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1、1第第20章章 毛细管电泳法毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis CE)概述概述 20.1 CE 的基本原理的基本原理 20.2 CE 的分离模式的分离模式 20.3 毛细管电泳仪毛细管电泳仪 20.4 CE 在医药中的应用进展在医药中的应用进展2 概述概述 电泳：电泳：溶液中的带电粒子（离子、胶粒或分子）在溶液中的带电粒子（离子、胶粒或分子）在电场中的定向迁移现象。电场中的定向迁移现象。物理化学现象。物理化学现象。毛细管电泳（又称高效毛细管电泳）毛细管电泳（又称高效毛细管电泳）（HPCE HPCE），），是一类以是一类以毛细管毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱为

2、分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型电泳分离技术。动力的新型电泳分离技术。包含电泳、色谱及其交叉内容。包含电泳、色谱及其交叉内容。电泳法电泳法（electrophoresiselectrophoresis）以电泳为基础的分离）以电泳为基础的分离分析方法。分析方法。3 电泳法的发展史电泳法的发展史(Phylogeny)(Phylogeny)：电泳现象早在电泳现象早在1818世纪就被发现世纪就被发现。19091909年，年，L.MichaelisL.Michaelis提出提出“电泳电泳 (electrophoresiselectrophoresis)”)”这一术语，他的实验是用这一术语，他的实验

3、是用于测定蛋白质的等电点。于测定蛋白质的等电点。19371937年，年，瑞典科学家瑞典科学家A.Tiselius A.Tiselius 成功研制出界成功研制出界面电泳仪，并建立了移动界面电泳法，用于人血面电泳仪，并建立了移动界面电泳法，用于人血清蛋白的分离。清蛋白的分离。TiseliusTiselius于于4848年获诺贝尔化学奖。年获诺贝尔化学奖。4 花絮 1937年，年，Tiselius(瑞典瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和提

4、取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白；球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；年，获诺贝尔化学奖；1.经典电泳技术经典电泳技术 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术电泳法或电泳技术。经典电泳法经典电泳法自由界面电泳自由界面电泳（无载体电泳）无载体电泳）区带电泳（有载体支持电泳）区带电泳（有载体支持电泳）5 界面电泳界面电泳 ：在没有惰性支持物的

5、液体接界面上：在没有惰性支持物的液体接界面上进行的电泳。进行的电泳。缺点：缺点：对流较严重，组分不能完全分离，检测困难对流较严重，组分不能完全分离，检测困难6 区带电泳：区带电泳：是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动的电泳方法。的电泳方法。避免对流的干扰。避免对流的干扰。纸电泳纸电泳醋酸纤维素电泳醋酸纤维素电泳淀粉凝胶电泳淀粉凝胶电泳琼脂糖电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 7 常压电泳：常压电泳：电位梯度电位梯度 50V/cm 50V/cm 高压电泳：高压电泳：电位

6、梯度电位梯度 50V/cm 50V/cm影响因素：影响因素：电荷效应溶液pH值离子强度和温度电渗1.载体性质和分子筛Eu电泳速度电泳速度电场强度电场强度V/L(V/m)电泳速率电泳速率8 传统电泳的缺陷：传统电泳的缺陷：（1）焦耳热效应焦耳热效应：电流通过电泳介质而产生：电流通过电泳介质而产生的热效应。的热效应。使电泳分离介质温度分布不均匀，引起溶使电泳分离介质温度分布不均匀，引起溶液对流，液对流，从而导致区带展宽从而导致区带展宽，降低分离效率。降低分离效率。焦耳热效应随电场强度的增大而迅速加剧，限焦耳热效应随电场强度的增大而迅速加剧，限制了高电压的使用。制了高电压的使用。（2）无法在线检测，

7、定量精度较差）无法在线检测，定量精度较差。92.2.高效毛细管电泳技术高效毛细管电泳技术19811981年，年，Jorgenson和和Luckas，用，用7575 m m内径的石内径的石英毛细管电泳分离了丹酰化氨基酸，柱效高达英毛细管电泳分离了丹酰化氨基酸，柱效高达4040万万/m/m，使电泳技术发生了根本变革，迅速发，使电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与展成为可与GCGC、HPLCHPLC相媲美的崭新的分离分析相媲美的崭新的分离分析技术技术高效毛细管电泳。高效毛细管电泳。毛细管电泳：毛细管电泳：使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，使焦耳热效应减小，能使用高电压，全面改善分离质量和提

8、高分析速度。10总之，与经典电泳法比较，毛细管电泳法的特点总之，与经典电泳法比较，毛细管电泳法的特点有四个：有四个：高效、快速、微量和自动化。高效、快速、微量和自动化。毛细管的使用使产生的热量能够较快散发，大毛细管的使用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，大减小了温度效应，可以可以使用使用很高的很高的电压。电压。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱内电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱内径变小，柱长增加，理论塔板数高达几十万块径变小，柱长增加，理论塔板数高达几十万块/米，米，特殊柱子可以达到数百万。特殊柱子可以达到数百万。高效毛细管电泳在技术上采取了三项重要改进：高效毛细管电泳在

9、技术上采取了三项重要改进：一、采用了一、采用了50 50 m内径的毛细管；内径的毛细管；二、采用了高达数千伏的高电压；二、采用了高达数千伏的高电压；三、实现了高灵敏度的在线检测。三、实现了高灵敏度的在线检测。11 19811981年，年，JorgensonJorgenson和和LukacsLukacs 使用使用75m75m内径内径的熔融石英毛细管，电泳分离氨基酸和肽，成为的熔融石英毛细管，电泳分离氨基酸和肽，成为高效毛细管电泳划时代的里程碑。至此，出现了高效毛细管电泳划时代的里程碑。至此，出现了毛细管电泳技术。毛细管电泳技术。8080年代以来，年代以来，诞生了很多新的毛细管电泳方法，诞生了很多

10、新的毛细管电泳方法，如毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦电泳。如毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦电泳。8888年商品化年商品化HPCEHPCE问世，问世，高灵敏度柱上检测器的发高灵敏度柱上检测器的发展使展使HPCEHPCE在世界范围内蓬勃开展。在世界范围内蓬勃开展。HPCEHPCE已成为电已成为电泳领域发展最快的新分支。泳领域发展最快的新分支。毛细管电泳的发展毛细管电泳的发展 12高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较（1 1）分离过程：）分离过程：相同相同 HPCE HPCE 与与HPLC HPLC 都是一种液相分离分析技术。都是一种液相分离分析技术。都是差都是差

11、速迁移过程，可用相同的理论来描述速迁移过程，可用相同的理论来描述,如保留值、如保留值、塔板理论和速率理论等。塔板理论和速率理论等。（2 2）分离原理：）分离原理：不同（不同（驱动力不同驱动力不同）HPCEHPCE：带电粒子在电场中发生定向移动，依据粒子带电粒子在电场中发生定向移动，依据粒子所带电荷数、形状、离解度等不同所产生的差速迁所带电荷数、形状、离解度等不同所产生的差速迁移而分离。移而分离。HPLCHPLC：不同组分在两相中的分配系数不同而分离。不同组分在两相中的分配系数不同而分离。13（4 4）应用：）应用：二者相互补充二者相互补充 HPCEHPCE在生物大分子分离方面，在分析速度和效率

12、、在生物大分子分离方面，在分析速度和效率、样品和试剂用量方面有优势，但在样品制备和定样品和试剂用量方面有优势，但在样品制备和定性、定量重复性等方面不及性、定量重复性等方面不及HPLCHPLC。（3 3）仪器流程：）仪器流程：基本相同基本相同 都包括进样装置、分离柱、检测器和数据记录处都包括进样装置、分离柱、检测器和数据记录处理等部分。理等部分。141.1.分离模式多：分离模式多：2.2.分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 在在3.1min内分离内分离36种无机及有机阴离子，种无机及有机阴离子，4.1min内分离内分离了了24种阳离子；种阳离子；分离柱效：分离柱效：105107/m理论

13、塔板数；理论塔板数；3.3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 进样量极少（进样量极少（纳升）纳升），水介质中进行；，水介质中进行；4.仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶电源、毛细管、检测器、溶液瓶5.5.应用范围极广应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；小结：小结：高效毛细管电泳法的特点高效毛细管电泳法的特点 （多、快、好、省多、快、好、省）1520.1 20.1 毛细管电泳的基本原理毛细管电泳的基本

14、原理一、一、电泳和电泳淌度电泳和电泳淌度二、二、电渗和电渗率电渗和电渗率三、表观淌度三、表观淌度四、四、分离效率和谱带展宽分离效率和谱带展宽五、五、分离度分离度16Euepep4iep 介质的介电常数介质的介电常数 介质的粘度介质的粘度 i粒子的 Zeta 电势,近似正比于 Z/M2/3 Z 为净电荷，M 为摩尔质量。电泳的速度电泳的速度 uep 可表示为：可表示为：ep 电泳淌度，电泳淌度，单位电场下的电泳速度。单位电场下的电泳速度。空心毛细管柱中一个粒子的空心毛细管柱中一个粒子的淌度淌度近似表示为：近似表示为：一一、电泳和电泳淌度、电泳和电泳淌度与介质性与介质性质有关质有关与粒子性质有关：

15、与粒子性质有关：表面电荷和粒子质量的大小表面电荷和粒子质量的大小17epefiii有效淌度：有效淌度：在实际溶液中，考虑离子活度系数、溶在实际溶液中，考虑离子活度系数、溶质分子的离解程度均对粒子的淌度有影响，这时的质分子的离解程度均对粒子的淌度有影响，这时的淌度称为淌度称为有效淌度有效淌度。i 样品分子的第样品分子的第 i i 级电离度级电离度 i 活度系数或其它平衡离解度活度系数或其它平衡离解度总之，总之，粒子的迁移速度除与粒子的迁移速度除与电场强度电场强度和和介质的特性介质的特性有关外，有关外，还与粒子的离解度、电荷数及其大小和形状有关。还与粒子的离解度、电荷数及其大小和形状有关。不同的带

16、电粒子电泳速度不同，可以实现分离不同的带电粒子电泳速度不同，可以实现分离18二、电渗和电渗率二、电渗和电渗率电渗（电渗（electroosmotic）：在电场作用下，液体相在电场作用下，液体相对带电的固体支持介质移动的现象，对带电的固体支持介质移动的现象，又称电渗又称电渗（流）（流）EOF。19石英毛细管表面石英毛细管表面含有许多硅醇基含有许多硅醇基（SiOHSiOH），在），在一定的条件下可一定的条件下可离解使表面带有离解使表面带有负电荷。负电荷。毛细管中的电渗流的形成毛细管中的电渗流的形成双电层抗衡离子20 机理：机理：当在毛细管两端加有电场时，双电层内靠当在毛细管两端加有电场时，双电层内

17、靠近管壁的稠密层中可迁移阳离子向阴极移动。由近管壁的稠密层中可迁移阳离子向阴极移动。由于离子是被水化的，因此，带动管中的液体也随于离子是被水化的，因此，带动管中的液体也随迁移着一起匀速向阴极移动，形成电渗流。迁移着一起匀速向阴极移动，形成电渗流。总之，总之，毛细管中的电渗流是毛细管内壁表面电毛细管中的电渗流是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动。荷所引起的管内液体的整体流动。电渗流的特点电渗流的特点：具有一定流具有一定流型，其电渗驱动力沿毛细管型，其电渗驱动力沿毛细管均匀分布，所以电渗速度的均匀分布，所以电渗速度的径向分布几乎是均匀的。径向分布几乎是均匀的。21 eo电渗率，电渗率，单

18、位电场下的电渗流的线速度单位电场下的电渗流的线速度ososEuosos 介质的介电常数介质的介电常数 介质的粘度介质的粘度 管壁的管壁的 Zeta Zeta 电势，即电势，即双双电层到电层到管壁很近的地方之间的管壁很近的地方之间的电位差。电位差。总之，总之，Zeta Zeta 电势越大，介电常数越大，粘度越小，电势越大，介电常数越大，粘度越小，电渗流越大。电渗流越大。在电场作用下，电泳和电渗同时存在，电渗流速度在电场作用下，电泳和电渗同时存在，电渗流速度是电泳的是电泳的 5 5 7 7 倍。倍。电渗的速度可以表示为：电渗的速度可以表示为：22硅醇基阴离子石英毛细管柱内壁的双电层结构图石英毛细管

19、柱内壁的双电层结构图双双电电层层电电势势表面电势表面电势 0Stern电势电势 d电动电势电动电势 双电层模型双电层模型23 电渗流的控制：电渗流的控制：电渗流是毛细管电泳的基本操作要素，为了优电渗流是毛细管电泳的基本操作要素，为了优化分离，有必要对它进行控制。化分离，有必要对它进行控制。电渗流的控制要求对毛细管表面及缓冲液的粘电渗流的控制要求对毛细管表面及缓冲液的粘度进行调节。度进行调节。（1 1）电场强度）电场强度（2 2）缓冲溶液的）缓冲溶液的pHpH（影响管壁带电情况）（影响管壁带电情况）（3 3）缓冲溶液的浓度和离子强度（影响）缓冲溶液的浓度和离子强度（影响Zeta Zeta 电势）

20、电势）24三、三、表观淌度表观淌度 在毛细管电泳中同时存在电泳流和电渗流，在毛细管电泳中同时存在电泳流和电渗流，所以带所以带电粒子在电场中的迁移速度由两者同时决定，可表电粒子在电场中的迁移速度由两者同时决定，可表示为：示为：Euuu)(osefosefaposefapuap 表观迁移速度表观迁移速度 ap 表观淌度表观淌度注：注：一般情况下一般情况下，uos os uefef25efosapuuuefosapuuuosapuu中性分子中性分子 阳离子阳离子 阴离子阴离子电渗电渗流流26四、四、分离效率和谱带展宽分离效率和谱带展宽1.柱效参数柱效参数理论塔板数和塔板高度理论塔板数和塔板高度2)/

21、(54.52/1WtnmnLHd/理论塔板数：理论塔板数：塔板高度：塔板高度：Ld 进样口到检测器之间的距离进样口到检测器之间的距离t tm m 迁移时间迁移时间，W W1/21/2 时间半峰宽时间半峰宽27uDH/2DELDuLndapd2/2/影响柱效的因素：影响柱效的因素：（1 1）n n 与与 E E 成正比，成正比，E E 越大，柱效越高。越大，柱效越高。（2 2）n n 与溶质的扩散系数与溶质的扩散系数 （D）成反比，成反比，D越小越小的分子柱效越高。的分子柱效越高。毛细管电泳的速率方程：毛细管电泳的速率方程：理论塔板数：理论塔板数：溶质的扩散系数溶质的扩散系数只有纵只有纵向扩散向

22、扩散项项282.2.引起带展宽的因素引起带展宽的因素电渗的流型：电渗的流型：呈塞状扁平流型呈塞状扁平流型 扁平流型是毛细管电泳获得高分离度的重要原因扁平流型是毛细管电泳获得高分离度的重要原因之一，是理想状态。之一，是理想状态。29（1 1）扩散）扩散uDH/2扩散系数由溶质本身的性质决定，随分子量的增扩散系数由溶质本身的性质决定，随分子量的增加而降低。分子越大，加而降低。分子越大，D D 越小。越小。因此，毛细管电泳特别适合分离生物大分子。因此，毛细管电泳特别适合分离生物大分子。另外，凡是能影响溶质扩散的因素都会影响谱带另外，凡是能影响溶质扩散的因素都会影响谱带宽度。宽度。30（2 2）自热（

23、焦耳热）自热（焦耳热）焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时，焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时，在毛细在毛细管内形成管内形成径向温度梯度径向温度梯度（管壁温度（管壁温度 管轴心温度）管轴心温度）表：毛细管壁温度和中心到壁的温差表：毛细管壁温度和中心到壁的温差 径向温度梯度导致缓冲溶液的径向粘度梯度径向温度梯度导致缓冲溶液的径向粘度梯度 ，引起电泳，引起电泳淌度改变，淌度改变，导致离子迁移速度的径向不均匀分布，破坏导致离子迁移速度的径向不均匀分布，破坏了区带的扁平流轮廓，导致区带展宽，柱效降低。了区带的扁平流轮廓，导致区带展宽，柱效降低。31 焦耳热和温度梯度的控制焦耳热和温度梯度的控制 焦耳热的

24、大小与毛细管尺寸、缓冲液电导及电焦耳热的大小与毛细管尺寸、缓冲液电导及电场强度有关。场强度有关。操作电压：操作电压：电压越高，焦耳热越严重。电压越高，焦耳热越严重。柱内径：柱内径：是影响焦耳热的一个重要因素。内径是影响焦耳热的一个重要因素。内径越小，焦耳热的影响越小。通常毛细管电泳采越小，焦耳热的影响越小。通常毛细管电泳采用尽可能小的柱内径。用尽可能小的柱内径。缓冲溶液的浓度：缓冲溶液的浓度：浓度增加，焦耳热增加浓度增加，焦耳热增加。32 目前常采用内径为目前常采用内径为 25 2575 75 m m 的毛细管柱的毛细管柱 采用外管壁涂层技术采用外管壁涂层技术。Knox方程：方程：Edc1/3

25、1500E电场强度，电场强度，d d管内径，管内径，c c介质浓度介质浓度满足上式方程，自热影响较小。满足上式方程，自热影响较小。当当E=50kV/m,E=50kV/m,c c=0.01mol/L=0.01mol/L时，时，d140m即能即能满足上述方程满足上述方程 。33(3)(3)吸附吸附 毛细管电泳中的吸附作用主要指毛细管管壁对被毛细管电泳中的吸附作用主要指毛细管管壁对被分离物质粒子的作用。分离物质粒子的作用。主要原因：主要原因：阳离子溶质和带负电的管壁离子相互作用；疏水阳离子溶质和带负电的管壁离子相互作用；疏水作用。作用。吸附作用与毛细管表面积与体积之比有关。吸附作用与毛细管表面积与体

26、积之比有关。内径越细，吸附越严重。内径越细，吸附越严重。34五、五、分离度分离度 分离度：分离度：将淌度相近的组分分开的能力。将淌度相近的组分分开的能力。uunR4 n 理论塔板数理论塔板数 u/u 两组分的相对迁移速度差两组分的相对迁移速度差4)(2122112mmmmttWWttR定义式：定义式：根据根据 Gidding 方程，分辨率方程，分辨率 R 定义为：定义为：35对上面的公式处理，可得：2/1)()()(241(eodDLVLR由公式可见：由公式可见：R 并非随操作电压线性增加，而是并非随操作电压线性增加，而是与操作电压的平方根成正比。与操作电压的平方根成正比。操作电压的增加受到焦

27、耳热的限制。操作电压的增加受到焦耳热的限制。3620.2 20.2 毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的分离模式一、毛细管电泳的分类一、毛细管电泳的分类二、毛细管区带电泳法二、毛细管区带电泳法三、胶束电动毛细管色谱三、胶束电动毛细管色谱四、凝胶毛细管电泳法四、凝胶毛细管电泳法五、毛细管电色谱法五、毛细管电色谱法37一、毛细管电泳的分类一、毛细管电泳的分类按分离模式可分为三大类按分离模式可分为三大类电泳型电泳型毛细管区带电泳毛细管区带电泳毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳色谱型色谱型 毛细管电色谱毛细管电色谱胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱微乳液电动毛细管色谱微乳液

28、电动毛细管色谱电泳电泳/色谱型色谱型38二、二、毛细管区带电泳法毛细管区带电泳法（C Capillary Zone Electrophorsis,CZE）毛细管区带电泳（又称毛细管自由溶液区带电泳毛细管区带电泳（又称毛细管自由溶液区带电泳法）法）是毛细管电泳中最简单、最基本、使用最广是毛细管电泳中最简单、最基本、使用最广泛的一种技术。泛的一种技术。CZE的理论的理论是其它是其它CECE方法的理论模板。方法的理论模板。39efosapuuuefosapuuuosapuu中性分子中性分子 阳离子阳离子 阴离子阴离子1.1.分离机理分离机理 在在只填充缓冲溶液只填充缓冲溶液的毛细管中，不同质荷比大小

29、的的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下因组分在电场的作用下因淌度不同淌度不同而进行分离。而进行分离。40 在毛细管中，由于电渗流的存在，在毛细管中，由于电渗流的存在，所有溶质所有溶质都随电渗流一起向负极迁移。都随电渗流一起向负极迁移。在在CZECZE中可以实现中可以实现正负离子（或粒子）正负离子（或粒子）的同时的同时分离分离,中性粒子随电渗流一起流出毛细管中性粒子随电渗流一起流出毛细管,不能不能分离（图谱上是一个峰）分离（图谱上是一个峰）。组分的检出顺序为：组分的检出顺序为：阳离子（粒子）阳离子（粒子）中性粒子中性粒子负离子（粒子）负离子（粒子）CZE溶质的迁移规律小结：溶质的迁移规

30、律小结：41 2.2.影响影响CZECZE迁移速率的因素（操作条件的选择）迁移速率的因素（操作条件的选择）（1 1）操作电压）操作电压 操作电压与毛细管的内径和长度及缓冲溶液浓度操作电压与毛细管的内径和长度及缓冲溶液浓度（离子强度）有关。（离子强度）有关。柱长一定时柱长一定时，在一定电压范围内，操作电压与粒，在一定电压范围内，操作电压与粒子的迁移速度呈线性关系。子的迁移速度呈线性关系。当电压过高时，线性关系偏移，主要是由高电压当电压过高时，线性关系偏移，主要是由高电压引起的焦耳热造成的。电压的极值范围随系统和引起的焦耳热造成的。电压的极值范围随系统和组成而异。组成而异。一般为小于一般为小于30

31、KV30KV。电压对柱效的影响也是相同的。电压对柱效的影响也是相同的。42（2 2）缓冲溶液的选择：）缓冲溶液的选择：重要的分离因素重要的分离因素 CZECZE缓冲溶液必须符合以下条件：缓冲溶液必须符合以下条件：在规定的在规定的pHpH值范围内应有较强的缓冲能量，值范围内应有较强的缓冲能量，并维持恒定的并维持恒定的pHpH值。值。尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的缓冲盐。缓冲盐。在检测波长处有较低的吸收度在检测波长处有较低的吸收度 尽可能采用酸性缓冲溶液。吸附和电渗都尽可能采用酸性缓冲溶液。吸附和电渗都小。43 缓冲溶液的缓冲溶液的pHpH：是影响组分

32、离子淌度的最主要是影响组分离子淌度的最主要因素。因素。影响管壁电荷多少，影响电渗流的大小和迁移影响管壁电荷多少，影响电渗流的大小和迁移速率速率 ZetaZeta电位，电位，当当pHpH值在值在4 4 7 7时，对时，对EOFEOF影响最大影响最大 影响被分离物质的电荷，影响迁移速度和方向。影响被分离物质的电荷，影响迁移速度和方向。电离程度：如蛋白质，多肽等，电离程度：如蛋白质，多肽等，荷电状况：荷电状况：44 当当pHpH pI pI,溶质带正净电，朝阴极泳动，和电渗溶质带正净电，朝阴极泳动，和电渗方向相同，粒子迁移总速度比电渗快；方向相同，粒子迁移总速度比电渗快；当当pH pH pI pI，

33、溶质带负净电，移向负极，和电渗，溶质带负净电，移向负极，和电渗方向相反，粒子迁移总速度比电渗慢。方向相反，粒子迁移总速度比电渗慢。必须比必须比pIpI高或低一个高或低一个pHpH单位。单位。pIpI1 pH=pH=pI pI，在在等电点等电点pIpI时时,正负解离相等，净电正负解离相等，净电荷为荷为0 0；粒子迁移速度和电渗速度相同。粒子迁移速度和电渗速度相同。复习：蛋白质的等电点45多肽多肽编号编号计算的电荷计算的电荷计算的等电点计算的等电点pH=2.5pH=2.5pH=4.0pH=4.0pH=11.0pH=11.01 12.412.412.022.02-0.47-0.4710.510.52

34、 21.411.411.021.02-0.71-0.7110.110.13 31.371.370.460.46-0.71-0.716.76.74 40.410.410.020.02-0.95-0.956.06.05 50.370.37-0.54-0.54-1.95-1.953.23.26 60.330.33-1.09-1.09-2.95-2.953.03.0表：表：6个合成小肽的计算电荷和等电点4647影响进样过程，特别是采用电动进样方法。影响进样过程，特别是采用电动进样方法。缓冲溶液的种类：缓冲溶液的种类：影响离子的迁移和分离影响离子的迁移和分离 缓冲液缓冲液B4O72-cit3-Ac-PO

35、43-HCO3-电流电流/A A EOFEOF/(10/(10-5-5cmcm2 2/V/Vs)s)137.441.2246.547.774.549.0162.049.769.051.8表：不同阴离子钠盐缓冲溶液测得的电流和电渗迁移率表：不同阴离子钠盐缓冲溶液测得的电流和电渗迁移率cit3-柠檬酸柠檬酸尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的缓冲盐。尽可能使用分子体积大、电荷少、淌度低的缓冲盐。48浓度增加，会引起溶液粘度、溶质、扩散系数及浓度增加，会引起溶液粘度、溶质、扩散系数及ZetaZeta电位等的变化，缓冲溶液浓度的增加对柱效电位等的变化，缓冲溶液浓度的增加对柱效的影响比较复杂。的影响比

36、较复杂。在恒定在恒定pHpH值下，值下，浓度增加，浓度增加，（扩散层变薄），（扩散层变薄），电渗率降低，溶质的迁移速率下降，迁移时间延电渗率降低，溶质的迁移速率下降，迁移时间延长。分离效率提高。长。分离效率提高。浓度的增加，导电的离子数增加，在相同的电场浓度的增加，导电的离子数增加，在相同的电场下毛细管的电流值增加，焦耳热增加。下毛细管的电流值增加，焦耳热增加。总之：在一定浓度范围内，增加缓冲溶液的浓度可以提高柱效和分离度，并可以抑制管壁的吸附作用。常用浓度：常用浓度：10200mmol/L49CZECZE特点：特点：操作简单、快速、分离效率高。应用广操作简单、快速、分离效率高。应用广泛，适用

37、于具有不同淌度的带电粒子的分离。分子泛，适用于具有不同淌度的带电粒子的分离。分子量范围：从十几的小分子到几十万的生物大分子。量范围：从十几的小分子到几十万的生物大分子。不足：不能分离中性分子不能分离中性分子！添加剂：添加剂：改善管壁或溶质的理化性质，优化分离条件。改善管壁或溶质的理化性质，优化分离条件。表面活性剂：如表面活性剂：如SDS、季铵盐等；、季铵盐等；有机溶剂，如甲醇、乙腈等；有机溶剂，如甲醇、乙腈等；两性离子，如三甲铵基甲内盐等；两性离子，如三甲铵基甲内盐等；金属盐，如金属盐，如K2SO4、LiCl等等手性试剂，如环糊精、冠醚、胆汁酸盐等手性试剂，如环糊精、冠醚、胆汁酸盐等50 应用

38、实例应用实例 例例1 1 毛细管区带电泳分离五种碱性蛋白。毛细管区带电泳分离五种碱性蛋白。例例2 2 三种手性药物的对映体拆分三种手性药物的对映体拆分51小结：52三、三、胶束电动（毛细管）色谱胶束电动（毛细管）色谱（M Micellar electrokinetic chromatography,MEKC(Micellar electrokinetic capillary chromatography,MECC）胶束电动色谱：胶束电动色谱：是以胶束为是以胶束为假固定相假固定相的一种电动色的一种电动色谱法，是电泳技术与色谱技术的结合，因在毛细管谱法，是电泳技术与色谱技术的结合，因在毛细管中进行

39、，又称为中进行，又称为胶束电动毛细管色谱。胶束电动毛细管色谱。531.1.胶束的形成和特性胶束的形成和特性 表面活性剂：表面活性剂：由亲水基和疏水基组成。疏水部分为由亲水基和疏水基组成。疏水部分为直链或支链烷烃；亲水部分由阳离子、阴离子、两直链或支链烷烃；亲水部分由阳离子、阴离子、两性离子基团组成。性离子基团组成。临界胶束浓度（临界胶束浓度（CMCCMC）：）：表面活表面活性剂开始聚集形成胶束时的浓度。性剂开始聚集形成胶束时的浓度。不同的表面活性剂不同的表面活性剂CMCCMC不同，形不同，形成的胶束的形态也不相同。成的胶束的形态也不相同。胶束具有团状结构，疏水性的链胶束具有团状结构，疏水性的链

40、端向里，带电荷的亲水端朝向缓端向里，带电荷的亲水端朝向缓冲溶液。冲溶液。具有增溶作用。具有增溶作用。54表：常用的表面活性剂表：常用的表面活性剂表面活性剂表面活性剂CMC/(mmol/L)聚集数聚集数/n阴离子型阴离子型十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDS）8.262阳离子型阳离子型十二烷基三甲基溴化铵（十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）十六烷基三甲基溴化铵（十六烷基三甲基溴化铵（C.TAB）141.35078非离子型非离子型 辛基葡萄糖苷辛基葡萄糖苷n-十二烷基十二烷基 麦芽糖苷麦芽糖苷Triton-X-1000.160.24140两性离子型两性离子型 3-(3-胆甾酰胺丙基胆甾酰胺丙基)二

41、甲基铵二甲基铵-1-丙磺酸内盐丙磺酸内盐810胆酸盐胆酸盐胆酸胆酸去氧胆酸（）去氧胆酸（）牛黄酸胆酸（）牛黄酸胆酸（）1451015244104聚集数聚集数n n：形成一个胶束离子所需的分子数。聚集数一般在：形成一个胶束离子所需的分子数。聚集数一般在40-14040-140个之间。个之间。55MECC的分离原理示意图的分离原理示意图 胶束准固定相胶束准固定相液相载体液相载体阳阳极极阴阴极极2.2.分离机理分离机理 把把离子型表面活性剂离子型表面活性剂加到缓冲溶液中，使形成离子胶束。加到缓冲溶液中，使形成离子胶束。胶束在毛细管中起胶束在毛细管中起准固定相准固定相的作用，使的作用，使中性溶质中性溶

42、质在流动相在流动相（水相）和准固定相（胶束相）中进行分配，由于溶质在胶（水相）和准固定相（胶束相）中进行分配，由于溶质在胶束中有不同的保留能力而产生差速迁移，从而实现分离。束中有不同的保留能力而产生差速迁移，从而实现分离。56说明：说明：（1 1）离子型胶束表面带电荷。在电场作用下也离子型胶束表面带电荷。在电场作用下也要发生电泳而移向阳极或阴极，如要发生电泳而移向阳极或阴极，如SDSSDS表面带负表面带负电荷，朝阳极方向泳动，和电渗方向相反。电荷，朝阳极方向泳动，和电渗方向相反。但在但在大多数情况下，电渗速度大多数情况下，电渗速度大于大于胶束的电泳速度，胶束的电泳速度，所以胶束实际的移动方向朝

43、向所以胶束实际的移动方向朝向阴极阴极。（2 2）对于中性分子来说，）对于中性分子来说，分离仅受溶质进入和分离仅受溶质进入和离开胶束这一行为的影响。离开胶束这一行为的影响。例如例如：阴离子胶束迁：阴离子胶束迁移方向与电渗流相反，溶质与胶束的作用力越强，移方向与电渗流相反，溶质与胶束的作用力越强，迁移时间越长。溶质的疏水性越强，与胶束间的迁移时间越长。溶质的疏水性越强，与胶束间的作用力越强，迁移时间越长。作用力越强，迁移时间越长。57 用于用于MEKC的的胶束的基本要求：胶束的基本要求：(1)(1)生成的胶束稳定性要好，与溶质的缔合速生成的胶束稳定性要好，与溶质的缔合速度快，度快，减小峰扩散。减小

44、峰扩散。(2)(2)形成的胶束必须是均匀、透明的溶液，能形成的胶束必须是均匀、透明的溶液，能透过紫外光；透过紫外光；紫外检测紫外检测(3)(3)胶束的粘度要小；胶束的粘度要小；不影响电渗流和分离度不影响电渗流和分离度(4)(4)表面活性剂的表面活性剂的CMCCMC要小，要小，不增大电流不增大电流58在在MEKCMEKC中控制选择性的方法中控制选择性的方法（1 1）使用不同的表面活性剂）使用不同的表面活性剂 SDSSDS可用于大多数中性溶质的分离；可用于大多数中性溶质的分离；强疏水性溶质可选用极性强的胶束体系如胆强疏水性溶质可选用极性强的胶束体系如胆酸盐；酸盐；对易被管壁吸附的大分子溶质，可选用

45、阳离对易被管壁吸附的大分子溶质，可选用阳离子胶束；子胶束；分离离子性溶质时，要选择与溶质电荷相反分离离子性溶质时，要选择与溶质电荷相反的胶束，才能相互作用进入胶束。的胶束，才能相互作用进入胶束。59（2 2）缓冲溶液的选择）缓冲溶液的选择 缓冲溶液体系的改变可以改变溶质在两缓冲溶液体系的改变可以改变溶质在两相间的分配系数，相间的分配系数，从而对容量因子和迁从而对容量因子和迁移产生影响。移产生影响。流动相的改变包括缓冲溶液种类、成分、流动相的改变包括缓冲溶液种类、成分、pHpH值和离子强度。值和离子强度。pH pH值不能改变值不能改变SDSSDS的荷电情况，因此不的荷电情况，因此不影响胶束的泳动

46、速度。影响胶束的泳动速度。60（3）使用添加剂）使用添加剂（1 1）手性选择剂）手性选择剂（2 2）尿素、金属离子和硼酸盐）尿素、金属离子和硼酸盐（3 3）有机溶剂，如甲醇、乙腈等，控制溶质）有机溶剂，如甲醇、乙腈等，控制溶质胶束之间的相互作用。胶束之间的相互作用。61 MECCMECC的特点（与的特点（与HPLCHPLC比较）比较）（1 1）能同时分离不带电的中性分子和荷电能同时分离不带电的中性分子和荷电粒子，并可用于粒子，并可用于强疏水性溶质强疏水性溶质的分离。是的分离。是HPCEHPCE应用较多和较广的操作方式。应用较多和较广的操作方式。（2 2）分离效率高，分离效率高，HPLCHPLC

47、的柱效为的柱效为5 5，000 000 25 25，000000理论塔板数；理论塔板数；MECKMECK的柱效为的柱效为5050，000000 500500，000000理论塔板数。与毛细管理论塔板数。与毛细管GCGC接接近，使分离复杂混合物成为可能。近，使分离复杂混合物成为可能。62四、四、凝胶毛细管电泳法凝胶毛细管电泳法（Capillary Gel Electrophoresis，CGE）用凝胶物质作为支持物进行电泳的方式，用凝胶物质作为支持物进行电泳的方式，称为称为凝胶电泳。凝胶电泳。平板凝胶电泳平板凝胶电泳 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳：在毛细管内充有凝胶或其它：在毛细管内充有凝胶或其

48、它筛分介质（筛分介质（凝胶柱凝胶柱），流经凝胶的物质，原则），流经凝胶的物质，原则上按分子的大小分离。上按分子的大小分离。63 凝胶介质凝胶介质：是一种固态胶体分散体系，由网状结：是一种固态胶体分散体系，由网状结构和共聚其中的溶剂所组成。凝胶物质具有多孔构和共聚其中的溶剂所组成。凝胶物质具有多孔性，有一种类似分子筛的作用。通过它的物质会性，有一种类似分子筛的作用。通过它的物质会按分子的大小逐一被分离开。按分子的大小逐一被分离开。凝胶凝胶无机凝胶：无机凝胶：多孔硅胶、多孔玻璃多孔硅胶、多孔玻璃有机凝胶：有机凝胶：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）

49、纤维素衍生物纤维素衍生物64 特点：特点：柱效高柱效高 凝胶粘度大，抗对流，可减小溶质扩散；凝胶粘度大，抗对流，可减小溶质扩散；可采用短柱分离可采用短柱分离 溶质与凝胶（或添加剂）可生溶质与凝胶（或添加剂）可生成络合物，使分离度增加，防止溶质在管壁的吸成络合物，使分离度增加，防止溶质在管壁的吸附并减小电渗流。附并减小电渗流。和常规的和常规的SDS-PAGESDS-PAGE相同，毛细管相同，毛细管SDS-PAGESDS-PAGE可提供可提供丰富的分子量信息，具有更好的定性分析性能。丰富的分子量信息，具有更好的定性分析性能。样品用量少样品用量少，可以实现自动化，可用于大分子物，可以实现自动化，可用

50、于大分子物质的微制备和馏分收集。质的微制备和馏分收集。缺点：缺点：柱制备较困难，寿命偏短。柱制备较困难，寿命偏短。65 应用：应用：CGECGE在分子生物学和蛋白质化学上有十分广泛的在分子生物学和蛋白质化学上有十分广泛的应用。应用。在分子生物学上实现了包括在分子生物学上实现了包括寡聚核苷酸寡聚核苷酸纯化、纯化、反应基因治疗反应基因治疗、DNADNA测序和测序和PCRPCR产物的分析产物的分析。在蛋白质化学方面用于多肽和蛋白质的分子测在蛋白质化学方面用于多肽和蛋白质的分子测量，原蛋白和量，原蛋白和SDSSDS结合蛋白的分离等。结合蛋白的分离等。用于其它带电物质的分离，并可通过加入添加用于其它带电