CN1植物蛋白质组讲议(第一章)课件.ppt

1、植物蛋白质组学植物蛋白质组学 崔娜崔娜 沈阳农业大学生物科学技术学院沈阳农业大学生物科学技术学院第一章第一章 导论导论第二章第二章 蛋白质提取与样品制备蛋白质提取与样品制备第三章第三章 双向凝胶电泳双向凝胶电泳第四章第四章 电泳图谱的图像分析电泳图谱的图像分析第五章第五章 生物质谱技术与蛋白质鉴定生物质谱技术与蛋白质鉴定第六章第六章 蛋白质组研究中的定量方法蛋白质组研究中的定量方法第七章第七章 蛋白质相互作用和蛋白质芯片蛋白质相互作用和蛋白质芯片第八章第八章 蛋白质组技术在植物科学中的应用蛋白质组技术在植物科学中的应用目目 录录第一章第一章 导论导论第一节第一节 蛋白质组学研究的历史和背景蛋白

2、质组学研究的历史和背景基因研究是基因研究是2020世纪生命科学的主线。世纪生命科学的主线。20 20 世纪的上半叶，以遗传学为代表，生命科学通过对世纪的上半叶，以遗传学为代表，生命科学通过对基因分离、独立配对、连锁及化学属性等的研究，最后以基因分离、独立配对、连锁及化学属性等的研究，最后以作为遗传信息载体的作为遗传信息载体的 DNA DNA 双螺旋结构的提出而告捷。双螺旋结构的提出而告捷。20 20 世纪下半叶，以分子生物学为代表，生命科学通过对基世纪下半叶，以分子生物学为代表，生命科学通过对基因复制、转录、翻译及遗传密码的分析与破译，最终以统一生因复制、转录、翻译及遗传密码的分析与破译，最终

3、以统一生命世界各层次、生命科学各分支的命世界各层次、生命科学各分支的“中心法则中心法则”的问世而集成的问世而集成。中心中心法则（法则（The The C Central entral D Dogmaogma）人类基因组计划人类基因组计划2020世纪的三大科技工程之一世纪的三大科技工程之一后基因组时代（后基因组时代（post genome erapost genome era）的到来）的到来蛋白质组学是功能基因组学的核心内容蛋白质组学是功能基因组学的核心内容首个中国人基因组图谱绘制完成 2007 2007年年1010月月1111日宣布成功绘制完成第一个完整中国人基因组图谱日宣布成功绘制完成第一个

4、完整中国人基因组图谱(又称又称“炎黄炎黄一号一号”)，这也是第一个亚洲人全基因序列图谱。，这也是第一个亚洲人全基因序列图谱。该项目由来自深圳华大基因研究院、生物信息系统国家工程研究中心及中国科该项目由来自深圳华大基因研究院、生物信息系统国家工程研究中心及中国科学院北京基因研究所的科学家共同发起并承担。学院北京基因研究所的科学家共同发起并承担。这项在基因组科学领域里程碑式的科学成果，对于中国乃至亚洲人的这项在基因组科学领域里程碑式的科学成果，对于中国乃至亚洲人的DNADNA、隐、隐形疾病基因、流行病预测等领域的研究具有重要作用。形疾病基因、流行病预测等领域的研究具有重要作用。Megabace 测

5、序仪测序仪3700 测序仪测序仪高等真核生物的开放阅读框架的确定；现有基因的识别技术高等真核生物的开放阅读框架的确定；现有基因的识别技术只适用于原核生物或低等真核生物只适用于原核生物或低等真核生物生物基因组只能表达部分基因，而且表达的基因类型和程度生物基因组只能表达部分基因，而且表达的基因类型和程度随生物生存环境及内在状态有极大的差异随生物生存环境及内在状态有极大的差异基因组计划无法告诉哪些基因在何时何地以何种程度表达基因组计划无法告诉哪些基因在何时何地以何种程度表达mRNAmRNA本身存在着贮存、运转、降解、翻译调控及产物的翻译本身存在着贮存、运转、降解、翻译调控及产物的翻译后的修饰加工。后

6、的修饰加工。调控蛋白的化学修饰不仅改变了蛋白的立体结构还改变了蛋调控蛋白的化学修饰不仅改变了蛋白的立体结构还改变了蛋白功能调节的功能基础，基因编码测序无法预测白功能调节的功能基础，基因编码测序无法预测基因是遗传信息的源头，而功能蛋白是基因功能的执行体基因是遗传信息的源头，而功能蛋白是基因功能的执行体基因组计划的局限性基因组计划的局限性蛋白质是细胞赖以生存的各种代谢和调控功能的主要执行体蛋白质是细胞赖以生存的各种代谢和调控功能的主要执行体蛋白质是多种致病因子对机体作用最重要的靶分子蛋白质是多种致病因子对机体作用最重要的靶分子蛋白质是大多数药物的靶标及至直接的药靶蛋白质是大多数药物的靶标及至直接的

7、药靶药靶是形成制药业的发展源头药靶是形成制药业的发展源头2020世世9090年代中期年代中期 寻找治疗人类疾病新药的药靶共约寻找治疗人类疾病新药的药靶共约483483种，种，它们主要是蛋白质它们主要是蛋白质全世界使用的全世界使用的20002000多种药物，其中多种药物，其中85%85%是针对此是针对此483483种药靶种药靶根据目前人类根据目前人类100-150100-150种疾病，应有种疾病，应有3000-150003000-15000种蛋白质具种蛋白质具有靶标的可能。有靶标的可能。蛋白质组学是功能基因组学的核心内容蛋白质组学是功能基因组学的核心内容 近年来新型功能蛋白的不断发现，为人类近年

8、来新型功能蛋白的不断发现，为人类征服癌症、艾滋病、帕金森氏症、老年痴征服癌症、艾滋病、帕金森氏症、老年痴呆症、糖尿病等开辟了光明前景。呆症、糖尿病等开辟了光明前景。日本国立癌症中心：乳铁蛋白具有预防大肠癌发生与日本国立癌症中心：乳铁蛋白具有预防大肠癌发生与 扩散的作用，计划从牛奶中提取它并制成抗癌药物。扩散的作用，计划从牛奶中提取它并制成抗癌药物。上海药物所等单位：完成上海药物所等单位：完成SARSSARS病毒的病毒的3 3个关键蛋白的表个关键蛋白的表 达，并进行了初步的验证。其中一种蛋白已用于达，并进行了初步的验证。其中一种蛋白已用于 抗抗SARSSARS病毒药物的体外筛选。病毒药物的体外筛

9、选。O OFarrel PHFarrel PH与与19751975年发现了二维电泳技术年发现了二维电泳技术蛋白质图象分析系统与软件以及大规模样品处理蛋白质图象分析系统与软件以及大规模样品处理系统开发技术系统开发技术8080年代出现的年代出现的HillenkampHillenkamp发明的激光解吸质谱发明的激光解吸质谱 ，FennFenn设计的电喷雾质谱设计的电喷雾质谱建立了肽质量指纹图谱与肽序列标签等建立了肽质量指纹图谱与肽序列标签等蛋白质研究方法的突破蛋白质研究方法的突破第二节第二节 蛋白质组学的概念、技术路线及国内外现状蛋白质组学的概念、技术路线及国内外现状一、概念一、概念 PROTEOM

10、E：PROTEin与与genOME的杂合的杂合 蛋白质组学是研究活细胞内基因组编码的全部蛋白质功能的科学。它蛋白质组学是研究活细胞内基因组编码的全部蛋白质功能的科学。它是功能基因组学的是功能基因组学的“中流砥柱中流砥柱”，是联系基因组序列与细胞功能的重要学，是联系基因组序列与细胞功能的重要学科。科。Proteome包括了一个基因组、一种生物或一种细胞包括了一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全组织所表达的全套蛋白质。套蛋白质。一门交叉学科一门交叉学科 物理学物理学 数学数学 化学化学 计算机科学计算机科学 生物信息学生物信息学 基因组基因组 转录组转录组 蛋白组蛋白组二、蛋白质组研究的

11、相关技术与技术路线二、蛋白质组研究的相关技术与技术路线 双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术和质谱技术术和质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。图象分析系统，如图象分析系统，如PDQUEST PDQUEST、Image MasterImage Master等等 蛋白质鉴定方法：氨基酸组成分析、序列测定、肽质蛋白质鉴定方法：氨基酸组成分析、序列测定、肽质量指纹图（量指纹图（PMF）、相对分子量）、相对分子量 高通量系统（高通量系统（HTS）与大规模样品处理机器人）与大规模样品处理机器人 数据库

12、设置与检索系统数据库设置与检索系统 新型质谱技术，如新型质谱技术，如MALDI-TOF MS，ESI/MS/MS蛋白组研究的三个主要步骤：蛋白组研究的三个主要步骤：Separationofindividualproteinsby2-Dpolyacrylamidegelelectrophoresis(2-DPAGE)IdentificationbymassspectrometryorN-terminalsequencingofindividualproteinsrecoveredfromthegelStorage,manipulation,andcomparisonofthedatausingb

13、ioinformatics生物学问题生物学问题的提出的提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备蛋白样品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现新蛋白质的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得Gel StainingFirst Dimension IEFSecon

14、d Dimension SDS-PAGEImaging and AnalysisSpot ExcisionSample PreparationProteomics Experimental Workflow五、国内外现状五、国内外现状(一一)国外研究现状国外研究现状1.研究机构的快速形成研究机构的快速形成澳大利亚澳大利亚(1997)1.Center for Protome Research and Gene Product Mapping proteome,National Inovation Centre2.Australia Proteome Analysis Facility3.1997

15、年澳大利亚建立蛋白质组研究中心年澳大利亚建立蛋白质组研究中心(APAF)美国（美国（1997）Proemem,Inc.Beverly,MA Large Scale Biology Corp,Rockvile,MD美国国立肿瘤研究所投入美国国立肿瘤研究所投入1000多万美元研究直肠多万美元研究直肠乳腺乳腺卵巢等肿瘤的蛋白质数据库卵巢等肿瘤的蛋白质数据库美国肿瘤研究所药物管理局联合投入数百万美元开展不同发病阶段和治疗阶段的美国肿瘤研究所药物管理局联合投入数百万美元开展不同发病阶段和治疗阶段的肿瘤蛋白质组数据库肿瘤蛋白质组数据库美国能源部最近启动了环境和能源相关的微生物和低等生物的蛋白质组研究美国能

16、源部最近启动了环境和能源相关的微生物和低等生物的蛋白质组研究美国美国Celera投资上亿美元于此研究投资上亿美元于此研究.欧洲欧洲欧共体资助了酵母菌蛋白质组研究欧共体资助了酵母菌蛋白质组研究英国资助了三个研究中心英国资助了三个研究中心,对基因组测序已完成或即将完对基因组测序已完成或即将完成的生物进行蛋白质组研究成的生物进行蛋白质组研究.法国资助了法国资助了5个区域性遗传基地个区域性遗传基地,每年获每年获500万美元万美元,主要用主要用于基因组与蛋白质组研究于基因组与蛋白质组研究.德国联邦研究部提供德国联邦研究部提供700多万美元在东德建立了蛋白质组多万美元在东德建立了蛋白质组研究中心研究中心日

17、内瓦蛋白质组公司和布鲁克质谱仪制造公司成立了国际日内瓦蛋白质组公司和布鲁克质谱仪制造公司成立了国际上最大的蛋白质组研究中心上最大的蛋白质组研究中心.丹麦（丹麦（1997）Centre for Proteome Analysis in Life Sciences以以50%速度递增速度递增1995年第一篇蛋白质组论文发表在年第一篇蛋白质组论文发表在electrophoresis论文数激论文数激增增2.研究材料与范围扩大研究材料与范围扩大研究材料研究材料从支原体从支原体Mycoplasma genitalium 真核生物酵母 人体原核生物真核生物单细胞生物多细胞生物组织无需基因计划完成的生物也可研究

18、范围研究范围蛋白质组作图、蛋白质成分鉴定、蛋白质数据库构建、新型蛋白质蛋白质组作图、蛋白质成分鉴定、蛋白质数据库构建、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示、同工体（发掘、蛋白质差异显示、同工体（isoform）比较）比较3.研究进展加快研究进展加快(1)在研究细胞增殖、分化、异常转化、肿瘤在研究细胞增殖、分化、异常转化、肿瘤形成等方面进行了探索。鉴定了肿瘤相关蛋白形成等方面进行了探索。鉴定了肿瘤相关蛋白,为肿瘤早期诊断提供了主要依据为肿瘤早期诊断提供了主要依据.(2)酵母双杂交技术已被用于研究蛋白质群连酵母双杂交技术已被用于研究蛋白质群连锁群和蛋白质功能网络锁群和蛋白质功能网络.(二二)国内蛋白质组

19、学研究现状国内蛋白质组学研究现状 19971997年国家自然科学基金委设立了重大项目，年国家自然科学基金委设立了重大项目，蛋白质组学技术体系建立蛋白质组学技术体系建立 中国科学院生物化学研究所、军事医学科学院中国科学院生物化学研究所、军事医学科学院与湖南师范大学启动蛋白质组学研究与湖南师范大学启动蛋白质组学研究 中国科学院上海生命科学研究院、军事医学科中国科学院上海生命科学研究院、军事医学科学院与复旦大学相继成立了蛋白质组学研究中心学院与复旦大学相继成立了蛋白质组学研究中心 技术平台建设达到国际先进水平技术平台建设达到国际先进水平 重大疾病蛋白质组学发现了一批与肿瘤转移相重大疾病蛋白质组学发现

20、了一批与肿瘤转移相关的蛋白质群关的蛋白质群清华大学结构生物学实验室清华大学结构生物学实验室(蛋白质结构分析数据计算蛋白质结构分析数据计算)中国军事医学科学院中国军事医学科学院-蛋白质组研究中心蛋白质组研究中心蛋白质组工作站蛋白质组工作站中国军事医学科中国军事医学科学院学院-蛋白质蛋白质组研究中心组研究中心蛋白质纯化蛋白质纯化质谱仪质谱仪北京华大蛋白质研究中心有限公司北京华大蛋白质研究中心有限公司 存在的问题存在的问题(1)(1)在植物蛋白质组学研究方面明显滞后在植物蛋白质组学研究方面明显滞后 国内各大学和研究机构刚起步开展蛋白质组学研究国内各大学和研究机构刚起步开展蛋白质组学研究,但限于设备条

21、件和经费但限于设备条件和经费,研究进展与国际前沿有相当距离研究进展与国际前沿有相当距离.(2)(2)专门人才相当匮乏专门人才相当匮乏 国内从事基因组研究人才较多国内从事基因组研究人才较多,但掌握蛋白质组学的但掌握蛋白质组学的专才相对较少专才相对较少.(3)(3)需要建设大型技术平台需要建设大型技术平台,组织团队联合攻关组织团队联合攻关.通过建设平台可减少设备的重复投入通过建设平台可减少设备的重复投入.一、同一性与多样性一、同一性与多样性 基因组作为遗传信息的载体，其主要特征就是同一性。基因组作为遗传信息的载体，其主要特征就是同一性。蛋白质是生命活动的主要执行者，对于不同类型的细胞或蛋白质是生命

22、活动的主要执行者，对于不同类型的细胞或同一细胞在不同的活动状态下，蛋白质的构成是不一样的。同一细胞在不同的活动状态下，蛋白质的构成是不一样的。一个基因组内的基因数目通常是指一个基因组内的基因数目通常是指ORFORF（可读框）的数目，（可读框）的数目，蛋白质组是一个基因组所表达的全部蛋白质，确定了一个蛋蛋白质组是一个基因组所表达的全部蛋白质，确定了一个蛋白质就肯定了一个基因，但确定了一个白质就肯定了一个基因，但确定了一个OFROFR却并不能肯定它会却并不能肯定它会有对应的蛋白质产物。但由于存在有对应的蛋白质产物。但由于存在mRNAmRNA编辑和蛋白质剪切，编辑和蛋白质剪切，许多蛋白质很难找到直接

23、对应的许多蛋白质很难找到直接对应的ORFORF。二、有限与无限二、有限与无限 对于基因组研究而言，核心任务是测定所有对于基因组研究而言，核心任务是测定所有DNADNA碱基序碱基序列。要测定的基因组不论大小，其核苷酸的数量是明确的。列。要测定的基因组不论大小，其核苷酸的数量是明确的。细胞内的大部分蛋白质通常都被进行过翻译后修饰，修细胞内的大部分蛋白质通常都被进行过翻译后修饰，修饰过的蛋白质具有特定的理化性质和生物学功能。从而蛋饰过的蛋白质具有特定的理化性质和生物学功能。从而蛋白质组的蛋白质数量将远远大于相应的基因组的基因数量。白质组的蛋白质数量将远远大于相应的基因组的基因数量。三、静态与动态三、

24、静态与动态 一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变。一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变。作为新陈代谢的主要执行者的蛋白质组，在个体的生命活作为新陈代谢的主要执行者的蛋白质组，在个体的生命活动中总是变动不停。动中总是变动不停。功能蛋白质组学以研究蛋白质变化为主，主要是比较在不功能蛋白质组学以研究蛋白质变化为主，主要是比较在不同生长状态下或病理情况下的同一种细胞或组织的蛋白质组内同生长状态下或病理情况下的同一种细胞或组织的蛋白质组内的差异蛋白。的差异蛋白。四、时间与空间四、时间与空间 DNADNA通常位于细胞核内，且保持稳定，因此测定基因组通常位于细胞核内，且保持稳定，因此测定

25、基因组DNADNA序列是不受时空的影响。序列是不受时空的影响。不同的蛋白质分布在细胞的不同部位，它们的功能与其空不同的蛋白质分布在细胞的不同部位，它们的功能与其空间定位密切相关；许多蛋白质在细胞里不是静止不动的，它们间定位密切相关；许多蛋白质在细胞里不是静止不动的，它们在细胞里常常通过在不同的亚细胞环境里运动发挥作用。在细胞里常常通过在不同的亚细胞环境里运动发挥作用。五、孤立行为与相互作用五、孤立行为与相互作用 基因组的基因表达的各种基因组的基因表达的各种mRNAmRNA是彼此孤立的、互不干扰。是彼此孤立的、互不干扰。蛋白质组研究的一个主要内容是研究大规模的蛋白质的相互作用。蛋白质组研究的一个

26、主要内容是研究大规模的蛋白质的相互作用。相互作用组研究可分为两类：一类是研究蛋白质相互作用的网络，手段主相互作用组研究可分为两类：一类是研究蛋白质相互作用的网络，手段主要有大规模双杂交方法、噬菌体显示技术和蛋白质芯片技术；另一类研究要有大规模双杂交方法、噬菌体显示技术和蛋白质芯片技术；另一类研究是蛋白质复合体组成的分析。是蛋白质复合体组成的分析。六、单一手段与多种技术六、单一手段与多种技术 在基因组研究中，在基因组研究中，DNADNA测序技术是一个最基本和最主要的工具。测序技术是一个最基本和最主要的工具。蛋白质组技术可分为两类。第一类是蛋白质组的分离技术，如双向蛋白质组技术可分为两类。第一类是

27、蛋白质组的分离技术，如双向电泳技术、细胞分级分离技术、亲和层析技术等。第二类是蛋白质组的鉴电泳技术、细胞分级分离技术、亲和层析技术等。第二类是蛋白质组的鉴定技术，其核心是质谱技术。蛋白质芯片技术、大规模双杂交方法和噬菌定技术，其核心是质谱技术。蛋白质芯片技术、大规模双杂交方法和噬菌体显示技术也属于鉴定技术。体显示技术也属于鉴定技术。蛋白质和核酸大分子之间的相互作用蛋白质和核酸大分子之间的相互作用七、互补与互助七、互补与互助 蛋白质组研究与基因组研究形影相随、互相补充、互相帮助。蛋白质蛋白质组研究与基因组研究形影相随、互相补充、互相帮助。蛋白质组学可视为分子生物学的大规模筛选技术，目的在于归类细

28、胞中的蛋白质组学可视为分子生物学的大规模筛选技术，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能.上述两种学科的研究内容在互补的水平上研究了细胞的分子架构，又上述两种学科的研究内容在互补的水平上研究了细胞的分子架构，又都在各自的水平上提供了增强对方效应的信息，因此二者存在有很强的且都在各自的水平上提供了增强对方效应的信息，因此二者存在有很强的且带有系统性相互关系。带有系统性相互关系。第四节第四节 蛋白质组学发展方向和趋势蛋白质组学发展方向和趋势一、蛋白质组研究的发展方向一、蛋白质组研究的

29、发展方向1.1.在方法学上要提高二维电泳的通量在方法学上要提高二维电泳的通量 灵敏度和规模化，尤其对低丰度蛋灵敏度和规模化，尤其对低丰度蛋白需要建设色谱白需要建设色谱/电泳电泳-质谱为主体的技术。质谱为主体的技术。酵母双杂交已用于蛋白质连锁群建立，但缺少快速酵母双杂交已用于蛋白质连锁群建立，但缺少快速 高效获取复杂蛋白质高效获取复杂蛋白质互作的多维信息。互作的多维信息。针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织/细胞细胞,建立其蛋白质组或建立其蛋白质组或亚蛋白质组亚蛋白质组(或蛋白质组表达谱或蛋白质组表达谱)及蛋白质连锁群及蛋白质连锁群(compositi

30、onal(compositional proteomics)proteomics)研究。研究。2.2.在高等哺乳动物、植物细胞的蛋白质组全谱还未起步。在高等哺乳动物、植物细胞的蛋白质组全谱还未起步。3.3.对动植物生物体、或组织对动植物生物体、或组织/细胞开展全方位蛋白质组互作网络研究需要细胞开展全方位蛋白质组互作网络研究需要加强。加强。4.4.加强对动植物生命过程重大病害为对象加强对动植物生命过程重大病害为对象,进行重要生理进行重要生理/病理体系或过病理体系或过程的比较蛋白质组学程的比较蛋白质组学(comparative proteomics)(comparative proteomics)

31、研究。研究。二、发展趋势二、发展趋势（一）在研究策略上（一）在研究策略上 1.竭泽法竭泽法 采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质。乃至接近所有的蛋白质。2.功能法功能法 研究不同时期细胞蛋白质组成的研究不同时期细胞蛋白质组成的变化。变化。（二）在研究范围上（二）在研究范围上 1.蛋白质的表达模式蛋白质的表达模式 2.蛋白质翻译后修饰研究蛋白质翻译后修饰研究 3.蛋白质蛋白质-蛋白蛋白质相互作用质相互作用 4.蛋白质高级结构的解析蛋白质高级结构的解析（三）在研究对象上（三）在研究对象上 覆盖覆盖 原核微生物、真核微生物、植物和动物；涉及各种重要的生物原核微生物、真核微生物、植物和动物；涉及各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等。学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等。（四）在应用研究方面（四）在应用研究方面 以重要生命过程原生或人类重大疾病为对象以重要生命过程原生或人类重大疾病为对象;进行重要生理进行重要生理/病理体病理体系或过程的比较蛋白质组学研究。系或过程的比较蛋白质组学研究。（五）在技术发展方面（五）在技术发展方面 多种技术并存、各有优势和局限。多种技术并存、各有优势和局限。