最新3-农业基因工程汇总课件.ppt
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1、3-农业基因工程第一节第一节 基因工程的物质基础基因工程的物质基础一、基因工程的诞生一、基因工程的诞生二、基因工程的含义二、基因工程的含义三、基因工程工具酶三、基因工程工具酶 四、基因工程载体四、基因工程载体 一、基因工程的诞生一、基因工程的诞生理论基础:理论基础:三大发现三大发现20C40S,基因载体是,基因载体是DNA 遗传物质基础问题;遗传物质基础问题;20C50S,DNA双螺旋结构和半保留复制双螺旋结构和半保留复制 基因的自我复制和传递问题;基因的自我复制和传递问题;20C50-60S,中心法则和操纵子学说,中心法则和操纵子学说 遗传信息的流向和表达问题。遗传信息的流向和表达问题。技术
2、基础:三大发明技术基础:三大发明工具酶工具酶载体载体反转录酶反转录酶二、基因工程的含义二、基因工程的含义基因工程(基因工程(gene engineering)指将某种生物的基因经过体外修饰指将某种生物的基因经过体外修饰或直接导入另一种生物细胞或个体,从或直接导入另一种生物细胞或个体,从而改变生物的遗传性状或创造新的生物而改变生物的遗传性状或创造新的生物类型。类型。这种人为在遗传物质的分子水平上这种人为在遗传物质的分子水平上改造和设计生物的结构和功能的生物技改造和设计生物的结构和功能的生物技术,就是所谓的术,就是所谓的基因工程基因工程,也称,也称DNA重重组技术组技术。基因工程的优势基因工程的优
3、势生物技术的核心技术生物技术的核心技术基因交换不受生物物种亲缘关系的限制。基因交换不受生物物种亲缘关系的限制。生物基因可在人、动物、植物和微生物基因可在人、动物、植物和微生物四大系统间进行交换,人类可以构生物四大系统间进行交换,人类可以构思并创造出世界上前所未有的生物新类思并创造出世界上前所未有的生物新类型。型。三、基因工程工具酶三、基因工程工具酶基因工程操作需要在分子水平上对基因工程操作需要在分子水平上对DNA分子进行剪接、重组和转运,需要借助分子进行剪接、重组和转运,需要借助一些工具。一些工具。1、限制性内切酶、限制性内切酶 2、DNA连接酶连接酶 3、DNA聚合酶聚合酶 4、反转录酶、反
4、转录酶 1、限制性内切酶、限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶就是一类能够识别双链就是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列,并由此切分子中某种特定核苷酸序列,并由此切割割DNA双链结构的酶。双链结构的酶。1970,Smith和和Wilcox,Hind 1972,Boyer,EcoR300种微生物种微生物500种限制性内切酶种限制性内切酶基因体外分析研究基因体外分析研究人工重组。人工重组。2、DNA连接酶连接酶作用:能把不同作用:能把不同DNA片段结合到一起。片段结合到一起。1967,首次发现,但活性不高,首次发现,但活性不高1970,Khorana,T4 DNA连接酶,高活性连接酶,
5、高活性 3、DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶能以单链能以单链DNA为模板合成互为模板合成互补的补的DNA链。链。TaqDNA聚合酶:耐高温,聚合酶:耐高温,70以上合成以上合成DNA。这为体外人工大量复制目标这为体外人工大量复制目标DNA片段提供片段提供了极大的方便。了极大的方便。4、反转录酶、反转录酶反转录酶反转录酶也是一种也是一种DNA聚合酶,但它不是聚合酶,但它不是以以DNA为模板,而是以为模板,而是以mRNA为模板进为模板进行行DNA的合成。的合成。由于这一过程正好与由于这一过程正好与mRNA的转录过程相的转录过程相反,故而称为反转录酶。反,故而称为反转录酶。反转录酶使得基因工程学
6、家们能通过细胞反转录酶使得基因工程学家们能通过细胞质中的质中的mRNA来认识和分离目标基因。来认识和分离目标基因。1970,Baltimore和和Temin,各自发现。,各自发现。四、基因工程载体四、基因工程载体载体:载体:将外源将外源DNA携带进入宿主细胞的运携带进入宿主细胞的运载工具。载工具。基因载体的基因载体的实质实质:一类小型的一类小型的DNA分子分子。其作用:其作用:将目的基因转移到受体细胞,并将目的基因转移到受体细胞,并使其在受体细胞中得到转录和表达。使其在受体细胞中得到转录和表达。1946,Lederberg,细菌,细菌F因子因子1973,Cohen,首次将质粒作为基因载体。,首
7、次将质粒作为基因载体。理想载体的特点理想载体的特点自我复制能力;自我复制能力;大小要适度,能从外部进入细胞;大小要适度,能从外部进入细胞;稳定安全可靠,不易降解;稳定安全可靠,不易降解;要有遗传标记和选择性的识别标记。要有遗传标记和选择性的识别标记。载体的分类载体的分类(1)根据克隆外源)根据克隆外源DNA的方式:的方式:插入型载体插入型载体:指在载体的克隆位点上用限制性内切酶酶:指在载体的克隆位点上用限制性内切酶酶切后,将外源切后,将外源DNA插入,再用连接酶连接。绝大多数插入,再用连接酶连接。绝大多数的载体都属于此类。的载体都属于此类。置换型载体置换型载体:指载体的某一片段用限制性内切酶切
8、除,:指载体的某一片段用限制性内切酶切除,代之以外源代之以外源DNA片段。噬菌体属于此类。片段。噬菌体属于此类。(2)根据载体的用途:)根据载体的用途:克隆载体克隆载体:指克隆了外源:指克隆了外源DNA后,转入宿主细胞中进行后,转入宿主细胞中进行增殖,使克隆的增殖,使克隆的DNA片段在数量上大大扩增。片段在数量上大大扩增。表达载体表达载体:将外源:将外源DNA在宿主细胞中表达产生蛋白质。在宿主细胞中表达产生蛋白质。常用基因载体常用基因载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒转座子转座子人工载体人工载体质粒质粒质粒是独立与染色体之外的能自主复制的质粒是独立与染色体之外的能自主复制的双链环状双链环状DNA
9、分子,也叫分子,也叫“核外遗传体核外遗传体或核外染色体或核外染色体”。质粒所携带外源质粒所携带外源DNA片段比较片段比较小小(10Kb)。Ti质粒:高等植物基因工程常用。质粒:高等植物基因工程常用。噬菌体噬菌体噬菌体所能负载的噬菌体所能负载的DNA片段较大。片段较大。噬菌体:双链线性噬菌体:双链线性DNA。原核生物常用。原核生物常用。病毒病毒SV40(猿猴病毒),双链环状(猿猴病毒),双链环状DNA广泛应用:广泛应用:微生物微生物和和哺乳动物体细胞哺乳动物体细胞基因工程。基因工程。转座子转座子能在基因组中频繁转移,主要成分也都是能在基因组中频繁转移,主要成分也都是不同的不同的DNA。人工载体人
10、工载体YAC(酵母人工染色体)(酵母人工染色体)Yeast artificial chromosomeBAC(细菌人工染色体)(细菌人工染色体)Bacterial artificial chromosomeMAC(哺乳动物人工染色体)(哺乳动物人工染色体)Mammalian artificial chromosome第二节第二节 基因工程操作程序基因工程操作程序一般包括一般包括5个步骤:个步骤:一、目的基因的获得;一、目的基因的获得;二、目的基因与基因载体的体外重组;二、目的基因与基因载体的体外重组;三、重组三、重组DNA分子的转化;分子的转化;四、转化细胞的筛选;四、转化细胞的筛选;五、目的
11、基因表达的检测。五、目的基因表达的检测。基因转化操作过程 一、目的基因的获得一、目的基因的获得目的基因目的基因:在基因工程操作中所需要的某:在基因工程操作中所需要的某些些DNA分子的片段。分子的片段。它含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。它含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。目的基因获得方法:目的基因获得方法:人工合成法、人工合成法、cDNA法、法、PCR法、法、基因文库筛选法等。基因文库筛选法等。1、人工合成法、人工合成法核苷酸核苷酸 酶酶 目的基因目的基因注:该法合成目的基因较小。注:该法合成目的基因较小。2、cDNA法法特定基因特定基因 分离分离mRNA反转录酶反转录酶 G、C、T、
12、A单链单链cDNA目的基因目的基因 3、PCR法法前提前提:已知序列:已知序列方法方法:多聚酶链式反应(:多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)程序程序:通过:通过DNA模板高温变性、模板与引模板高温变性、模板与引物的低温退火及引物的中温延伸物的低温退火及引物的中温延伸3个阶个阶段的多次循环,就可以扩增得到目的段的多次循环,就可以扩增得到目的DNA序列。序列。4、基因文库筛选法、基因文库筛选法基因文库就是保存某个物种完整基因组遗基因文库就是保存某个物种完整基因组遗传信息的不同传信息的不同DNA片段的总称。片段的总称。前提:前提:核酸序列未知核酸序列未知程序
13、:程序:蛋白质纯化蛋白质纯化测定部分氨基酸的测定部分氨基酸的顺序顺序合成合成DNA探针探针从基因文库从基因文库中筛选中筛选目的基因。目的基因。原理:原理:中心法则中心法则 二、体外重组二、体外重组载体载体+目的基因目的基因 重组重组DNA(基因工程最重要的环节基因工程最重要的环节)1、选择适合的基因载体、选择适合的基因载体2、载体酶切(限制内切酶)、载体酶切(限制内切酶)3、目的基因与载体、目的基因与载体DNA 连接(连接(DNA连接连接酶)酶)4、重组、重组DNA分子获得分子获得三、重组三、重组DNA分子的转化分子的转化将重组的将重组的DNA杂合分子,向选定的生物受杂合分子,向选定的生物受体
14、细胞(或叫宿主细胞、寄主细胞)中体细胞(或叫宿主细胞、寄主细胞)中转移,让重组的转移,让重组的DNA杂合子在受体细胞杂合子在受体细胞中自主复制、转录、翻译得以表达。中自主复制、转录、翻译得以表达。常用常用大肠杆菌大肠杆菌作为宿主细胞。作为宿主细胞。常用转化方法(1)Ti质粒介导法质粒介导法(2)电击法)电击法(3)微注射法)微注射法(4)基因枪法)基因枪法(1)Ti质粒介导法 基因载体:基因载体:农杆菌农杆菌Ti质粒质粒。优点:优点:转化再生率高转化再生率高最常用的方法。最常用的方法。(2)电击法 瞬间电脉冲瞬间电脉冲刺激细胞膜刺激细胞膜小孔小孔 重重组组DNA分子进入细胞的分子进入细胞的通道
15、通道。电脉冲强度电脉冲强度孔径孔径大小大小和和数量数量 DNA进入细胞的进入细胞的速度速度和和难易难易。(3)微注射法 毛细管针毛细管针显微操作显微操作注射外源基因注射外源基因细胞。细胞。优点:准确性高优点:准确性高缺点:技术性高,处理效率低缺点:技术性高,处理效率低(4)基因枪法 特制特制“基因枪基因枪”外源基因外源基因+金属微粒金属微粒=“微型弹微型弹”射入受体细胞。射入受体细胞。优点:批量处理,效率高;优点:批量处理,效率高;缺点:装置昂贵。缺点:装置昂贵。提高转化率的方法(1)多聚氨基酸法)多聚氨基酸法(2)磷酸钙)磷酸钙DNA共沉淀法共沉淀法(3)脂质体法)脂质体法(1)多聚氨基酸法
16、 多聚氨基酸多聚氨基酸+重组重组DNA分子分子DNA多聚氨基酸复合分子多聚氨基酸复合分子 常用:多聚常用:多聚-L-鸟氨酸鸟氨酸 多聚多聚-L-赖氨酸赖氨酸该结构:该结构:保护外源基因免受核酸酶的降保护外源基因免受核酸酶的降解。解。刺激宿主细胞提高其摄入能力。刺激宿主细胞提高其摄入能力。(2)磷酸钙DNA共沉淀法 D重组重组NA分子分子+磷酸钙磷酸钙磷酸钙磷酸钙-DNA复合体复合体(沉淀状)(沉淀状)作用:同上法。作用:同上法。(3)脂质体法 重组重组DNA悬浮液悬浮液+10%矿物油或橄榄油矿物油或橄榄油 剧烈振荡剧烈振荡 包膜包膜脂质体脂质体(内裹(内裹DNA分子)分子)稳定性好,对核酸酶具
17、有较好的抗性。稳定性好,对核酸酶具有较好的抗性。四、转化细胞的筛选四、转化细胞的筛选转化处理受体细胞转化处理受体细胞培养基(抗菌素)培养基(抗菌素)转化细胞(抗性基因)转化细胞(抗性基因)未转化细胞未转化细胞 培养培养重组重组DNA五、目的基因表达的检测五、目的基因表达的检测合成合成外源基因外源基因 蛋白质蛋白质检测检测六、基因工程操作实例六、基因工程操作实例抗除草剂和多价抗虫基因导入水稻抗除草剂和多价抗虫基因导入水稻光温敏核不育系的研究光温敏核不育系的研究1.Epsps基因为筛选标记的多价抗基因为筛选标记的多价抗虫虫表达载体表达载体构建构建1.1 多基因表达载体构建的流程和图谱多基因表达载体
18、构建的流程和图谱pC1300pCTSM1300pCT-pinII-1pCT-Bt-2pCTSKC3 1.2.载体构建的部分电泳鉴定图谱载体构建的部分电泳鉴定图谱图图1-3 pCT-Bt-2正向连接酶切鉴定正向连接酶切鉴定Lane1:15kb DNA markerLane2:pCT-Bt-2/HindLane3:pCT-Bt-2/KpnI+XhoILane4:pCT-Bt-2/KpnI图图1-4 pCT-Bt-2反向连接酶切鉴定反向连接酶切鉴定Lane1:pCT-Bt-2/Hind Lane2:pCT-Bt-2/KpnIXhoILane3:pCT-Bt-2/PstILane1:15kb DNA
19、marker图图1-1 pCTSM1300酶切鉴定酶切鉴定Lane1:15kb DNA markerLane2:pCTSM1300/EcoRI+XhoI2320 bp图图1-5 载体载体pCTSKC3的酶切鉴定的酶切鉴定Lane1:15kb DNA marker;Lane2:pTSM/EcoRI+XhoI;Lane3:pCTSM1300/EcoRI+XhoI;Lane4:pKC-3/KpnI+Hind;Lane5:pCT-pin-1/KpnI+Hind;Lane6:pCT-pin-1/Hind;Lane7:pCT-Bt-2/Hind;Lane8:pCT-Bt-2/KpnI;Lane9:pRSs
20、1GNA/KpnI;Lane10:pCTSKC3/KpnI3000 bp4500 bp8200 bp图图1-2 pCT-PinII-1酶切验证酶切验证 Lane1:DNA marker(DL15000)Lane2:pCT-PinII-1/KpnI+HindIII3000 bp图图1-6 GNA基因的基因的PCR鉴定鉴定Lane1,2:pCTSKC3(460bp)Lane3:pKC-3(460bp)220bp1.3 Kb图图1-7 TSP和和aroAM12基因的基因的PCR鉴鉴定定Lane1:15kb DNA markerLane2,3:TSP sequence(200bp)Lane4,5:Ep
21、sps gene(1.3kb)图图1-8 Bt 和和 PinII 基因的基因的PCR鉴定鉴定Lane1:pCTSKC3/Bt gene(300bp)Lane2:pCTSKC3/PinII gene(566bp)Lane3:pKC-3/PinII gene(566bp)转转抗草甘膦基因和多个抗虫抗草甘膦基因和多个抗虫基因基因水稻植株的获得水稻植株的获得 2.1 2.1 水稻胚性水稻胚性愈伤组织的愈伤组织的 诱导诱导2.2 2.2 水稻胚性水稻胚性愈伤组织的愈伤组织的 转化转化愈伤组织诱导生长过程图 接种接种7d的愈伤组织的愈伤组织 刚接种的愈伤组织刚接种的愈伤组织继代继代3次的愈伤组织次的愈伤组
22、织 接种接种14d的愈伤组织的愈伤组织 继代继代1次的愈伤组织次的愈伤组织继代继代3次以上的愈伤组织次以上的愈伤组织2.2 愈伤组织的转化基因枪法和农杆菌法2.2.1 材料材料生长生长旺盛,结构致密,颜色淡黄旺盛,结构致密,颜色淡黄的的胚性愈伤组织胚性愈伤组织多基因表达载体多基因表达载体pCTSKC3,pCAMBIA1300农杆菌株农杆菌株EHA1052.2.2 基因枪转化法基因枪转化法转化前,将愈伤组织按转化前,将愈伤组织按每皿每皿25-30块块,放置在平皿放置在平皿 中心中心 2.5cm范围内,然范围内,然后置于高渗培养基上后置于高渗培养基上暗培养暗培养 4h。质粒质粒DNA用量约用量约
23、25ug/6枪枪,可裂膜的压力为,可裂膜的压力为 7.58MPa,靶材料至可裂膜距离为,靶材料至可裂膜距离为 6cm,真空真空度度0.08 Mpa,每皿材料每皿材料 轰击轰击2次次。2.2.3 农杆菌转化法农杆菌转化法质粒质粒DNA转化农杆菌转化农杆菌EHA105。菌液菌液OD6000.6,稀释度为,稀释度为 2倍倍,侵染时间为侵染时间为 30 Min,共培养时间为共培养时间为3d。2.3 结果与分析1通过通过基因枪转化法基因枪转化法轰击轰击1160块块左右的左右的愈伤组织则初步得愈伤组织则初步得到到167株再生植株,株再生植株,转化率为转化率为17.4%。2通过通过农杆菌介导农杆菌介导转化法
24、侵染转化法侵染270块块左右的愈伤组织,左右的愈伤组织,最终只获得最终只获得6株株再再生植株,转化率生植株,转化率为为2.2%。2.2.用于农杆菌转化用于农杆菌转化的愈伤组织块是继的愈伤组织块是继代多次的愈伤组织,代多次的愈伤组织,其生长和分化能力其生长和分化能力大大下降了。大大下降了。1.1.愈伤抑菌过程失愈伤抑菌过程失败从而导致多数愈败从而导致多数愈伤不能分化成苗。伤不能分化成苗。原因原因转基因水稻植株的转基因水稻植株的分子分子生物学生物学鉴定鉴定 3.1 材料和方法3.1.1 材料转基因植株基因组DNA;负对照的基因组DNA;正对照的基因组DNA。3.1.2 方法(1)PCRPCR反应条
25、件:94 5 Min,94 45 s,59 1 Min,72 1.5 Min,30个循环后,72延伸10 Min。(2)Southern blot操作流程:基因组DNA酶切 琼脂糖凝胶电泳 转膜 探针制备 杂交 洗膜 显影3.2.1 部分转基因植株的部分转基因植株的PCR 检测检测M:100bp marker;P:阳性对照(:阳性对照(pCTSKC3);CK:阴性对照;:阴性对照;111:转基因植株:转基因植株1.3kb1.Epsps基因PCR检测(1.3kb)2.Bt基因PCR检测(300bp)4.PinII 基因PCR检测(566bp)566bp300bp3.GNA基因PCR检测(460b
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