第五章分子标记技巧与植物育种课件.ppt

1、第五章第五章 分子标记技术与植物育种分子标记技术与植物育种 遗传标记遗传基因作物育种农业生产遗传标记遗传基因作物育种农业生产本章内容提要：本章内容提要：第一节第一节 植物育种常用的遗传标记植物育种常用的遗传标记（morphological markers）cytological markers biochemical markers molecular markers n概念：遗传标记（概念：遗传标记（genetic marker）定定义为义为n遗传标记的特征遗传标记的特征:1）可识别性：亲本间存在着多态性（即差）可识别性：亲本间存在着多态性（即差异）。异）。2）可遗传性：亲本间存在的多态性在

2、后代中）可遗传性：亲本间存在的多态性在后代中可以重演。可以重演。n遗传标记的类型遗传标记的类型:形态标记，或可见标记（形态标记，或可见标记（visible markers）细胞学标记细胞学标记（cytological markers）生化标记（生化标记（biochemical markers）DNA标记（标记（DNA markers）n遗传标记的用途：遗传标记的用途：（1）遗传研究：连锁分析、基因定位、遗传）遗传研究：连锁分析、基因定位、遗传作图、基因转移和多样性分析等。作图、基因转移和多样性分析等。（2）植物育种：辅助选择。）植物育种：辅助选择。在作物育种中，通常把与育种目标性状紧在作物育种

3、中，通常把与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用于对目标性状进行追密连锁的遗传标记用于对目标性状进行追踪选择、辅助选择以及基因型鉴定。踪选择、辅助选择以及基因型鉴定。遗传标记的发展：遗传标记的发展：n形态标记：简单性状的遗传（普通遗传形态标记：简单性状的遗传（普通遗传学）；学）；n细胞学标记：染色体变异与细胞学特征细胞学标记：染色体变异与细胞学特征（细胞遗传学）；（细胞遗传学）；n同工酶标记（蛋白质标记）：同工酶与电同工酶标记（蛋白质标记）：同工酶与电泳技术（生化遗传学）；泳技术（生化遗传学）；n分子标记：分子标记：DNA序列变异与检测技术（分序列变异与检测技术（分子遗传学）：子遗传学）：一、形态

4、标记一、形态标记n形态标记：指植物的外部形态特征，是一类容易形态标记：指植物的外部形态特征，是一类容易观测，使用广泛的标记。典型的形态标记用肉眼观测，使用广泛的标记。典型的形态标记用肉眼可以识别和观察，也叫可以识别和观察，也叫可见标记（可见标记（visible markers），是指在个体上可以看见的遗传标记，是指在个体上可以看见的遗传标记，如花色（红花、白花）、株高（高秆、矮秆），如花色（红花、白花）、株高（高秆、矮秆），还有叶形、果色等性状通过观察即可作出判断。还有叶形、果色等性状通过观察即可作出判断。n广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识别

5、的某些性状，如生理生殖特性、抗病虫性等。别的某些性状，如生理生殖特性、抗病虫性等。如：水稻部分形态标记及标记基因如：水稻部分形态标记及标记基因n形态标记材料的获得方法：一般通过自然形态标记材料的获得方法：一般通过自然突变、物理或化学诱变来获得具有特定形突变、物理或化学诱变来获得具有特定形态特征的遗传标记材料。态特征的遗传标记材料。n标记与基因的连锁分析方法：通过两点、标记与基因的连锁分析方法：通过两点、三点测验来确定标记基因与目标性状之间三点测验来确定标记基因与目标性状之间的关系。利用已知位点的标记定位未知位的关系。利用已知位点的标记定位未知位点的新标记。点的新标记。n形态标记的实质：利用一个

6、性状来推论另形态标记的实质：利用一个性状来推论另一个性状，或利用一个性状来推论它的遗一个性状，或利用一个性状来推论它的遗传基因传基因形态标记的利用：形态标记的利用：n大麦中抗杆锈与抗散黑穗病基因连锁，选大麦中抗杆锈与抗散黑穗病基因连锁，选一个可连带另一个基因。一个可连带另一个基因。n棉花芽黄与核雄性不育基因共分离，苗期棉花芽黄与核雄性不育基因共分离，苗期可以鉴别可育株和不育株用于制种。可以鉴别可育株和不育株用于制种。二、细胞学标记二、细胞学标记染色体结构和数量的直接分析方法：染色体核型分染色体结构和数量的直接分析方法：染色体核型分析和染色体带型分析。析和染色体带型分析。n染色体核型：染色体数目

7、、大小、随体有无、着丝染色体核型：染色体数目、大小、随体有无、着丝粒位置等粒位置等核型特征核型特征指染色体的长度、着丝粒位置和随体有无指染色体的长度、着丝粒位置和随体有无后期染色体的形态n染色体的数量特征：细胞中染色体数目的多少染色体的数量特征：细胞中染色体数目的多少n染色体数量上的遗传多样性染色体数量上的遗传多样性n整倍性变异：单倍体、多倍体整倍性变异：单倍体、多倍体n非整倍性变异：缺体、单体、三体、端着丝点染非整倍性变异：缺体、单体、三体、端着丝点染色体等色体等物种 染色体数目（2n）人类 Homo sapiens 46 小家鼠 Mus musculus 40 果蝇 Drosophila

8、melanogaster 8 小麦 Triticum vulgare 42 水稻 Oryza sativa 24 豌豆 Pisum sativum 14 链孢霉 Neurospora crassa 7 衣藻 Chlamydomonas reinhardi 16 n用具有染色体数目和结构变异的材料与染用具有染色体数目和结构变异的材料与染色体正常的材料杂交，其后代常导致特定色体正常的材料杂交，其后代常导致特定染色体上的基因在减数分裂过程中的分离染色体上的基因在减数分裂过程中的分离和重组发生偏离，由此可以测定基因所在和重组发生偏离，由此可以测定基因所在的染色体及其相对位置。的染色体及其相对位置。n因

9、此染色体数目和结构的特征可以作为一因此染色体数目和结构的特征可以作为一种遗传标记。种遗传标记。n染色体数目和结构变异常具有相应的形态染色体数目和结构变异常具有相应的形态学特征，因此可以提高这些标记的鉴定和学特征，因此可以提高这些标记的鉴定和利用效率。利用效率。染色体染色体三体名称三体名称特征特征1 1三体三体1 1草状，生长缓慢，高度不育草状，生长缓慢，高度不育2 2三体三体2 2矮生，小穗短，护颖长，高度不育矮生，小穗短，护颖长，高度不育3 3三体三体3 3完全不育，植株最矮，叶片厚呈革质完全不育，植株最矮，叶片厚呈革质4 4三体三体4 4植株最高，叶片下垂，叶舌长，可育植株最高，叶片下垂，

10、叶舌长，可育5 5三体三体5 5叶片短且扭曲，着粒密，结实率高叶片短且扭曲，着粒密，结实率高6 6三体三体6 6子粒有芒，叶片厚而卷曲，高度不育子粒有芒，叶片厚而卷曲，高度不育7 7三体三体7 7叶片窄而半卷，穗不完全伸出，部分可育叶片窄而半卷，穗不完全伸出，部分可育8 8三体三体8 8叶片窄卷，叶舌短，子粒短而粗，部分可育叶片窄卷，叶舌短，子粒短而粗，部分可育9 9三体三体9 9叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大1010三体三体1010叶舌有毛，叶片直立，育性正常叶舌有毛，叶片直立，育性正常1111三体三体1111拟正常，需细胞学鉴定拟正常，需细胞学鉴定1212三体

11、三体1212外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高如：水稻IR36初级三体的形态特征又如：又如：小麦和黑麦杂交创造的小麦和黑麦杂交创造的1RS/1BL易位系，在易位系，在1RS上携带有抗锈病和抗白粉病等基因。根上携带有抗锈病和抗白粉病等基因。根据据1RS/1BL染色体在小麦背景中不呈现次缢染色体在小麦背景中不呈现次缢痕，看不到随体，痕，看不到随体，1RS特有的特有的C带带型等细带带型等细胞学证据，可以判断后代是否携带有所需胞学证据，可以判断后代是否携带有所需要的来自黑麦的抗性基因。要的来自黑麦的抗性基因。n染色体带型：染色体带型：C带、带、N带、带、G

12、带等带等n带型特征带型特征指染色体经特殊染色显带后，带指染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，可以反的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，可以反映出常染色质和异染色质的分布。映出常染色质和异染色质的分布。n染色体的分带技术：染色体的分带技术：G带：用吉姆沙（带：用吉姆沙（Giemsa）染色产生的带；）染色产生的带；Q带：用荧光染料染色产生的带；带：用荧光染料染色产生的带；R带：与带：与G带相反的带；带相反的带；C带：显示组成型异染色质的带。带：显示组成型异染色质的带。人类细胞遗传学高分辨显带命名人类细胞遗传学高分辨显带命名国际体制（国际体制（1980）：）：n染色体的短臂以染色体的短

13、臂以p表示，长臂以表示，长臂以q表示；表示；每个臂再划分为区（每个臂再划分为区（region）；）；每个区再划分为带（每个区再划分为带（band）。）。例如，例如，12p14代表第代表第12染色体短染色体短臂上第臂上第1区第区第4带，而带，而9q34代表第代表第9染色体长臂上第染色体长臂上第3区第区第4带。带。带型特征细胞学标记的优缺点：细胞学标记的优缺点：优点：优点：细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的细胞学标记克服了形态标记易受环境影响的缺点缺点缺点：缺点：材料的获得需要花费大量的人力材料的获得需要花费大量的人力物力进行培育；物力进行培育；（2）某些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，）

14、某些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，甚至不适应而死亡，耐受性较差，难以获得相应甚至不适应而死亡，耐受性较差，难以获得相应的标记材料；的标记材料；（3）有些标记伴有对生物有害的表型效应；还有些）有些标记伴有对生物有害的表型效应；还有些标记的鉴定比较困难，虽能把基因定位在某染色标记的鉴定比较困难，虽能把基因定位在某染色体上，但仍不能精确定位；体上，但仍不能精确定位；（4）可资利用的标记数量有限）可资利用的标记数量有限三、生化标记三、生化标记Isozyme）Allozymes n种子贮藏蛋白标记：种子贮藏蛋白标记：种子贮藏蛋白的种类：包括白蛋白、球蛋种子贮藏蛋白的种类：包括白蛋白、球蛋白、醇溶蛋

15、白、谷蛋白等白、醇溶蛋白、谷蛋白等原理：不同品种蛋白的结构和数量不同；原理：不同品种蛋白的结构和数量不同；方法：蛋白方法：蛋白PAGE电泳法电泳法利用：种子纯度鉴定，品种识别等利用：种子纯度鉴定，品种识别等n同功酶及等位酶标记同功酶及等位酶标记同功酶是指具有相同催化功能而结构及理同功酶是指具有相同催化功能而结构及理化性质又不同的一类酶，其结构的差异来化性质又不同的一类酶，其结构的差异来源于基因类型的差异，因此并不一定是同源于基因类型的差异，因此并不一定是同一基因的产物。一基因的产物。等位酶：是同一座位上的不同的等位基因等位酶：是同一座位上的不同的等位基因引起的引起的利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰

16、胺凝胶电利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶谱。泳检测酶谱。同功酶标记是一种共显性标记水稻部分同工酶基因同工酶基因座位染色体 等位基因酸性磷酸酯酶Acp-1120-3Acp-2120,3Acp-4 71,2乙醇脱氢酶Adh-1110-3-淀粉酶Amy-1 70-3过氧化氢酶Cat-1 60-3酯酶Est-2 60,1,2Est-3 91,2Est-5 10,1,2Est-7 70,1Est-9 71,2资料来源：Rice Genet.News.Vol.7。n优点：蛋白质标记是基因表达的产物，与形优点：蛋白质标记是基因表达的产物，与形态和细胞学特征相比，数量上更丰富，可直态和细胞学特征相

17、比，数量上更丰富，可直接采集组织、器官等少量样品分析，克服了接采集组织、器官等少量样品分析，克服了整株直接取样的缺点，直接反应基因产物的整株直接取样的缺点，直接反应基因产物的差异，受环境影响小。差异，受环境影响小。n不足：标记的数量还是比较有限，特别是酶不足：标记的数量还是比较有限，特别是酶蛋白标记需要特殊的显色方法和技术；某些蛋白标记需要特殊的显色方法和技术；某些酶的活性具有发育和组织特异性；或仅局限酶的活性具有发育和组织特异性；或仅局限于反映基因组编码区的表达信息等。于反映基因组编码区的表达信息等。生化标记的优缺点：形态标记、细胞学标记、生化标记存在形态标记、细胞学标记、生化标记存在的问题

18、是：的问题是：这些标记在数量上都是有限的。虽然经过近这些标记在数量上都是有限的。虽然经过近百年的努力，目前这些标记的数量仍然不百年的努力，目前这些标记的数量仍然不多，因此限制了这些标记的利用。多，因此限制了这些标记的利用。细胞学和生化标记在操作上比较麻烦，难以细胞学和生化标记在操作上比较麻烦，难以开展大规模的研究和利用。开展大规模的研究和利用。四、分子标记四、分子标记n广义的分子标记是指可遗传的、并可检测的广义的分子标记是指可遗传的、并可检测的DNA序列或蛋白质。序列或蛋白质。n狭义的分子标记仅指狭义的分子标记仅指DNA标记，是以染色体标记，是以染色体DNA上特定的核苷酸序列作为标记。上特定的

19、核苷酸序列作为标记。n分子标记是直接反映分子标记是直接反映DNA水平上的遗传多态水平上的遗传多态性的标记，表现为核苷酸序列的任何差异。性的标记，表现为核苷酸序列的任何差异。分子标记的种类非常多！分子标记的种类非常多！nRFLP:Restriction Fragment Length Polymorphisms（限制性片段长度多态性）（限制性片段长度多态性）nVNTR:Variable Number of Tandem Repeats（可变数目的串连重复序列标记）（可变数目的串连重复序列标记）nRAPD:Random Amplified Polymorphic DNA（随机扩增多态性（随机扩增多

20、态性DNA）n DAF:DNA Amplification Fingerprinting（DNA扩增指纹）扩增指纹）nSSR:Simple Sequence RepeatsnSCAR:Sequence-characterized Amplified regions nSTS:Sequence Tag SitenAFLP:Amplified Fragment Length Polymorphisms nCAPS:Cleaved Amplification Polymorphism Sequence-tagged SitesnSNP:Single Nucleotide Polymorphisms

21、n EST:Expressed sequence tagsn第二节第二节 分子标记的类型及原理分子标记的类型及原理 一、基于分子杂交技术的分子标记一、基于分子杂交技术的分子标记Restriction fragment length polymorphism 译为限制性片段长度多译为限制性片段长度多态性，是基于态性，是基于DNA序列上的变化而造成限序列上的变化而造成限制性内切酶的酶切位点的增减，或限制性制性内切酶的酶切位点的增减，或限制性酶切片段长度发生变化。酶切片段长度发生变化。RFLP分析是限制性内切酶、核酸电泳、印分析是限制性内切酶、核酸电泳、印迹（迹（blot）技术、探针杂交技术的综合应

22、用。）技术、探针杂交技术的综合应用。是出现最早，利用最广的一种分子标是出现最早，利用最广的一种分子标记，特别在遗传图谱构建的应用。记，特别在遗传图谱构建的应用。发展历史：RFLP标记在20世纪70年代被认识，随着分子杂交、放射性自显影技术的完善；到1980年，人类遗传学家Botstein 等构建了第一张病毒的RFLP遗传图谱；1987年Donis-keller构建了第一张人类的RFLP遗传图谱；以后在微生物、植物、动物和人类上都得到了广泛的利用。目前，该技术已广泛应用于遗传图谱的构建、基因定位、遗传进化研究、标记辅助选择等nRFLPRFLP基本原理是：利用特定的限制性内切酶基本原理是：利用特定

23、的限制性内切酶（restriction enzymesrestriction enzymes，RE RE）消化不同生物）消化不同生物个体的基因组个体的基因组DNADNA，得到许多大小不等的，得到许多大小不等的DNADNA片段，片段，反映反映DNADNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过琼分子上不同酶切位点的分布情况。通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离这些片段后，将其按原脂糖凝胶电泳按大小分离这些片段后，将其按原来的位置顺序转移到尼龙膜或硝酸纤维膜上，再来的位置顺序转移到尼龙膜或硝酸纤维膜上，再用经放射性同位素或非放射性物质标记过的探针用经放射性同位素或非放射性物质标记过的探针与之杂交，若某一位置上的

24、与之杂交，若某一位置上的DNADNA酶切片段与探针有酶切片段与探针有同源性，通过碱基互补，标记好的探针就结合到同源性，通过碱基互补，标记好的探针就结合到这个位置上，经放射自显影或酶学检测，可显示这个位置上，经放射自显影或酶学检测，可显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性情出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性情况，即形成不同带谱，反映个体特异性的况，即形成不同带谱，反映个体特异性的RFLPRFLP图图谱。谱。RFLPn基本步骤：基本步骤：基因组DNA酶切DNA 琼脂糖电泳Southern转移DNA预杂交DNA探针放射性标记探针放射性自显影分子杂交DNA提取：提取：n选取适当的生物体样品

25、（生长旺选取适当的生物体样品（生长旺盛、黄化苗），液氮中研磨，加盛、黄化苗），液氮中研磨，加入入DNA提取液（提取液（Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS、CTAB等），充分等），充分提取后，加入抽提液（酚、氯仿、提取后，加入抽提液（酚、氯仿、异戊醇）混匀离心除去蛋白质，异戊醇）混匀离心除去蛋白质，加入加入RNA酶除去酶除去RNA，再用乙醇，再用乙醇沉淀沉淀DNA，TE溶解，即可使用或溶解，即可使用或-20保存备用。保存备用。限制性片段的产生：限制性片段的产生：n取出适量样品取出适量样品DNA，加入，加入buffer，用相应的，用相应的限制性内切酶消化限制性内切酶消化DNA。不同的限制

26、性内切酶消化同样的基因组不同的限制性内切酶消化同样的基因组DNA时，结果不同；时，结果不同；同样的限制性内切酶消化不同的基因组同样的限制性内切酶消化不同的基因组DNA时，结果也不同。时，结果也不同。酶切示意图：酶切示意图：Characteristics of Some Restriction Endonucleases Number of CleavageEnzyme Organism from which Recognition Sequence Sites in DNA from:Name Enzyme is located and Position of Cut pBR322Bam HI

27、 Bacillus amyloliquefaciens H 5 G GATC C 3 5 1 3 C CTAG G 5Bgl IIBacillus globigi A GATC T 5 0 T CTAG AEco RIE.coli RY 13 G AATT C 5 1 C TTAA GHind IIIHaemophilus influenzae Rd A AGCT T 6 1 T TCGA APst IProvidencia stuartii C TGCA G18 1 G ACGT CSal IStreptomyces albus G G TCGA C 2 1 C AGCT GHae IIIH

28、aemophilus egyptius GG CC 5026 CC GGHha IHaemophilus hemolyticus G CG C 5031 C GC G 电泳（电泳（electrophosis）：）：n载体：电泳用的凝胶由琼载体：电泳用的凝胶由琼脂糖（脂糖（agarose）制备，）制备，琼脂糖的浓度通常为琼脂糖的浓度通常为0.9-1.0%。n作用：酶切后的作用：酶切后的DNA样样品通过电泳，使品通过电泳，使DNA片片段分离段分离,并按分子量的大并按分子量的大小排列。小排列。Southern blotting：n印迹转移是由印迹转移是由E.M.Southern于于1975年发明的，

29、故名。年发明的，故名。DNA从凝胶转移到特制的杂交膜上（硝酸纤维尼龙膜）。从凝胶转移到特制的杂交膜上（硝酸纤维尼龙膜）。n杂交膜的制备：杂交膜的制备：DNA从凝胶转移到特制的杂交膜上，常用从凝胶转移到特制的杂交膜上，常用Hybond N+（Amersham）的尼龙膜。的尼龙膜。凝胶的处理：凝胶的处理：脱嘌呤处理：脱嘌呤处理：0.25M HCl 变性处理：变性处理：0.4M NaOHDNA转移：转移：转移液：转移液：20 xSSC缓冲液（和缓冲液（和NaOH溶液）溶液）洗膜：洗膜：洗膜液：洗膜液：2xSSC缓冲液缓冲液探针的制备探针的制备n用于用于RFLP分析的探针（分析的探针（probe）是）

30、是DNA片段，长片段，长度约度约0.5-2.5kb。n探针的来源有：基因组的随机片段、探针的来源有：基因组的随机片段、cDNA 等。等。高度的保守性，即它的同源序列不能太多。高度的保守性，即它的同源序列不能太多。n探针以克隆的方式保存，以质粒（探针以克隆的方式保存，以质粒（plasmid）为载）为载体，如体，如pUC19等，通过大肠杆菌繁殖。等，通过大肠杆菌繁殖。探针的标记探针的标记(labeling)：n利用放射性同位素（利用放射性同位素（32P-dCTP）等对探针进行标）等对探针进行标记，以跟踪探针。记，以跟踪探针。n同位素标记探针的获得方法：利用同位素标记探针的获得方法：利用DNA聚合酶

31、聚合酶（Klenow），在），在DNA复制的过程中，把复制的过程中，把32P-dCTP合成到合成到DNA片段上。片段上。DNA杂交：杂交：预杂交预杂交:（用非特异性（用非特异性DNA分子将待测核酸分子将待测核酸分子中的非特异性位点封闭）分子中的非特异性位点封闭）杂交液杂交液+鲑精鲑精DNA(sheared salmon sperm DNA,SSS DNA)杂交液杂交液:20 X SSPE 250 ml100 X Denhardts 50 ml10%(w/v)SDS 50 mlMake up to 1000 ml 65 C保温，保温，2小时以上。小时以上。杂交杂交:把经预杂交的杂交膜放到已加入探

32、针杂交把经预杂交的杂交膜放到已加入探针杂交液中。液中。65 C过夜。过夜。洗膜：洗膜：洗掉没有杂交上的探针洗掉没有杂交上的探针A.2X SSC,0.1%SDS，65 C，20 min；B.1X SSC,0.1%SDS，65 C，20 min；C.0.5X SSC,0.1%SDS，65 C，20 min放射性自显影放射性自显影包膜包膜:用塑料薄膜把已杂交的杂交膜包起来。放用塑料薄膜把已杂交的杂交膜包起来。放入暗盒中。入暗盒中。照射：照射：放入放入X光片，紧压。光片，紧压。-80 C冷柜中曝光冷柜中曝光2-4天。天。显影：显影：在暗房中取出在暗房中取出X光片，显影、定影、冲冼。光片，显影、定影、冲

33、冼。一张杂交膜可以用多个探针去杂交同样的探针，不同的RE,结果差别很大以cphy5 作探针得到的放射自显影图谱所用限制性内切酶为Hpa 和M sp。水稻品种:1、农垦58;2、农垦58S(幼苗);3、农垦58S(育性转换期);4、W 6154S。右侧为分子量标记K2Eco R I+H ind二、基于二、基于PCR技术的分子标记技术的分子标记nPCR(polymerase chain reaction)即聚合酶即聚合酶链式反应，是一种链式反应，是一种DNA体外扩增，是由美体外扩增，是由美国国Cetus公司人类遗传实验室的公司人类遗传实验室的Mullis K.B.等人于等人于1983年发明的。年发

34、明的。nPCR发明的故事发明的故事:nPCR发明是一件有趣的事，对科学工作者发明是一件有趣的事，对科学工作者很有启迪。很有启迪。PCR发现的几个重要事件：发现的几个重要事件：1983年年12月月16日，第一次成功地完成日，第一次成功地完成PCR实验；实验；（这个春天时的想法，经过三个月断断续续的实（这个春天时的想法，经过三个月断断续续的实验，终于在圣诞节前成为现实）验，终于在圣诞节前成为现实）1984年，申请发明专利；年，申请发明专利；1985年，在年，在Science上发表简短的报导；上发表简短的报导；1986年，在美国冷泉巷实验室年会上报告；年，在美国冷泉巷实验室年会上报告；1987年，完

35、成年，完成PCR的自动化装置（的自动化装置（PCR仪）；仪）；1991年，与年，与DuPont公司对簿公堂；公司对簿公堂；1993年，获诺贝尔奖。年，获诺贝尔奖。与与DuPont对簿公堂：对簿公堂：1987年，年，DuPont找找Cetus，希望获得，希望获得PCR的授权。的授权。Cetus说说“不不”。1991年，正当年，正当“沙漠风暴沙漠风暴”席卷伊拉克席卷伊拉克时，时，DuPont与与Cetus在加利福尼亚联邦法院在加利福尼亚联邦法院的法庭上，摆开了对阵的架势。的法庭上，摆开了对阵的架势。DuPont认为，认为，PCR早就发明了，早就发明了，PCR的的发明权不属发明权不属Cetus。Du

36、Pont的证据主要是：的证据主要是：（1）Kornberg 早在早在1957年就发现了聚合酶。年就发现了聚合酶。Kornberg出庭作证，那时谁想做出庭作证，那时谁想做PCR都能做，都能做，Mullis只是第一个需要做这种试验而已。只是第一个需要做这种试验而已。（2）Kleppe于于1971年提出了体外合成年提出了体外合成DNA的原的原理。理。（3）Panet等等1974年对年对DNA体外复制作了描述，体外复制作了描述，并有做试验的打算。并有做试验的打算。Cetus反驳：反驳：（1）Kornberg在在1983年出版的年出版的DNA复制复制教教科书，并没有关于科书，并没有关于PCR的论述，说明

37、那时还没有的论述，说明那时还没有这方面的知识。这方面的知识。（2）到）到1989年，关于年，关于PCR的文章有的文章有2000多篇，多篇，没有没有1篇怀疑篇怀疑PCR是在是在1985发展起来的。发展起来的。n审判持续了两个月。最后，审判持续了两个月。最后，Cetus以以58票对票对0票胜票胜诉。诉。由于每一周期所产生的DNA均能成为下一次循环的模板(template)，所以PCR产物以指数方式增加，经过2535次周期之后，理论上可增加109倍(230=107109)，实际上至少可扩增105，一般可106107。nPCR技术的基本原理技术的基本原理:9 0 变 性 解 链与 引 物 退 火，5

38、0 引 物 及 延 伸，7 5 n 次 扩 增第一次循环第二次循环3 5 3 5 3 5 5 3 5 3 3 5 5 3 3 5 3 3 5 3 3 5 5 5 3 5 5 3 9 0 变 性 解 链与 引 物 退 火，5 0 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 引 物 及 延 伸，7 5 3 3 5 3 3 5 5 5 3 3 5 3 3 5 5 5 PCR原理示意图n其主要步骤是其主要步骤是:n高温变性高温变性(Denaturation)(94 C)：置待扩增：置待扩增DNA于高温下解链成为单链于高温下解链成为单链DNA模板。模板。n低温退火低温退火(复性复性)

39、(Annealing)(3065 C)：引：引物与模板结合，为延伸奠定基础。人工合物与模板结合，为延伸奠定基础。人工合成的两个寡聚核苷酸引物在低温条件下分成的两个寡聚核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合。别与目的片段两侧的两条链互补结合。n适温延伸适温延伸(extension)(6575 C)：DNA聚聚合酶在合酶在72 C将单核苷酸从引物将单核苷酸从引物3端开始掺入端开始掺入,沿模板沿模板53方向延伸，合成方向延伸，合成DNA新链。新链。nTaqDNA聚合酶：聚合酶：n在在PCR中，最初使用的是大肠杆菌中，最初使用的是大肠杆菌DNA聚聚合酶合酶I的的Klenow片段。由于

40、该酶不能耐受反片段。由于该酶不能耐受反应循环中解链所需的高温（应循环中解链所需的高温（93 C-95 C），），因此在反应过程中必须不断补加聚合酶以因此在反应过程中必须不断补加聚合酶以满足每次扩增的需要。这样造成操作繁琐，满足每次扩增的需要。这样造成操作繁琐，反应低效及费用增加。另一方面，由于反应低效及费用增加。另一方面，由于Klenow片段聚合反应温度低（片段聚合反应温度低（37 C），容），容易形成引物与易形成引物与DNA模板的非专一性配对，模板的非专一性配对，或受某些或受某些DNA二级结构干扰，结果产生许二级结构干扰，结果产生许多非专一性的产物带。多非专一性的产物带。nTaq酶的性质：酶

41、的性质：nTaq DNA聚合酶是从生长在温泉中的水生栖热菌聚合酶是从生长在温泉中的水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离纯化出来的。这种）中分离纯化出来的。这种栖热菌能在栖热菌能在70 C-75 C中生长。中生长。Taq DNA聚合酶的聚合酶的分子量为分子量为93.9kD，活性可达，活性可达200,000U/mg蛋白。蛋白。nTaq DNA聚合酶的功能是：在有四种核苷酸三磷聚合酶的功能是：在有四种核苷酸三磷酸盐的反应系统中，以高温变性的酸盐的反应系统中，以高温变性的DNA为模板，为模板，从分别结合在模板从分别结合在模板DNA两端的引物为出发点，按两端的引物为出发点，按5 3的方

42、向，沿着模板顺序合成新链。的方向，沿着模板顺序合成新链。nTaq DNA聚合酶具有较高的热稳定性。以实验为聚合酶具有较高的热稳定性。以实验为证，将反应系统分别置于证，将反应系统分别置于92.5 C、95 C、97.5 C，分别经过分别经过130分钟、分钟、40分钟和分钟和5-6分钟后，分钟后，Taq DNA聚合酶的活性仍保持聚合酶的活性仍保持50%。50 100 150 温度掺入的H-dNTTP微克分子数3相对酶活的分率20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 95 90 70 反应时间（分）掺入的H-dNTTP微克分子数320 40 60 80 25 50 75

43、 Mg二价阳离子浓度（mM)Mn+掺入的H-dNTTP微克分子数3100 200 6 7 8 9 10 pH1 2 3 1.25 mM磷酸缓冲液2.25 mMTris-HCl缓冲液3.25 mM甘氨酸缓冲液Taq DNA聚合酶的特性n影响酶活性的因素：影响酶活性的因素：n温度：虽然温度：虽然Taq DNA聚合酶有很强的温度适应范聚合酶有很强的温度适应范围，但高于围，但高于90 C的环境仍会使部分酶变性失活。的环境仍会使部分酶变性失活。反之，如果温度过低，不但酶活性受影响，而且反之，如果温度过低，不但酶活性受影响，而且由于引物在低温下由于引物在低温下(特别是特别是25 C-27 C)可能与基因可

44、能与基因组中别的部分同源的序列结合，使得一些扩增产组中别的部分同源的序列结合，使得一些扩增产物并非为目的序列。适当提高温度，错配碱基多物并非为目的序列。适当提高温度，错配碱基多会解离，反应产物的特异性增加。会解离，反应产物的特异性增加。Taq DNA聚合聚合酶的最适应温度为酶的最适应温度为70 C。nMg+的浓度：的浓度：Taq DNA聚合酶活性对聚合酶活性对Mg+的浓的浓度非常敏感。度非常敏感。Taq DNA聚合酶与其它聚合酶一样，聚合酶与其它聚合酶一样，是是Mg+依赖性酶。测定表明，在依赖性酶。测定表明，在MgCl2为为2.0mM的条件下，酶的活性显示最高。的条件下，酶的活性显示最高。nK

45、+的浓度：的浓度：KCl的最适浓度是的最适浓度是50mM，高于，高于75mM时，聚合反应受到明显的抑制。时，聚合反应受到明显的抑制。PCR反应液（例子）反应液（例子）:10 x PCR buffer2.515mM MgCl22.5 (可变可变)1mM dNTP5.0Taq(1u)1.0 (可变可变)Primer(100ng/l)1.0 x 2Genomic DNA(20ng/l)5.0H2O7Total 25.0(l)10 x PCR buffer：500mM KCl200mM Tris-HCl（pH8.2）0.01%gelatin Random amplified polymorphic D

46、NA 该技术是在该技术是在1990年由年由Williams 等人以等人以PCR聚聚合酶链式反应为基础提出来的。合酶链式反应为基础提出来的。n它是利用任意寡聚脱氧核苷酸单链的片段它是利用任意寡聚脱氧核苷酸单链的片段（810bp）为引物，通过）为引物，通过PCR扩增染色体扩增染色体组中的组中的DNA，所获得长度不同的，所获得长度不同的DNA片段，片段，通过电泳分离后，经染色显示扩增片段的通过电泳分离后，经染色显示扩增片段的多态性。它反映因碱基突变而引起引物结多态性。它反映因碱基突变而引起引物结合位置变化，或在引物结合位点间因合位置变化，或在引物结合位点间因DNA的插入或缺失而引起的扩增片段长度的变

47、的插入或缺失而引起的扩增片段长度的变化。化。nRAPD的基本原理与的基本原理与PCR技术原理相同，是技术原理相同，是随机扩增的随机扩增的PCR技术，与一般技术，与一般PCR的主要的主要差异是利用随机引物。引物通常是差异是利用随机引物。引物通常是10核苷酸核苷酸的长度，引物是随机设计的，因此利用的长度，引物是随机设计的，因此利用RAPD引物通常可以从基因组中扩增出多个引物通常可以从基因组中扩增出多个DNA片段。片段。RAPD的带型通常为显性。的带型通常为显性。A-01 CAGGCCCTTC5335ABCDDACB若位点2处碱基发生改变，则:随机引物随机引物BA 2142扩增的扩增的RAPD 条带

48、条带1.marker;2 6.冬油菜冬油菜;7 14.南方油白菜南方油白菜;15 21.春油菜春油菜P rimer Sagon230 P rimer Sagon293花生花生12 个品种个品种DNA 用随机引物用随机引物S230 和和S293 的扩增图谱的扩增图谱注注:M=PCR Markers，1 12=peanut cultivars不需不需DNA探针，技术简单，操作自动化程度探针，技术简单，操作自动化程度高，检测快速，不涉及分子杂交和放射性自高，检测快速，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；显影等技术；所需所需DNA样品量少，对样品样品量少，对样品DNA质量要求低；质量要求低；引物无种族

49、特异性，即不依赖于种属特异性引物无种族特异性，即不依赖于种属特异性和基因组结构；和基因组结构；引物价格便宜，成本较低；引物价格便宜，成本较低；设计引物也无须知道设计引物也无须知道DNA序列信息。序列信息。nRAPD的缺点：的缺点：通常是显性标记，极少数共显性，不能鉴通常是显性标记，极少数共显性，不能鉴别纯合子与杂合子；别纯合子与杂合子；存在共迁移，只能分开不同长度存在共迁移，只能分开不同长度DNA片段，片段，不能分开长度相同而碱基序列不同的片段；不能分开长度相同而碱基序列不同的片段；影响因素多，如：影响因素多，如：template DNA、primer、Mg2+等，稳定性和重复性差，结果可靠性

50、等，稳定性和重复性差，结果可靠性较低。较低。RFLP具有分子标记较多、多态率高、共显性等优点，可以对整个基因组作指纹分析，但其技术较为复杂。PCR具有技术比较简单，适应大量自动化作业，但特异性引物不易发展，数量有限，难以用作指纹分析。AFLPRFLP和PCR的技术都有许多优点，但也都存在一些不足之处。Amplified fragment length polymorphism 译为扩增片段长度多态性。是译为扩增片段长度多态性。是荷兰荷兰Keygene公司的科学家公司的科学家Zabeau Marc.和和Vos Pieter.发明创造的一种发明创造的一种DNA分子标记。该技术是分子标记。该技术是对