第九章微生物遗传与变异课件.ppt

1、1第九章第九章 微生物遗传与变异微生物遗传与变异 通过本章的学习，要求掌握：通过本章的学习，要求掌握：1、细菌基因重组的原理和方法。、细菌基因重组的原理和方法。2、真菌基因重组的原理和方法。、真菌基因重组的原理和方法。3、微生物诱变育种的原理和方法。、微生物诱变育种的原理和方法。4、基因工程的基本原理。、基因工程的基本原理。5、基因表达的调控。、基因表达的调控。重点：重点：细菌的基因重组细菌的基因重组难点：难点：低频转导，高频转导，准性生殖低频转导，高频转导，准性生殖 2 证明核酸（证明核酸（DNA或或RNA）是遗传的物质基础）是遗传的物质基础简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题简单的细菌

2、（或病毒）解决复杂而重大的问题微生物与高等生物具有共同的遗传本质微生物与高等生物具有共同的遗传本质第一节：微生物的遗传物质第一节：微生物的遗传物质一、证明核酸是遗传物质的一、证明核酸是遗传物质的3个经典实验个经典实验结论：3 PrusinerPrusiner(1982)(1982)提出提出羊搔痒病因子羊搔痒病因子是一种是一种蛋白质侵染颗粒蛋白质侵染颗粒（proteinaceousproteinaceous infectious infectious particleparticle），），并将之称做并将之称做PrionPrion或或VirinoVirino。-朊病毒朊病毒1997年，年，Sta

3、nley B.Prusiner荣获诺贝尔奖荣获诺贝尔奖4朊病毒的发现和思考朊病毒的发现和思考:朊病毒朊病毒一种具有传染性的蛋白质致病因子一种具有传染性的蛋白质致病因子蛋白质是遗传物质吗蛋白质是遗传物质吗?蛋白质折叠与功能的关系，蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？是否存在折叠密码？已知的传染性疾病的传播因已知的传染性疾病的传播因子必须含有核酸子必须含有核酸5二、遗传物质在微生物细胞内二、遗传物质在微生物细胞内 存在的部位和形式存在的部位和形式(一）遗传物质在微生物细胞中的存在方式一）遗传物质在微生物细胞中的存在方式真核生物真核生物 DNA分子与组蛋白结合构成染色体，每条染分子与组蛋白结合

4、构成染色体，每条染色体有单一线性双链色体有单一线性双链DNA分子。一个真核生物细分子。一个真核生物细胞内有多条染色体（脉孢菌胞内有多条染色体（脉孢菌7条，人条，人23条）。高等条）。高等生物中有生物中有2至多套染色体（动物至多套染色体（动物2倍，水稻倍，水稻4倍），倍），真菌有双倍体，但多数微生物是单倍体。真核细真菌有双倍体，但多数微生物是单倍体。真核细胞核物质外有核膜包围，形成完整细胞核。胞核物质外有核膜包围，形成完整细胞核。6原核生物原核生物 DNADNA不与组蛋白结合，染色体仅由一条不与组蛋白结合，染色体仅由一条DNADNA组组成，成，DNADNA为共价闭合环状双链，一个细胞内只为共价闭

5、合环状双链，一个细胞内只有一条染色体（单倍体有一条染色体（单倍体haploidhaploid）。）。无核膜膜无核膜膜包围，只在细胞中央形成核区。包围，只在细胞中央形成核区。质粒质粒plasmidplasmid和和转座因子转座因子 原核生物中，除染色体以外，能够自主复制原核生物中，除染色体以外，能够自主复制的共价闭合环状的共价闭合环状DNADNA分子。它们携带少量遗传分子。它们携带少量遗传基因，决定细胞的某些性状，并非细菌生活基因，决定细胞的某些性状，并非细菌生活必需。必需。71、细胞水平、细胞水平2、细胞核水平、细胞核水平3、染色体水平、染色体水平4、核酸水平、核酸水平5、基因水平、基因水平6

6、、密码子水平、密码子水平7、核苷酸水平、核苷酸水平（二）遗传物质在（二）遗传物质在7个水平上的形式个水平上的形式81、细胞水平、细胞水平真核微生物：细胞核真核微生物：细胞核原核微生物：核区原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的92、细胞核水平、细胞核水平真核生物真核生物 细胞核细胞核 核染色体核染色体原核生物原核生物 核区核区 DNA链链核基因组核基因组在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质103、染色体水平、染色体水平染色体的数目在不同的生染色体的数目在不同的生物中是不同的物中是不

7、同的真核生物染色体是由组真核生物染色体是由组蛋白与蛋白与DNA构成的线状构成的线状结构结构真核生物通常为多倍体真核生物通常为多倍体原核生物的染色体只有原核生物的染色体只有闭合环状的闭合环状的DNA链链原核生物为单倍体原核生物为单倍体114、核酸水平、核酸水平核酸种类：核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链；核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异长度：因种而异 微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是模式生物，后来不断发展，促进下开始的，最开始是模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物

8、学的最有力手段。已成为研究微生物学的最有力手段。125、基因水平、基因水平一切具有自主复制能力的遗传功能单位都一切具有自主复制能力的遗传功能单位都称为称为基因基因。它的物质基础是一个具有特定。它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的核苷酸顺序的DNA片段。片段。1909年年 丹麦生物学家丹麦生物学家WJohansen13结构基因：结构基因：是为细胞结构、组成是为细胞结构、组成(如细胞生化如细胞生化反应所需的酶反应所需的酶)及完成细胞功能所需的蛋白质及完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因等进行编码的基因。调节基因：调节基因：用于编码调节蛋白的基因用于编码调节蛋白的基因。操纵基因：操纵基因：是位

9、于启动基因和结构基因之间是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能与调节蛋白相结合，以此的一段碱基顺序，能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转录是否能进行。来决定结构基因的转录是否能进行。重复基因：重复基因：DNA片段重复片段重复跳跃基因：跳跃基因：可在可在DNA上转上转移位置的基因（移位置的基因（ISIS因子、因子、TnTn因子）因子）146、密码子水平、密码子水平15核苷酸是最小突变单位和交换单位核苷酸是最小突变单位和交换单位7、核苷酸水平、核苷酸水平16（三）转座因子（三）转座因子转座因子：转座因子：细胞中能细胞中能改变自身位置改变自身位置（例如从染色（例如从染色体或质粒转移到另

10、一个位点，或者在两个复制子体或质粒转移到另一个位点，或者在两个复制子之间转移）的一段之间转移）的一段DNA序列序列。插入序列（插入序列（insertion sequence,IS)转座子（转座子（transposon,Tn)某些病毒（某些病毒（Mu噬菌体）噬菌体）原核生物的转座因子：原核生物的转座因子：17 型型Compound transposons：两端为两端为IS，抗抗性基因居中。如性基因居中。如Tn5、Tn9、Tn10、Tn4001、Tn4003。型型Complex transposons：两端为两端为IR(30-50bp)，中间为转座基因和抗性基因。如中间为转座基因和抗性基因。如Tn

11、1、Tn3、Tn21、Tn1721、Tn551。基因转座基因转座 gene transposition转座子的特征是在两端有转座子的特征是在两端有IR序列序列,分两类：分两类：18转座的遗传学效应：转座的遗传学效应：1）插入突变）插入突变2）产生染色体畸变）产生染色体畸变3）基因的移动和重排）基因的移动和重排19(四四)质粒质粒1、致育因子致育因子(Fertility factor，F因子因子)3、产细菌素的质粒（产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）2、抗性因子（抗性因子（Resistance factor，R因子）因子）4、毒性质粒（毒性质粒（vir

12、ulence plasmid）5、代谢质粒（代谢质粒（Metabolic plasmid）6、隐秘质粒（隐秘质粒（cryptic plasmid）20第二节：微生物的基因组结构第二节：微生物的基因组结构 明确基因组的概念明确基因组的概念 三种代表性微生物基因组结构的特点，特三种代表性微生物基因组结构的特点，特别强调古生菌基因组的独特性及双重特征别强调古生菌基因组的独特性及双重特征21微生物基因组结构的特点微生物基因组结构的特点:1、原核生物（细菌）的基因组、原核生物（细菌）的基因组1）染色体为）染色体为双链环状的双链环状的DNA分子（单体）；分子（单体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；）基因

13、组上遗传信息具有连续性；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数 一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的 3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；）功能相关的结构基因组成操纵子结构；4）结构基因的单拷贝及）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；基因的多拷贝；5）基因组的重复序列少而短）基因组的重复序列少而短.基因组基因组genome：一种生物的全套基因。一种生物的全套基因。22232、真核微生物（啤酒酵母）的基因组、真核微生物（啤酒酵母）的基因组1）典型的真核染色体结构；）典型的真核染色体结构；啤

14、酒酵母基因组大小为啤酒酵母基因组大小为13.5106bp，分布在分布在16条染色体中。条染色体中。2）没有明显的操纵子结构；）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）或内含子序列；）有间隔区（即非编码区）或内含子序列；4）重复序列多）重复序列多.第一个完成基因组测序的真核生物基因组第一个完成基因组测序的真核生物基因组24253、古生菌（詹氏甲烷球菌）的基因组、古生菌（詹氏甲烷球菌）的基因组第一个完成基因组测序的古生菌第一个完成基因组测序的古生菌1)只有只有40的基因与其他两界的生物有同源性的基因与其他两界的生物有同源性2)古生菌的基因组在结构上类似于细菌古生菌的基因组在结构上类似于细菌

15、 1.66x106bp的环状染色体的环状染色体DNA 1682个个ORF(Open Reading Frame)3)负责信息传递功能的基因（复制负责信息传递功能的基因（复制、转录和翻、转录和翻译）则类似于真核生物译）则类似于真核生物26克隆克隆cloneclone 不经过有性细胞的结合，由体细胞发育成不经过有性细胞的结合，由体细胞发育成新个体，即无性繁殖。新个体，即无性繁殖。基因重组基因重组gene recombinationgene recombination 两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基因的重新组合，形成新的基因型的过程。因的重新组合，形成新

16、的基因型的过程。原核微生物没有有性生殖，其基因重组通过原核微生物没有有性生殖，其基因重组通过转化、接合、转导转化、接合、转导方式进行。方式进行。第三节第三节 原核微生物的基因重组原核微生物的基因重组27一、细菌的接合作用一、细菌的接合作用(conjugation)1.实验证据实验证据通过细胞与细胞的直接接触而通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组产生的遗传信息的转移和重组过程过程28接合接合(conjugation)通过供体菌与受体菌间细通过供体菌与受体菌间细胞接触而传递大段胞接触而传递大段DNA1946年，年，Joshua Lederberg 和和Edward L.TatumE

17、.coli k12的多重营养缺陷型的多重营养缺陷型杂交实验杂交实验中间平板上长出的原养型中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。遗传交换和重组所致。29证实接合过程需要细胞间的直接接触的证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（型管实验（Bernard Davis，1950）30接合机制接合机制(大肠杆菌的接合机制大肠杆菌的接合机制)接合作用是由一种被称为接合作用是由一种被称为F因因子子的质粒介导。的质粒介导。F因子的分子量通因子的分子量通常为常为5107，上面有编码细菌产生，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的性菌毛及控制接合过程

18、进行的20多多个基因。个基因。31中间平板上长出的原养型中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！遗传交换和重组所致！为何采用多重营养为何采用多重营养缺陷型菌株？缺陷型菌株？尽可能地排除回复尽可能地排除回复突变对实验结果的干扰！突变对实验结果的干扰！321）可经接合作用而获得）可经接合作用而获得2）可通过一些理化因素可通过一些理化因素(如吖啶橙、如吖啶橙、Ni2+、Co2+、利福平、丝裂霉素利福平、丝裂霉素C、硫酸十二酯钠硫酸十二酯钠、亚硝基胍、溴化乙锭、环己亚胺和加热等、亚硝基胍、溴化乙锭、环己亚胺和加热等)的处理，而从细胞中消失。的处理，而从细胞

19、中消失。3）在大肠杆菌中，）在大肠杆菌中，F因子的因子的DNA含量约占总含量约占总染色体含量的染色体含量的2%F因子特点：因子特点：33F因子因子 大肠杆菌是有性别分大肠杆菌是有性别分化的。决定它们性别的因化的。决定它们性别的因子称为子称为F F因子因子(致育因子致育因子或称性质粒或称性质粒)，呈超螺旋，呈超螺旋状态，状态，既可以在细胞内独既可以在细胞内独立存在立存在,具有自主的与染色具有自主的与染色体进行同步复制和转移到体进行同步复制和转移到其他细胞中的能力其他细胞中的能力,也可插也可插入入(即整合即整合)到染色体上到染色体上34F F因子的四种形式：因子的四种形式：a）F-菌株菌株(“雌性

20、雌性”菌株菌株)，不含不含F因子，因子，没有性菌毛，但可以没有性菌毛，但可以通过接合作用接收通过接合作用接收F因子而变成因子而变成F+菌株菌株；b）F+菌株菌株(“雄性雄性”菌株菌株)，F因子独立因子独立存在，细胞表面有性存在，细胞表面有性菌毛。菌毛。35c）Hfr菌株菌株，F因子插入到染色体因子插入到染色体DNA上上,因此只要发生接合转移过程，就可以把部因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发细胞并发生重组，由此而得名为生重组，由此而得名为高频重组菌株高频重组菌株d）F菌株菌株，Hfr菌株内的菌株内的F因子因不正常因子因不正常切割而

21、脱离染色体时，形成游离的但携带切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的一小段染色体基因的F因子，特称为因子，特称为F因因 子。子。细胞表面同样有性菌毛。细胞表面同样有性菌毛。36 F+菌株菌株含含F质粒，细胞表面产生性毛质粒，细胞表面产生性毛(sex pili)，与与F-细细胞相连，在接合后转移胞相连，在接合后转移DNA。F-菌株菌株无无F质粒，不产生质粒，不产生 性毛，可接受外性毛，可接受外 来来F质粒。质粒。37Hfr菌株菌株 高频重组菌株（高频重组菌株（high frequency recombination）。）。与与F-接合后，重组频率比接合后，重组频率比F+高几百倍。

22、高几百倍。当当Hfr菌株菌株与与F-菌株菌株接合时，接合时，Hfr染色体在染色体在F因子处因子处发生断裂，由环状变成线状。整段线状染色体转发生断裂，由环状变成线状。整段线状染色体转移至移至F-细胞的全过程约需细胞的全过程约需100 min。由于转移过程常中断，越在前端的基因进入由于转移过程常中断，越在前端的基因进入F-的的机会就越多，在机会就越多，在F-中出现重组子的时间就越早，中出现重组子的时间就越早，频率也高。频率也高。38FF菌株菌株 携带有携带有FF因子的菌株，其性状介于因子的菌株，其性状介于F+F+与与HfrHfr之间，这就是初生之间，这就是初生FF菌株。菌株。初生初生FF菌株与菌株

23、与F F-菌株接合，使后者转变成菌株接合，使后者转变成FF菌株，这就是次生菌株，这就是次生FF菌株。以这种接合来传菌株。以这种接合来传递供体菌基因的方式，称为递供体菌基因的方式，称为F F因子转导因子转导(F F-ductionduction)、性导性导(sexductionsexduction)。在次生的在次生的FF群体中，大约有群体中，大约有10%10%的的FF因子重因子重新整合到染色体组上，而恢复成新整合到染色体组上，而恢复成HfrHfr菌。菌。1）F+F-杂交杂交1 1）F F+细菌通过性毛与细菌通过性毛与F F-细菌接触并发生相互作用；细菌接触并发生相互作用；2 2）F F因子的转移

24、因子的转移:双链之一被切断，一条链进入双链之一被切断，一条链进入F F-细菌细菌3 3）进入进入F F-细菌中的一条链复制出互补链细菌中的一条链复制出互补链,F-,F-成为成为F+F+4 4）原有原有F F+细胞也完成细胞也完成F F因子另一条链的复制因子另一条链的复制F+F+2 2）HfrHfr F-杂交杂交Hfr菌株仍保持着菌株仍保持着F+细胞的特征。细胞的特征。当当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，缺口后，F因子的先导区和染色体因子的先导区和染色体DNA向受体细胞转移。向受体细胞转移。F因子除先导区外，绝大部分处于转因子除先导区外，绝大部分处于转移染色体

25、的末端，因转移过程常被中移染色体的末端，因转移过程常被中断，故断，故F因子不易转入受体细胞中。因子不易转入受体细胞中。HfrF-杂交后的接合子多数仍然是杂交后的接合子多数仍然是F-。染色体上越靠近染色体上越靠近F因子的先导区的基因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在因，进入的机会就越多，在F-中出现中出现重组子的的时间就越早，频率也高。重组子的的时间就越早，频率也高。HfrHfr F-3 3）FFF F-杂交杂交FF-与与F+F-的不同：的不同：供体的部分染色体基因随供体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；与染色体发生重组；b）继续存在于继续存在于F因子

26、上，因子上，形成一种部分二倍体；形成一种部分二倍体；细胞基因的这种转移过程又常称为细胞基因的这种转移过程又常称为性导（性导（sexduction）FF F F421、普遍性转导（、普遍性转导（generalized transduction）(1)意外的发现意外的发现19511951年，年，Joshua LederbergJoshua Lederberg和和Norton Norton ZinderZinder为了证为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌

27、进行进行类似的实验类似的实验用用“U”U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！接触的情况下，同样出现原养型细菌！二、细菌的转导二、细菌的转导(transduction)43 1952 1952 年年Zinder 和和 Lederberg 在验证在验证Salmonella typhimurium是否也存在接合现象时发现了是否也存在接合现象时发现了转导现象。转导现象。S.typhimurium：LT22A (trp-)；LT2(his-)LT22溶原性溶原性噬菌体噬菌体P22 感染感染LT2（非溶原性）非溶原性）可能释放

28、带可能释放带trp+的的P22LT22A(trp-)呈原养型。呈原养型。44沙门氏菌沙门氏菌LT22A是携带是携带P22噬菌体的溶源性细菌噬菌体的溶源性细菌 另一株是非溶源性细菌另一株是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过基因的传递很可能是由可透过“U”型型管滤板的管滤板的P22噬菌体介导的噬菌体介导的（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）Why and How?（2）转导（）转导（transduction）转导：转导：

29、由病毒介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种由病毒介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式。方式。一个细胞的一个细胞的DNA或或RNA通过病毒载体的感染转通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。移到另一个细胞中。转导噬菌体：转导噬菌体：能将细菌宿主的部分染色体和质粒能将细菌宿主的部分染色体和质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体。带到另一个细菌的噬菌体。获得了由噬菌体携获得了由噬菌体携带来的供体菌带来的供体菌DNA片段的受体细胞称为片段的受体细胞称为转导子转导子。在。在转导中被转移的染色体片段称为转导中被转移的染色体片段称为转导因子转导因子。46细菌转导的类型：细菌转导的类型：普遍普遍转导转导低频转导低频转

30、导高频转导高频转导局限局限转导转导完全转导完全转导流产转导流产转导普遍转导（普遍转导（generalized transduction）噬菌体可误包供体菌中的任何基因噬菌体可误包供体菌中的任何基因(包括质粒包括质粒)转导至受体细菌中，并使受转导至受体细菌中，并使受体菌实现各种性状的转导体菌实现各种性状的转导48普遍性转导的三种后果：普遍性转导的三种后果：外源外源DNA被降解，转导失败。被降解，转导失败。完全转导完全转导流产转导流产转导完全转导完全转导complete transduction：进入受体的外源进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子交

31、换而形成稳定的转导子(transductant)转导转导DNA不能进行整合、重组和复制，但其携带不能进行整合、重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。因此群体中仅一个细的基因可经过转录而得到表达。因此群体中仅一个细胞含有胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物。而其它细胞只能得到其基因产物。流产转导：流产转导：51 局限性转导是噬菌体对寄主特定基因进行的有效局限性转导是噬菌体对寄主特定基因进行的有效转移转移 溶原菌经诱导后，少数前噬菌体从宿主染色体脱溶原菌经诱导后，少数前噬菌体从宿主染色体脱落时产生错误切割，把宿主的某些基因整合到噬落时产生错误切割，把宿主的某些基因整合到噬菌体的基因

32、组上，当这样的噬菌体侵染另一宿主菌体的基因组上，当这样的噬菌体侵染另一宿主菌时，噬菌体菌时，噬菌体 DNA DNA 与受体菌的与受体菌的 DNA DNA 同源区段配同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上，对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上，使受体菌获得了供体的这部分遗传特性，从而形使受体菌获得了供体的这部分遗传特性，从而形成转导子。成转导子。局限转导（又叫特异转导）：局限转导（又叫特异转导）：specialized transduction52如：如：前噬菌体位点两端是细菌染色体的前噬菌体位点两端是细菌染色体的gal和和bio，经诱导后噬菌体与寄主，经诱导后噬菌体与寄主DNA

33、分离。但在极低的频率下会出现错分离。但在极低的频率下会出现错切，从而使邻接的的细菌切，从而使邻接的的细菌DNA被一起切被一起切除转导至受体菌。除转导至受体菌。局限性转导包括局限性转导包括低频转导低频转导和和高频转导高频转导两种两种类型类型53低频低频转导：转导：低频转导低频转导裂解物裂解物正常噬菌体正常噬菌体极少量的极少量的部分部分缺陷噬菌体缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）（局限转导噬菌体）转导转导颗粒颗粒局限转导子局限转导子（极少量）（极少量）低感染低感染频率频率形成转导形成转导子的频率子的频率只有只有10-4-10-654高频转导：高频转导：形成转导子的频率很高形成转导子的频率很高,理论上可达

34、理论上可达 50%。高频转导是双重溶源的结果：高频转导是双重溶源的结果：E.coli k12 E.coli K12(/dgal)F dgal UV 转导噬菌体（转导噬菌体（gal）转导子菌落转导子菌落 辅助噬菌体（辅助噬菌体（）噬菌斑噬菌斑 局限转导与普遍转导的主要区别：局限转导与普遍转导的主要区别：a）局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体DNA连连接，与噬菌体接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。菌的基因。b）局限性转导颗粒

35、携带特定的染色体片段并将固定局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。转导携带的宿主基因具有随机性。转化：转化：指同源或异源的游离指同源或异源的游离DNA分子（质粒和染色分子（质粒和染色体体DNA）被自然或人工感受态细胞提取，并得到表被自然或人工感受态细胞提取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。达的水平方向的基因转移过程。这些被转化的游离这些被转化的游离的的DNA片段称为转化因子片段称为转化因子。转化后的受体菌，称为转化后的受体菌，称为转化子转化子。1928年，年，Gri

36、ffith发现肺炎链球菌（发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力三、细菌的遗传转化三、细菌的遗传转化（genetic transformation）感受态细胞：感受态细胞：受体菌最容易接受外源受体菌最容易接受外源DNA片段并实现片段并实现转化的生理状态称为感受态。转化的生理状态称为感受态。进行转化，需要进行转化，需要二方面二方面必要的条件：必要的条件：1、建立了感受态的受体细胞、建立了感受态的受体细胞2、外源游离、外源游离DNA分子（转化因子）分子（转化因子）

37、自然感受态自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；性，受细菌自身的基因控制；人工感受态人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取有摄取DNADNA的能力，或人为地将的能力，或人为地将DNADNA导入细胞内导入细胞内转化因子通常是双链转化因子通常是双链DNA。转化过程转化过程:感受态的出现感受态的出现 转化因子的吸附与掺入转化因子的吸附与掺入 转化因子的整合转化因子的整合 噬菌体噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒有活性的病毒颗粒转染转染(transfection

38、)：转染的特点：转染的特点：提纯的噬菌体提纯的噬菌体DNA以转化的以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。整的病毒颗粒。人工转化：人工转化：用用CaCl2处理细胞，处理细胞，电穿孔电穿孔等是常用的人工转化手段。等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。基础技术。用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源处于一种可以摄取外源DNA的的“人工感受态人

39、工感受态”。61五五.原生质体融合原生质体融合原生质体融合：原生质体融合：将遗传性状不同的两种菌将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内、及属间）（包括种间、种内、及属间）原生质体原生质体融合成融合成为一个新的重组子的技术。为一个新的重组子的技术。原生质体融合步骤：原生质体融合步骤：1、原生质体制备、原生质体制备2、原生质体融合和再生、原生质体融合和再生3、融合子的选择、融合子的选择62 微生物细胞融合的研究始于微生物细胞融合的研究始于19761976年。年。主要过程：先准备两个有选择性遗传标记主要过程：先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁的突变株，在高渗溶液中，用适当

40、的脱壁酶去除细胞壁，再将形成的原生质体离心酶去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂聚集，并加入促融合剂PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇)促进促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁或进行分裂的培养基上，待其再生细胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子。否是重组子。63杂交杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。组方式。有性杂交有性杂交：指性细胞间的接合和随之

41、发：指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。的一种方式。（一）有性生殖（一）有性生殖第四节第四节 真核微生物的基因重组真核微生物的基因重组能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交64（二）准性生殖（二）准性生殖准性生殖准性生殖是指真菌中不通过有性生殖的基因是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。它是重组过程。它是类似于有性生殖，但比之更类似于有性生殖，但比之更为原始的一种生殖方式，为原始的一种生殖方式，它可使同一生物的它可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通

42、过减两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。数分裂而导致低频率的基因重组。在半知菌在半知菌类中最为常见。类中最为常见。652、异核体形成、异核体形成1、菌丝联合、菌丝联合3、核配、核配4、体细胞交换和单倍体化、体细胞交换和单倍体化 杂合二倍体只有相对的稳定性，在其繁殖过程杂合二倍体只有相对的稳定性，在其繁殖过程中虽不进行减数分裂，但在中虽不进行减数分裂，但在有丝分裂有丝分裂中可以发生染中可以发生染色体交换和染色体单倍化，从而形成各种分离子。色体交换和染色体单倍化，从而形成各种分离子。准性生殖的过程：准性生殖的过程：666768“生物化学统一性生物化学统一性”法则：法

43、则：人和细菌在人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果所有生物的所有生物的DNA在结构及特性上具有一致性在结构及特性上具有一致性让细菌代人受过！让细菌代人受过！Ames试验：试验：利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用69 美国加利福尼亚大学的美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于教授于1966年发明，因此称为年发明，因此称为Ames试验试

44、验 具体操作：检测具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型组氨酸营养缺陷型菌株菌株(his-)的回复突变率的回复突变率 回复突变回复突变：突变体失去的野生型性状，可突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变突变称为回复突变70证明证明Ames试验重要性的应用实例：试验重要性的应用实例：1.1.国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反反应停应停”，由于其药效显著，在，由于其药效显著，在60-7060-70年代十分流年代十分

45、流行行2.2.但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停反应停”，后来采，后来采用用AmesAmes试验发现这种物质的确具有很强的致突变作试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用用，因此这种药物被禁止使用3.3.但如果能在这种药物上市之前就进行但如果能在这种药物上市之前就进行AmesAmes试验检测试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免71Ames试验试验72诱变育种：诱变育种：指利用各种指利用各种诱变剂处理微生

46、诱变剂处理微生物物细胞，提高基因的随机突变频细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。需要的高产优质菌株。73诱变剂诱变剂物理因素：物理因素：紫外线、激光、离子紫外线、激光、离子束、束、X射线、射线、r射线等射线等化学因素化学因素：烷化剂、碱基类似烷化剂、碱基类似物、吖啶化合物物、吖啶化合物（2）选用优良的出发菌株）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液处理单细胞或单孢子悬浮液（1）使用简便有效的诱变剂）使用简便有效的诱变剂74（4）使用最佳的处理剂量）使用最佳的处理剂量 剂量剂量=强度（浓度）强度（浓度）作用时间作用时间

47、相对剂量相对剂量=杀菌率杀菌率处理剂量：处理剂量：是指处理因素对微生物的生物学效应是指处理因素对微生物的生物学效应75致死剂量：致死剂量：将微生物全部杀死的剂量将微生物全部杀死的剂量亚致死剂量：亚致死剂量：将将M大部分杀死，只留下很大部分杀死，只留下很少的活菌体，如杀死少的活菌体，如杀死99%以上，存活不到以上，存活不到1%，或者杀死，或者杀死90%以上，存活在以上，存活在10%以下。以下。弱致死剂量：弱致死剂量：杀死一大半，存活一小半，杀死一大半，存活一小半，如杀死如杀死50-70%，存活，存活30%-50%诱变处理一诱变处理一般选用亚致死剂量。般选用亚致死剂量。76（5）设计高效率筛选方案

48、）设计高效率筛选方案突变株的筛选突变株的筛选：产量突变株的筛选产量突变株的筛选 抗药性突变株的筛选抗药性突变株的筛选 营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选77诱变诱变检出营养检出营养缺陷型缺陷型淘汰野生淘汰野生型型鉴定营养鉴定营养缺陷型缺陷型富集培养富集培养（抗生素法）（抗生素法）（菌丝过滤法）（菌丝过滤法）影印平板法影印平板法生长谱法生长谱法78第六节第六节 微生物基因表达的调控微生物基因表达的调控 一、操纵子（一、操纵子（operon)的转录调控的转录调控操纵子：操纵子：一个或多个结构基因联接在一起，一个或多个结构基因联接在一起，形成一个在结构和功能上协同作用的整体，形成一个在结构

49、和功能上协同作用的整体，受同一个调节基因、操纵基因受同一个调节基因、操纵基因(operator)和和启动区（启动区（promoter)的调控。的调控。79promoteroperatorgene Agene Bgene C基因基因转录转录调控调控负转录调控负转录调控正转录调控正转录调控负控诱导负控诱导负控阻遏负控阻遏正控诱导正控诱导正控阻遏正控阻遏801、负转录调控、负转录调控（negative transcription control)调节基因的产物是调节基因的产物是阻遏蛋白阻遏蛋白（repressor），），阻遏蛋白可以与操纵区结合，起着阻遏蛋白可以与操纵区结合，起着阻止阻止结构基因结构

50、基因转录的作用。转录的作用。2、正转录调控、正转录调控（positive transcription control)调节基因的产物是调节基因的产物是激活蛋白激活蛋白（activator），），激激活蛋白与相应的激活结合位点结合，活蛋白与相应的激活结合位点结合，激活激活结构基因结构基因的转录。的转录。811）负控诱导系统）负控诱导系统a、没有诱导物存在时，阻遏蛋白与操纵区结合，没有诱导物存在时，阻遏蛋白与操纵区结合，阻止转录阻止转录b、有诱导物存在时，阻遏蛋白与诱导物结合而不有诱导物存在时，阻遏蛋白与诱导物结合而不再和操纵区结合，转录正常进行。再和操纵区结合，转录正常进行。典型：大肠杆菌的乳糖