洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。试验材料试验材料v动物动物 小鼠小鼠68 周龄，体重周龄，体重2535g。v药物药物 环磷酰胺（阳性对照）、药物可采用环磷酰胺（阳性对照）、药物可采用LD50的的1/2-1/10倍剂量倍剂量v剂量剂量v环磷酰胺环磷酰胺40 mg/kg腹腔注射，每天腹腔注射，每天1次，连次，连续续5天天操作步骤操作步骤v在第在第1次染毒后第次染毒后第7，28，70天，处死小鼠检查精天，处死小鼠检查精子形态。子形态。v各种致突变物作用于精子的不同发育阶段，可在各种致突变物作用于精子的不同发育阶段，可在接触某种致突变物后接触某种致突变物后

29、不同时间不同时间出现精子畸形。出现精子畸形。v精子畸形：主要在精子畸形：主要在头部头部，其次为，其次为尾部尾部。畸形类型。畸形类型可分为胖头、无定形、双头、尾折叠、双尾、无可分为胖头、无定形、双头、尾折叠、双尾、无钩、香蕉形等。钩、香蕉形等。正常人精子形态正常人精子形态阅片注意事项阅片注意事项v分别记录分别记录异常类型异常类型，以便统计精子畸形率及精子，以便统计精子畸形率及精子畸形类型的构成比。畸形类型的构成比。v判断双头、双尾畸形时，要注意与二条精子的部判断双头、双尾畸形时，要注意与二条精子的部分重叠相鉴别，判断无定形时要与人为剪碎及折分重叠相鉴别，判断无定形时要与人为剪碎及折叠相鉴别。叠相

30、鉴别。v使用的小鼠要健康，以免感染、体温增高等可能使用的小鼠要健康，以免感染、体温增高等可能导致精子畸形率增高的因素造成假阳性结果。导致精子畸形率增高的因素造成假阳性结果。结果分析与评价结果分析与评价v计算精子畸形发射率，与阴性对照组比较，畸形计算精子畸形发射率，与阴性对照组比较，畸形率至少为阴性对照组的率至少为阴性对照组的倍量倍量或或经统计有显著意义经统计有显著意义，并有并有剂量反应关系剂量反应关系。v一般阴性对照组的精子异常率为一般阴性对照组的精子异常率为0.83.4。丙烯腈对大、小鼠精子形成影响的研究丙烯腈对大、小鼠精子形成影响的研究 v丙烯腈丙烯腈(acrylonitrile,ACN)

31、是制造腈纶纤维、丁腈是制造腈纶纤维、丁腈橡胶和合成树脂等的重要有机合成单体，用途极广。橡胶和合成树脂等的重要有机合成单体，用途极广。v随着石油化工、化纤工业的迅猛发展，接触随着石油化工、化纤工业的迅猛发展，接触ACN的的人群日益增多。人群日益增多。v长期接触长期接触ACN工人中肿瘤，特别是肺癌发生的危险工人中肿瘤，特别是肺癌发生的危险度增高。度增高。vACN对大鼠具有对大鼠具有致癌致癌作用作用 v昆明小鼠雄性昆明小鼠雄性230只，随机分为只，随机分为5组；组；vACN灌胃染毒，蒸馏水作溶剂，共染毒灌胃染毒，蒸馏水作溶剂，共染毒5 d，剂量，剂量分别为分别为0、6、12、24 mg/kg，同时设

32、阳性对照组。，同时设阳性对照组。v分别于染毒后分别于染毒后1、2、3、4、5周处死动物，作精子周处死动物，作精子畸形实验；畸形实验；v阳性对照物选用环磷酰胺阳性对照物选用环磷酰胺(CTX)，剂量为，剂量为40 mg/kg，于第于第5周后周后1次腹腔注射。次腹腔注射。丙烯腈对大、小鼠精子形成影响的研究丙烯腈对大、小鼠精子形成影响的研究 vWistar雄性大鼠雄性大鼠，雄性，雄性58只；只；v平均体重平均体重(189.215.3)g，随机分为，随机分为4组；组；v蒸馏水作溶剂，蒸馏水作溶剂，ACN灌胃染毒，每天灌胃染毒，每天1次，每周次，每周5天，连续染毒天，连续染毒13周。周。v剂量分别为剂量分

33、别为0、5、10、20 mg/kg。丙烯腈对大、小鼠精子形成影响的研究丙烯腈对大、小鼠精子形成影响的研究 试验结果（试验结果（1）v小鼠精子畸形率小鼠精子畸形率 2周后，周后，24 mg/kg组精子畸形率已明显高于对组精子畸形率已明显高于对照组；照组；3周后，周后，12 mg/kg组也有影响；组也有影响；5周后，周后，12 mg/kg与与24 mg/kg组精子畸形率明组精子畸形率明显高于对照组，差异均有非常显著性显高于对照组，差异均有非常显著性(P0.01)。畸形种类以头部畸形为主，主要有不定形、无钩畸形种类以头部畸形为主，主要有不定形、无钩和香蕉形。和香蕉形。试验结果（试验结果（2）v大鼠精

34、子畸形率大鼠精子畸形率 20 mg/kg时，附睾尾精子数明显低于对照组；时，附睾尾精子数明显低于对照组；10 mg/kg时，活精率就明显低于对照组，且有时，活精率就明显低于对照组，且有剂量剂量-效应关系；效应关系；所有实验组精子头部畸形率与尾部畸形率均明所有实验组精子头部畸形率与尾部畸形率均明显高于对照组，并呈上升趋势。显高于对照组，并呈上升趋势。结论结论vACN对睾丸有毒性，对精子发育的各阶段均有不对睾丸有毒性，对精子发育的各阶段均有不同程度的影响，尤以同程度的影响，尤以精子细胞变态发育成精子精子细胞变态发育成精子这这一阶段对一阶段对ACN毒性最敏感。毒性最敏感。v原因：可能是原因：可能是A

35、CN和和CEO对生精细胞中遗传物质对生精细胞中遗传物质有烷化作用，而精子细胞与成熟精子有烷化作用，而精子细胞与成熟精子无无DNA修复修复能力能力，即使轻度损伤，亦易表现出来。，即使轻度损伤，亦易表现出来。v在对接触在对接触ACN的男工进行的男工进行流行病学流行病学调查，评价其调查，评价其生殖毒性时，有一定的价值。生殖毒性时，有一定的价值。4.显性致死试验显性致死试验v显性致死显性致死(dominant lethal)指哺乳动物生殖细胞指哺乳动物生殖细胞染染色体发生结构和数目改变色体发生结构和数目改变，导致受精卵在着床前死，导致受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡。亡和胚胎早期死亡。v显性致死试验以

36、显性致死试验以胚胎死亡胚胎死亡为观察终点，用于检测哺为观察终点，用于检测哺乳动物乳动物生殖细胞遗传性损伤生殖细胞遗传性损伤。显性致死试验试验设计显性致死试验试验设计v实验动物实验动物 小鼠小鼠3035g 大鼠大鼠200300gv染毒染毒 一次、一次、57d、30dv交配交配 :=1:1或或1:2 同笼同笼1周，第周，第2周更换另一批，周更换另一批，小鼠连续小鼠连续68批，大鼠批，大鼠812批批v检查受精情况检查受精情况 涂片镜检或检查阴栓，以检查出涂片镜检或检查阴栓，以检查出阴栓的时间为妊娠第阴栓的时间为妊娠第0天天v剖杀剖杀 小鼠妊娠第小鼠妊娠第14d，大鼠第，大鼠第16dv检查检查着床数、

37、早死胎、晚死胎、活胎数着床数、早死胎、晚死胎、活胎数 显性致死试验结果分析显性致死试验结果分析 受孕雌性动物数受孕雌性动物数受孕率受孕率=100%交配雌性动物总数交配雌性动物总数 着床胚胎总数着床胚胎总数平均着床数平均着床数=受孕雌性动物总数受孕雌性动物总数 早期胚胎死亡数早期胚胎死亡数平均早期死亡胚胎数平均早期死亡胚胎数=受孕雌性动物总数受孕雌性动物总数 显性致死试验结果评价显性致死试验结果评价v阳性阳性v有剂量有剂量-反应关系反应关系v至少在一个剂量水平上出现可重复的并具有统至少在一个剂量水平上出现可重复的并具有统计学意义的增高计学意义的增高v阴性阴性v不具有剂量不具有剂量-反应关系反应关

38、系v在任何剂量水平上没有可重复的并具有统计学在任何剂量水平上没有可重复的并具有统计学意义的增高意义的增高5.染色体畸变分析染色体畸变分析v染色体畸变分析染色体畸变分析(chromosome aberration analysis)是将观察细胞停留在分裂中期相，在显微镜下观是将观察细胞停留在分裂中期相，在显微镜下观察察染色体畸变染色体畸变和和染色体分离异常染色体分离异常现象。现象。配套组合实例配套组合实例vAmes试验试验 DNA碱基序列改变碱基序列改变v小鼠微核试验小鼠微核试验 染色体完整改变和分离改变染色体完整改变和分离改变v细菌细菌DNA修复试验修复试验 DNA完整性完整性v姐妹染色单体交

39、换试验（姐妹染色单体交换试验（SCE）染色体完整性改变染色体完整性改变和和DNA重排或交换重排或交换第二节第二节 生殖发育毒性试验生殖发育毒性试验v（一）基本概念（一）基本概念v（二）生殖发育毒性试验及评价（二）生殖发育毒性试验及评价v生殖毒性生殖毒性(reproduction toxicity)指化学物对指化学物对生殖系统生殖系统产生的不良效应。产生的不良效应。v生育力和一般生殖行为生育力和一般生殖行为v致畸形致畸形v对怀孕后期和哺乳的影响对怀孕后期和哺乳的影响发育毒性发育毒性：指：指出生前出生前经父体和经父体和/或母体接触外源性理化因素或母体接触外源性理化因素引起的在引起的在子代子代到达到

40、达成体之前成体之前内出现的有害作用。内出现的有害作用。包括：包括：结构畸形结构畸形 生长迟缓生长迟缓 功能障碍功能障碍 死亡死亡（一）基本概念（一）基本概念畸形畸形：指指出生前因素出生前因素引起发育生物体的严重的解引起发育生物体的严重的解剖学上剖学上形态结构形态结构的缺陷的缺陷(异常异常)对发育、生长、生理功能、生育力和对发育、生长、生理功能、生育力和（或）寿命可产生有（或）寿命可产生有害影响害影响 可以存活也可能不能存活可以存活也可能不能存活致畸性和致畸作用：致畸性和致畸作用：均指在均指在妊娠期（出生前）妊娠期（出生前）接接触外源性理化因素引起触外源性理化因素引起后代结构畸形后代结构畸形的特

41、性或作的特性或作用用 致畸作用所表现的形态结构异常，在出生后立即致畸作用所表现的形态结构异常，在出生后立即可被发现可被发现（一）基本概念（一）基本概念致畸物：致畸物：凡在一定剂量下，能通过母体对凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎胚胎或或胎儿胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化学物称为畸形的化学物称为致畸物致畸物或或致畸原致畸原。畸胎：畸胎：具有畸形的胚胎或胎仔具有畸形的胚胎或胎仔（一）基本概念（一）基本概念致畸作用因素致畸作用因素两者的交互作用两者的交互作用遗传因素遗传因素环境因素环境因素物理因素物理因素化学因素化学因素生物因素生物因素弓行体：

42、弓行体：猫猫风疹病毒风疹病毒 巨细胞病毒巨细胞病毒单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒 紫外线紫外线/X线线热辐射热辐射龋齿：口腔和舌癌龋齿：口腔和舌癌 放射性：白血病和皮肤放射性：白血病和皮肤癌癌（广岛、长崎（广岛、长崎）先天性心脏畸形先天性心脏畸形3535先天性巨结肠先天性巨结肠8080脊柱裂脊柱裂6060无脑儿无脑儿6060先天性髋关节脱位先天性髋关节脱位7070腭裂腭裂7676先天性幽门狭窄先天性幽门狭窄7575遗传度（遗传度（%）畸形类型畸形类型致畸毒性特点致畸毒性特点 1.有作用敏感期有作用敏感期 2.致畸作用存在致畸作用存在 显著的种属差显著的种属差 异和个体差异异和个体差异 3.剂量剂量效

43、应效应 （反应）关系（反应）关系 复杂复杂 器官发生前期器官发生期（胚胎期）胎儿期1364521211109873820 中枢神经系统心耳眼上肢下肢唇牙腭致畸敏感度高致畸敏感度高致畸敏感度低致畸敏感度低外生殖器致畸作用带致畸作用带0100发生率（发生率（%）致畸率致畸率死亡率死亡率致畸作用带致畸作用带剂量剂量小小大大发育毒性机制发育毒性机制v 基因突变和染色体畸变基因突变和染色体畸变 v 干扰干扰DNA合成和有丝分裂合成和有丝分裂v 干扰营养干扰营养v 细胞毒性作用细胞毒性作用(膜损伤膜损伤)v 性激素代谢干扰性激素代谢干扰v 诱导氧自由基（活性氧）诱导氧自由基（活性氧）v 非特异性发育毒性非

44、特异性发育毒性 v 干扰母体和胎盘的正常结构和功能干扰母体和胎盘的正常结构和功能 （二）生殖发育毒性试验及评价（二）生殖发育毒性试验及评价v1.三段生殖毒性试验三段生殖毒性试验 （1）一般生殖毒性试验）一般生殖毒性试验 （2）致畸试验）致畸试验 （3）围产期试验）围产期试验v2.繁殖试验繁殖试验v3.体外试验体外试验v分别在分别在3个不同阶段给予受试物。个不同阶段给予受试物。vI段试验：即段试验：即一般生殖毒性试验一般生殖毒性试验，在，在妊娠妊娠（shn）前期及初期前期及初期给予受试物；给予受试物；vII段试验：即段试验：即致畸试验致畸试验，在，在器官形成期器官形成期给予；给予；vIII段试验

45、：即段试验：即围产期试验围产期试验，在，在围产期及授乳期围产期及授乳期给予。给予。vI、II段试验与传统的繁殖试验和传统的致畸基本相段试验与传统的繁殖试验和传统的致畸基本相似，似，III段试验是观察化合物对胎儿出生后发育的影段试验是观察化合物对胎儿出生后发育的影响。响。1.三段生殖毒性试验三段生殖毒性试验大鼠大鼠（1）一般生殖毒性试验）一般生殖毒性试验目的目的：评价化学物对配子成熟、交配行为、受孕能：评价化学物对配子成熟、交配行为、受孕能力、胚胎着床前和着床的影响力、胚胎着床前和着床的影响v方法方法 v动物动物 初成年、未交配、健康有生育能力的初成年、未交配、健康有生育能力的雌雄大鼠各雌雄大鼠

46、各20只只/组组v剂量剂量 高剂量有轻度毒性反应高剂量有轻度毒性反应 低剂量稍高于药效剂量低剂量稍高于药效剂量 中剂量按对等比级差中剂量按对等比级差v处理处理v雌鼠染毒雌鼠染毒14d，雄鼠，雄鼠60dv受孕后受孕后20d处死处死v检查项目检查项目v黄体数、着床数、吸收胎、死胎数、畸胎数、黄体数、着床数、吸收胎、死胎数、畸胎数、活胎数活胎数v受精率、妊娠率、着床前、后的死亡率受精率、妊娠率、着床前、后的死亡率（1）一般生殖毒性试验）一般生殖毒性试验 着床前死亡率着床前死亡率=100%着床后死亡率着床后死亡率=100%吸收胎吸收胎着床数着床数黄体数黄体数着床数着床数黄体数黄体数（1）一般生殖毒性试

47、验）一般生殖毒性试验v结果评定结果评定（2）致畸试验）致畸试验v致畸试验致畸试验(teratology test)评价外源化学物的胚评价外源化学物的胚胎胎-胎儿毒性和致畸性所进行的试验。胎儿毒性和致畸性所进行的试验。v目的目的v确定受试物确定受试物是否有致畸是否有致畸作用作用v确定受试物诱发确定受试物诱发何种畸形何种畸形即出现畸形的主即出现畸形的主要要器官器官v确定确定最大无致畸作用剂量最大无致畸作用剂量和和致畸阈剂量致畸阈剂量v剂量剂量 原则：既求出原则：既求出NOEL和和MEL，又保持母体生育能力，又保持母体生育能力，避免大批流产和过多胚胎死亡。避免大批流产和过多胚胎死亡。v最高剂量最高剂

48、量 引起母体引起母体轻度中毒轻度中毒v中间剂量中间剂量 母体出现某些较轻的中毒症状，母体出现某些较轻的中毒症状，与高低剂量等比与高低剂量等比v最低剂量最低剂量 不应观察到任何中毒症状不应观察到任何中毒症状v对照组对照组 阳性、阴性或溶剂对照阳性、阴性或溶剂对照（2）致畸试验）致畸试验v接毒接毒 受孕动物在受孕动物在器官发生期器官发生期（大鼠（大鼠716 d，小鼠小鼠615 d），雄性动物不给受试物），雄性动物不给受试物v处死处死 大鼠受孕后大鼠受孕后1920 d，即自然分娩前，即自然分娩前12 d。注意：各剂量组与对照组动物注意：各剂量组与对照组动物处死时间应一致处死时间应一致，因胎仔在临床出

49、生前发育极为迅速，特别是骨因胎仔在临床出生前发育极为迅速，特别是骨骼。骼。v动物数动物数 每组至少存活每组至少存活20只怀孕动物。只怀孕动物。（2）致畸试验）致畸试验v检查项目检查项目子宫子宫 活产胎仔、死胎、吸收胎活产胎仔、死胎、吸收胎卵巢卵巢 黄体数黄体数活产胎仔活产胎仔 性别、逐只称重，并按窝计算平均性别、逐只称重，并按窝计算平均体重体重 胎仔畸形检查胎仔畸形检查v外观畸形外观畸形 脑露、无尾、短肢等脑露、无尾、短肢等v内脏及软组织畸形内脏及软组织畸形v骨骼畸形骨骼畸形（2）致畸试验）致畸试验v检查项目检查项目胎仔内脏检查胎仔内脏检查 胎仔用固定液固定胎仔用固定液固定2周以上，肉眼和解剖

50、镜观周以上，肉眼和解剖镜观察。察。胎仔骨骼检查胎仔骨骼检查 胎仔用胎仔用80%酒精固定、酒精固定、KOH溶液处理、透明、溶液处理、透明、染色后观察染色后观察。（2）致畸试验）致畸试验v结果评定结果评定计算畸胎总数和畸形总数：计算畸胎总数和畸形总数：畸形总数畸形总数活产胎仔平均畸形出现数活产胎仔平均畸形出现数=活产仔总数活产仔总数 出现畸形的胎仔总数出现畸形的胎仔总数畸胎出现率畸胎出现率=100%活产仔总数活产仔总数（2）致畸试验）致畸试验 出现畸胎的母体数出现畸胎的母体数 母体畸胎出现率母体畸胎出现率=100%妊娠母体数妊娠母体数 雌鼠雌鼠LD50 致畸指数致畸指数=最小致畸剂量最小致畸剂量v