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1、常规细胞遗传学常规细胞遗传学/FISH在白血病诊断分型中的应用在白血病诊断分型中的应用-上海血液学研究所上海血液学研究所 陈冰陈冰细胞遗传学基础细胞遗传学基础 常见染色体异常数目异常单倍体：单倍体：n多倍体：多倍体：3 3n或或4 4n非整倍体：非整倍体：单体：单体：monosomy三体：三体：trisomy*非整倍体：有丝分裂中染色体不分离或染色体丢失非整倍体：有丝分裂中染色体不分离或染色体丢失常见染色体异常结构异常缺失：缺失：deletion重复：重复：duplication易位：易位：translocation等臂染色体：等臂染色体：isochromosome常见染色体异常结构异常环状染

2、色体：环状染色体：ring chromosome标记染色体：标记染色体：marker chromosome双着丝粒染色体：双着丝粒染色体：dicentric chromosome双微体：双微体：double minutes白血病细胞遗传学研究方法标本来源和采集骨髓：骨髓：3-5ml 3-5ml；*取自肿瘤组织本身取自肿瘤组织本身外周血：外周血：(1)WBC10 x10(1)WBC10 x109 9/L;/L;(2)(2)原、幼细胞百分比原、幼细胞百分比10%10%*分裂相均来源于白血病细胞分裂相均来源于白血病细胞*无脂肪颗粒，标本质量好无脂肪颗粒，标本质量好淋巴结：淋巴结：穿刺液或活检标本穿刺

3、液或活检标本*骨髓浸润时可用骨髓标本骨髓浸润时可用骨髓标本白血病细胞遗传学研究方法染色体制备方法直接法：直接法：不经培养立即处理不经培养立即处理短期培养法：短期培养法：按按1-3x101-3x106 6/ml/ml细胞密度接种到培养基细胞密度接种到培养基培养培养24-48h24-48h同步法：同步法：应用应用MTXMTX或或FduFdu处理处理17h17h，使其同步化，使其同步化白血病细胞遗传学研究方法染色体显带Q带：带：荧光很快褪色，标本不易保存荧光很快褪色，标本不易保存C带：带：染色体着丝粒显带，对染色体识别帮助不大染色体着丝粒显带，对染色体识别帮助不大G带：带：带纹细致，解象力强带纹细致

4、，解象力强末端呈浅带，不利于该区异常的识别末端呈浅带，不利于该区异常的识别对分裂相数量及质量要求高，条件欠稳定对分裂相数量及质量要求高，条件欠稳定*盐水法、碱处理法、尿素法、盐水法、碱处理法、尿素法、蛋白酶消化法蛋白酶消化法*ATAT碱基呈深带碱基呈深带R带：带：带型与带型与Q Q、G G带相反带相反除除Y Y染色体外，末端均呈深带，揭示该区的缺失与易位染色体外，末端均呈深带，揭示该区的缺失与易位方法简便，重复性好，可成批显带方法简便，重复性好，可成批显带对分裂相量少质差的肿瘤细胞显带成功率高对分裂相量少质差的肿瘤细胞显带成功率高带纹不如带纹不如G G带精细，难以识别微小异常带精细，难以识别微

5、小异常*荧光荧光R R带、带、热处理热处理GiemsaGiemsa-R-R显带法显带法 *CGCG碱基呈深带碱基呈深带核型分析的优缺点:v直观，能同时检测全部染色体数目、结构异常直观，能同时检测全部染色体数目、结构异常v为形态学检查，灵敏度有限为形态学检查，灵敏度有限v必须有可分析的中期分裂相，无法分析间期核必须有可分析的中期分裂相，无法分析间期核染色体荧光原位杂交技术在肿瘤遗传学研究中的应用FISH的基本原理：单链单链DNADNA（探针）和与其互补的（探针）和与其互补的DNADNA（玻片上的标本）退火杂交（玻片上的标本）退火杂交DenatureHybridizationv染色体或间期核玻片标

6、本制备染色体或间期核玻片标本制备v探针制备和标记探针制备和标记v玻片标本的变性玻片标本的变性v探针的变性探针的变性v原位分子杂交原位分子杂交v荧光显微镜观察荧光显微镜观察FISH的基本步骤：v染色体或间期核玻片标本制备染色体或间期核玻片标本制备u直接法制备直接法制备u短期培养法短期培养法u7272小时培养法小时培养法FISH的基本步骤（1）：v探针制备和标记探针制备和标记v标记方法：标记方法：间接标记间接标记:生物素生物素 地高辛地高辛 直接标记：直接标记：荧光素荧光素FISH的基本步骤（2）：v单一序列基因探针（单标、双标）单一序列基因探针（单标、双标）v染色体着丝粒探针染色体着丝粒探针v染

7、色体涂色探针染色体涂色探针vCGHvM-FISHvRx-FISHFISH探针的选用：一、经典的一、经典的FISH技术技术白血病的染色体异常：v染色体数目异常的检测染色体数目异常的检测v染色体结构异常的检测染色体结构异常的检测 易位易位 倒位倒位FISH在白血病中的应用:v白血病的白血病的MICM诊断诊断-常见染色体易位的检测常见染色体易位的检测v鉴别标志染色体鉴别标志染色体,发现、确定新的染色体易位，有发现、确定新的染色体易位，有助于定位克隆新的疾病基因助于定位克隆新的疾病基因v白血病疗效判断白血病疗效判断,鉴定鉴定BMT后造血细胞的克隆起源后造血细胞的克隆起源v白血病预后判断白血病预后判断,

8、检测微小残留病和监测早期复发检测微小残留病和监测早期复发v单一基因探针单一基因探针u单标记单标记FISH inv(16)M4EoFISH探针的选用：v单一基因探针单一基因探针u双标记双标记FISHt(15;17)M3(APL)t(8;21)M2bt(9;22)CMLFISH探针的选用：v染色体着丝粒探针染色体着丝粒探针u检测染色体数目异常检测染色体数目异常u染色体定位标记染色体定位标记u着丝粒及着丝粒周染色体易位着丝粒及着丝粒周染色体易位FISH探针的选用：v全染色体涂抹全染色体涂抹(Chromosome painting)FISH探针的选用：FISH检测的优点（1）:v直观，是细胞遗传学和分

9、子生物学之间的桥梁直观，是细胞遗传学和分子生物学之间的桥梁v敏感性和特异性高敏感性和特异性高v能分析一部分显带技术不易分辨的异常，能分析一部分显带技术不易分辨的异常，如如某些倒位、丢失、复杂畸形等某些倒位、丢失、复杂畸形等FISH检测的优点（2）:v与细胞形态学结合，有助于深入理解疾病的发与细胞形态学结合，有助于深入理解疾病的发病机制病机制v能检测石蜡固定和能检测石蜡固定和RightsRights染色标本染色标本v多色多色FISHFISH可在同一标本上同时检测多种序列。可在同一标本上同时检测多种序列。FISH检测的优点（3）:v间期核间期核FISHFISH：v不需体外培养，对非分裂细胞即可快速

10、检测不需体外培养，对非分裂细胞即可快速检测v可对终末分化的细胞进行检测可对终末分化的细胞进行检测v在极短的时间内可检测大量细胞在极短的时间内可检测大量细胞FISH检测的缺点（1）:v染色体异常的检测受限于相应探针的获得染色体异常的检测受限于相应探针的获得v对三体检测的敏感性高于对单体或缺失的检测对三体检测的敏感性高于对单体或缺失的检测v标本的限制（骨髓、外周血标本优于实体瘤或标本的限制（骨髓、外周血标本优于实体瘤或石蜡包埋、冰冻切片标本）石蜡包埋、冰冻切片标本）FISH检测的缺点（2）:v需要荧光显微镜和图象分析系统需要荧光显微镜和图象分析系统v一次杂交只能检测一次杂交只能检测1 1至数个异常

11、，不能同时对至数个异常，不能同时对整个基因组的染色体数目、结构异常进行检测整个基因组的染色体数目、结构异常进行检测二、二、M-FISH（Multiplex-FISH）SKY（光谱核型分析）（光谱核型分析）uCombinatorial M-FISHuCOBRA M-FISHM-FISH基本原理（1）Combinatorial M-FISH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X YFITC X X X X X X X X X X XC y3 X X X X X X X X X XCy3.5 X X X X X X X

12、X X X XC y5 X X X X X X X X X XCy7 X X X X X X X X X X COBRA M-FISHChrom FITC TRITC 1 100 0 2 67 33 3 50 50 4 33 67 5 0 100M-FISH基本原理（2）光谱核型分析（SKY）M-FISH与SKY的优点:v一次实验可对整个基因组进行分析一次实验可对整个基因组进行分析v适于检测染色体数目异常及一些结构重排适于检测染色体数目异常及一些结构重排三、彩色显带三、彩色显带FISHuRx-FISH(Cross-Species Colour segmenting in Human Karyo

13、type Analysis)u Multicolor Chromosome Bar Code for the Human Karyotype by FISHu High Resolution Multicolor-Banding for Human Chromosome彩色显带FISH的优点:v染色体内的结构异常染色体内的结构异常u 臂内、臂间倒位臂内、臂间倒位u 一定程度的缺失、复制一定程度的缺失、复制四、比较基因组杂交四、比较基因组杂交研究肿瘤基因组不平衡性研究肿瘤基因组不平衡性Comparative Genomic Hybridization(CGH)DAPI FITC TexasRed

14、 RatioCGH检测的优点（1）:v经一次染色体原位杂交实验，即可在整条染色经一次染色体原位杂交实验，即可在整条染色体或染色体区带水平对待检基因组体或染色体区带水平对待检基因组DNA序列拷序列拷贝数改变进行检测和定位贝数改变进行检测和定位v所需所需DNA标本可来自各种组织，如新鲜组织、标本可来自各种组织，如新鲜组织、福尔马林固定的组织、石蜡包埋组织，甚至单福尔马林固定的组织、石蜡包埋组织，甚至单个细胞，故可做回顾性研究个细胞，故可做回顾性研究CGH检测的优点（2）:v无需进行染色体培养，对于不易制备良好分裂无需进行染色体培养，对于不易制备良好分裂相的实体瘤尤为适用相的实体瘤尤为适用v不需事先

15、了解染色体的结构和可能存在的异常不需事先了解染色体的结构和可能存在的异常v仅需少量的肿瘤仅需少量的肿瘤DNA（约（约1 1ug）CGH检测的缺点（1）:v不适用于以下异常的检出：不适用于以下异常的检出：（1 1）平衡易位或插入、点突变、倒位、基因内重排）平衡易位或插入、点突变、倒位、基因内重排（2 2）倍体水平的改变）倍体水平的改变（3 3）着丝粒旁及染色质，端粒区）着丝粒旁及染色质，端粒区CGH检测的缺点（2）:v结果易受以下因素影响：结果易受以下因素影响：（1 1）正常细胞的污染）正常细胞的污染（2 2）肿瘤自身的遗传异质性）肿瘤自身的遗传异质性（3 3）系统产生的位点特异的不稳定性：）系

16、统产生的位点特异的不稳定性：1p23-ter1p23-ter，16p16p，1919，2222CGH检测的缺点（3）:v灵敏度的限制：灵敏度的限制：（1 1）DNADNA缺失：缺失：10-20 10-20 Mb（细胞株）以上（细胞株）以上 20-30 20-30 Mb（原发肿瘤）以上（原发肿瘤）以上 （2 2）DNADNA扩增：扩增：扩增子与扩增拷贝之积至少扩增子与扩增拷贝之积至少2 2 MbArray-CGH：v用于检测基因组不平衡性的重要技术，其分辨率比传统用于检测基因组不平衡性的重要技术，其分辨率比传统的比较基因组杂交的比较基因组杂交（CGH）提高了提高了20-10020-100倍，也达到了倍，也达到了检测基因拷贝数异常的精确度。检测基因拷贝数异常的精确度。v局限性在于无法检测出平衡易位、倒位、插入和复杂核局限性在于无法检测出平衡易位、倒位、插入和复杂核型；不能检测性染色体的不平衡；也无法检测小于其分型；不能检测性染色体的不平衡；也无法检测小于其分辨率的基因组不平衡异常。辨率的基因组不平衡异常。谢谢！