分子克隆载体课件.ppt

1、 I CAP I CAP I CAPZ Y X侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。3 A CACUAGG5 16sRNA含有串联的来自噬菌体的强启动PL及PR，启动子的串联可能有相互增强作用。含有CIts857组件，此组件可变温诱导目的基因的表达。Z Y X四、转录终止结构的插入噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原（lysogen）。可因不同载体而选择不同菌种作宿主；原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达；真核生物启动子保守序列核糖体结合位点（S-D序列）它本身是一种核蛋

2、白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。Ptac17 TTGACA TATAAT基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞。一种以pBR322为基础的酵母质粒，两个抗药基因及左下方的半圆来自pBR322，右上半圆来自酵母，包括启动子、糖代谢酶类及氯霉素抗性基因，可在大肠杆菌体系重组再转化酵母细胞 称为穿梭质粒（shuttle plasmid）使RNA聚合酶变构，转录停顿；5ATG NAT GNA TGZ 123 456保证正确阅读AUG的序列AT

3、GNATGNATG，（LacZ基因 N端序列）RNA转录起始转录起始-35区区-10区区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrp tRNATyrlacrecAAra BAD共有序列共有序列 Ptrp TTGACA TTAACT TAAATG I II III IV V I V I II VATG I II III VIIIIIIOri转录起始 翻译起始 信号肽 成熟蛋白质 转录终止区CSCSCSCS-cloning site AmN2HlacZ把启动

4、子连同其附属成分，置换了pBR322的tetr基因，成为以启动子为组件的质粒。T A T A A T Pu A T A T T A PyZ Y X第一代 原核生物表达体系 质粒、噬菌体 细菌Ptrp与 Plac的杂化产物 Ptac比原来各自的活性强C G G C C G C G G CI V含有串联的来自噬菌体的强启动PL及PR，启动子的串联可能有相互增强作用。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。如携带杀虫基因的病毒对农作物进行生物防治。如果插入序列自身不含ATG起始密码,或限制酶切点不能把读码框准

5、确置于ATG之后,或插入片段编码未清楚,可在目的基因之前设保险序列:原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达；基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞。目的基因翻译表达及其准确性基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。噬菌体的生活周期：如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。分离得到某些噬菌体，在低温时（30）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解。如在Galk基因前

6、插入目的基因，与无插入的空载pKO比较，并无放射活性的增强，则说明插入片段不存在有启动子。3 A CACUAGG5 16sRNA U CU-C-C-U 5A G G A PuPuUUUPuPuAUG mRNAEcoRIHindIIIOriOri复制起复制起点点LacZAPRpUC19TAAATG I II III IV V I V I II VATG I II III VIIIIIIOri转录起始 翻译起始 信号肽 成熟蛋白质 转录终止区CSCSCSCS-cloning site第二代 酵母表达体系 穿梭质粒 酵母在A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（是包装蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下

7、使重组体DNA转入头部。Gal+ATP Gal-1-P+ADP6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。原核生物的转录单位是操纵子，操纵子包括相关结构基因及其上游的调控序列。噬菌体可以容纳较大的目的基因。（1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；可因不同载体而选择不同菌种作宿主；pBV221分子量小，易转化，操纵子理论在基因工程中的应用如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。Z Y XR

8、NA-pol辨认位点AGGA后的的7个Pu是核糖体小亚基的辨认部位原核生物启动子保守序列polylinkerpBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)pBR322AmpTet重组DNAAmprTcs提取DNA 电泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs转化 无菌落阳性菌落筛选重组子2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r PL