第七章蛋白质的分离纯化课件.ppt

1、第七章第七章 蛋白质的性质和分离纯化蛋白质的性质和分离纯化Properties and Purification of Protein目的：目的：1.1.研究蛋白质的分子结构；研究蛋白质的分子结构；2.2.研究蛋白质的生物功能；研究蛋白质的生物功能；3.3.蛋白质应用。蛋白质应用。方法方法:利用各种性质差别。利用各种性质差别。第一节第一节 蛋白质的性质蛋白质的性质一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质v蛋白质为两性电解质蛋白质为两性电解质v蛋白质等电点蛋白质等电点v蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点在偏碱溶液中带负电荷，在等

2、电点pHpH时时为两性离子。蛋白质溶液处于等电点时，为两性离子。蛋白质溶液处于等电点时，溶解度最小；粘度、渗透压、膨胀性及溶解度最小；粘度、渗透压、膨胀性及导电能力也降为最低值。导电能力也降为最低值。蛋白质在等电点的溶解度最小蛋白质在等电点的溶解度最小疏水区域疏水区域蛋白质分子上的电荷与疏水区蛋白质分子上的电荷与疏水区v等离子点：在没有其他盐类干扰时，蛋等离子点：在没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出的质子数与质白质质子供体基团解离出的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的子受体基团结合的质子数相等时的pH,pH,为为蛋白质特征常数。蛋白质特征常数。v蛋白质相对分子量在蛋白质相对分子

3、量在600060001 000 0001 000 000之之间。测定分子量的主要方法有化学组成法、间。测定分子量的主要方法有化学组成法、渗透压法、超离心法（沉降分析法）、凝渗透压法、超离心法（沉降分析法）、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。二、蛋白质分子量及其确定方法二、蛋白质分子量及其确定方法v化学组成法化学组成法:最低最低M=M=元素元素(分子分子)分子量分子量/元素元素(分子分子)百分含量百分含量 v渗透压法渗透压法:Mr=cRT:Mr=cRT/v超离心法超离心法:Mr:Mr=RTs/(1-)D=RTs/(1-)D v凝胶过滤凝胶过滤:logMrlogMr

4、 =K=K1 1-K K2 2V Ve evSDSSDSPAGEPAGE法法:logMr:logMr=-b=-bR R v氨基酸序列分析计算氨基酸序列分析计算 元素原子量元素原子量(分子分子量分子分子量)v最低相对分子量最低相对分子量=元素元素(分子分子)百分含量百分含量肌红蛋白含铁量为肌红蛋白含铁量为0.335%，其最低分子量可，其最低分子量可按下式算出：按下式算出：Fe原子量原子量(55.8)v最低相对分子量最低相对分子量=Fe元素百分含量元素百分含量(0.335%)=16700化学组成测定最低相对分子量化学组成测定最低相对分子量v真实分子量是最低相对分子质量的真实分子量是最低相对分子质量

5、的n n倍，倍，这里这里n n是每个蛋白质分子中铁原子的数目。是每个蛋白质分子中铁原子的数目。因为肌红蛋白中，因为肌红蛋白中，n nl l，所以其真实，所以其真实M Mr r就就是是1670016700。又如血红蛋白含铁也是。又如血红蛋白含铁也是0.335%0.335%，即最低即最低M Mr r亦为亦为1670016700，但根据其他方法测得，但根据其他方法测得的的M Mr r是是6800068000。可见每一分子血红蛋白含有。可见每一分子血红蛋白含有四个铁原子，即四个铁原子，即n n4 4，因此其真实，因此其真实M Mr r16700167004=668004=66800。v有时蛋白质分子中

6、某一氨基酸的含量特别少，有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特别少，应用同样的原理，由这一氨基酸含量的分析应用同样的原理，由这一氨基酸含量的分析结果，也可以计算蛋白质的最低相对分子质结果，也可以计算蛋白质的最低相对分子质量。量。v例如牛血清清蛋白含色氨酸例如牛血清清蛋白含色氨酸0.58%，计算所，计算所得的最低相对分子质量是得的最低相对分子质量是35200。用其他方。用其他方法测得的法测得的Mr是是69000，所以每分子牛血清清，所以每分子牛血清清蛋白含有两个色氨酸残基。蛋白含有两个色氨酸残基。渗透压法渗透压法v渗透压是溶液的依数性渗透压是溶液的依数性质之一质之一,是单位体积内溶是单位体积内溶质质

7、点数的函数质质点数的函数,与溶质与溶质的性质和形状无关。的性质和形状无关。v唐南平衡影响渗透压测定。唐南平衡影响渗透压测定。v尽量采用接近等电点的缓冲液作膜内外尽量采用接近等电点的缓冲液作膜内外的溶剂，并增加缓冲液中无机盐的浓度。的溶剂，并增加缓冲液中无机盐的浓度。沉降速度法沉降速度法FcFbFfv蛋白质在离心场中沉降时蛋白质在离心场中沉降时:vF Fc c(离心力离心力)=m mp p2（离心加速度）离心加速度）vF Fb b(浮力浮力)=V Vp p2=m mp p2vF Ff f(摩擦力摩擦力)=f f=f(d f(d/dt/dt)v通过测定沉降界面的移动速度测定通过测定沉降界面的移动速

8、度测定Mr.dx/dtMr.dx/dt为为常数常数v F Fc c-F-Fb b =F Ff fv (d (d/dt/dt)m)mp p（1-1-）2 f f=v沉降系数：单位离心力场的沉降速度叫沉降系数，沉降系数：单位离心力场的沉降速度叫沉降系数，用用s s表示。表示。s=(dx/dt)/s=(dx/dt)/2 2=m=mp p(1-)/f(1-)/f 沉降系数只与分子的大小和形状有关，当分子形沉降系数只与分子的大小和形状有关，当分子形状相似时，状相似时，s s与分子量成正比。因此与分子量成正比。因此s s常用作生物常用作生物大分子的大小表示方法。大分子的大小表示方法。v由于由于s s值较小

9、，因此用值较小，因此用1 11010-13-13秒表示秒表示1 1个沉降系个沉降系数单位（数单位（Svedberg unitSvedberg unit）。）。S S值与温度和溶剂值与温度和溶剂有关，所以，一个分子的沉降系数定义为摄氏有关，所以，一个分子的沉降系数定义为摄氏2020度，水溶液条件下的度，水溶液条件下的s s值为标准。值为标准。1S=11S=11010-13-13（s s）v由于蛋白质分子的沉降速度同时受到分子的大小由于蛋白质分子的沉降速度同时受到分子的大小和形状的影响，大小与质量有关、而形状与其扩散和形状的影响，大小与质量有关、而形状与其扩散系数有关：系数有关：m mp p=Mr

10、=Mr/N /N f=RT/ND f=RT/ND（爱因斯坦（爱因斯坦-萨德兰德方程）萨德兰德方程）s=ms=mp p(1-)/f(1-)/f Mr=RTsD（1 ）v是溶剂的密度（是溶剂的密度（g/cmg/cm3 3）；）；是蛋白质是蛋白质的偏微比容（即当加入的偏微比容（即当加入1g1g干物质于无限大干物质于无限大体积的溶剂中时溶液体积的增量）（蛋白体积的溶剂中时溶液体积的增量）（蛋白质溶于水的偏微比容约为质溶于水的偏微比容约为0.74 cm0.74 cm3 3/g/g）；）；R R是气体常数（是气体常数（8.314 J/(Kmol8.314 J/(Kmol)）；）；T T是是绝对温度（绝对温

11、度（K K）；）；s s为沉降系数；为沉降系数；D D是扩散是扩散系数。系数。v凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质。不论是天然凝胶还是人工合成的凝胶，不论是天然凝胶还是人工合成的凝胶，它们的内部都具有很细微的多孔网状结它们的内部都具有很细微的多孔网状结构。凝胶层析的机理是分子筛效应构。凝胶层析的机理是分子筛效应(又称又称分子筛层析分子筛层析)，如同过筛那样，它可以把，如同过筛那样，它可以把物质按分子大小不同进行分离，但这种物质按分子大小不同进行分离，但这种“过筛过筛”与普通的过筛不一样。与普通的过筛不一样。凝胶过滤法测定蛋白质分子量凝胶过滤法测定蛋白质分子量

12、分子筛层析的工作原理分子筛层析的工作原理v在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进人凝胶颗粒内部的多孔而小分子可以进人凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以致最后流出柱网状结构，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。得到分离。A.A.小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。间迅速通过。B

13、.(1)B.(1)蛋白质混合物上柱；蛋白质混合物上柱；(2)(2)洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻在颗粒之外，大小分子开始分开；分子则被排阻在颗粒之外，大小分子开始分开；(3)(3)小分子被滞留，大分子向下移动，大小分小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子完全分开；子完全分开；(4)(4)大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。子尚在行进中。V Vt t-V-Vo o 或或V Vi i+V+Vm mV Vt tV Vo ovV Vo o：外水体积，可用不被凝胶滞留的大分子物：外水体积，可用不被

14、凝胶滞留的大分子物质的溶液质的溶液(最好有颜色以便于观察，如血红蛋最好有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约白，印度黑墨水，分子量约200200万的蓝色葡聚万的蓝色葡聚糖一糖一20002000等等)通过实验测量求出。通过实验测量求出。vV Vi i：内水体积，可：内水体积，可由由gWgWR R求得求得(g(g为干凝胶重，为干凝胶重，W WR R为凝胶的为凝胶的“吸水量吸水量”，以，以mLmLg g表示表示)。vV Vm m ：凝胶基质体积。：凝胶基质体积。vV Vt t：总体积。：总体积。V Vt t=V=Vm m+V+Vo o+V+Vi ivV Ve e：为洗脱体积。：为洗脱体积

15、。分配系数分配系数K Kd dv可以把凝胶层析看成是液可以把凝胶层析看成是液-液分配层析。液分配层析。固定相是凝胶珠内部水相（固定相是凝胶珠内部水相（V Vi i），流动相），流动相是凝胶外部水相（是凝胶外部水相（V Vo o）。）。K Kd d为样品在两相为样品在两相间的分配系数，也可以说间的分配系数，也可以说K Kd d是分子量不同是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与被分离物分子的大小和凝胶颗粒孔隙的与被分离物分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的粗细长短无关，大小分布有关，而与柱的粗细长短无关，也就是说它对特定物质为常数，与柱的

16、物也就是说它对特定物质为常数，与柱的物理条件无关。理条件无关。v K Kd d=(V=(Ve e-V-Vo o)/V)/Vi i vK Kd d可以有下列几种情况：可以有下列几种情况：v(1)(1)当当K Kd d=O=O时，则时，则V Ve e=V=Vo o，即对于根本不能进入凝，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质胶内部的大分子物质(全排阻全排阻)，洗脱体积等于空，洗脱体积等于空隙容积隙容积(组分组分I)I)。v(2)(2)当当K Kd d=1=1时，时，V Ve e=V=Vo o+V+Vi i，即小分子可完全渗入凝，即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为外水体积与内水体积之胶内部时

17、，洗脱体积应为外水体积与内水体积之和和(组分组分)。(3)(3)当当0K0Kd d111，表示凝胶对组分有吸附作用，此时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时V Ve eVVo o+V+Vi i，例如一些芳香族化合物的洗脱容积，例如一些芳香族化合物的洗脱容积远超出理论计算的最大值，这些化合物的远超出理论计算的最大值，这些化合物的K Kd d11，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在SephadexSephadex G-G-2525中的中的K Kd d值分别为值分别为1.21.2，1.41.4和和2.22.2。v已知已知 K Kd d=（V Ve e-V-Vo o）/V/Vi i，

18、将，将V Vt t-V-Vo o代替代替V Vi i，则则K Kavav=（V Ve e-V-Vo o）/（V Vt t-V-Vo o）即即 V Ve e=V=Vo o+K+Kavav（V Vt t-V-Vo o）v实际上，将原来以水作为固定相实际上，将原来以水作为固定相(V(Vi i)改为水与改为水与凝胶颗粒凝胶颗粒(V(Vt t-V-Vo o)作为固定相，而洗脱剂作为固定相，而洗脱剂(V(Ve e-V-Vo o)作为流动相。作为流动相。K Kavav与与K Kd d对交联度小的凝胶差别较对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。小，而对交联度大的凝胶差别大。v在一般情况下，凝胶对

19、组分没有吸附作用时，在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过当流动相流过V Vt t体积后，所有的组分都应该被体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点。洗出来，这一点为凝胶层析法的特点。有效分配系数有效分配系数K KavavlogMrlogMr =K=K1 1-K K2 2V Ve eSDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）测定分子量测定分子量 vSDSSDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，可破坏蛋白质氢键和疏水作用使蛋白质变性。可破坏蛋白质氢键和疏水作用使蛋白质变性。v

20、SDSSDS带有很多负电荷，与蛋白质结合（带有很多负电荷，与蛋白质结合（1.41.4克克SDS/1SDS/1克蛋白质）后，克蛋白质）后，SDSSDS的负电荷远远超过了蛋的负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小。取决于蛋白质分子的大小。v在在SDSSDS和巯基乙醇存在下，蛋白质和亚基的肽链和巯基乙醇存在下，蛋白质和亚基的肽链完全伸展成长棒状（完全伸展成长棒状（1.8nm1.8nm），其分子量与肽链的），其分子量与肽链的长度成比例

21、。长度成比例。logMlogM=a-b=a-bR三、蛋白质的胶体性质三、蛋白质的胶体性质v具有胶体的一切特性（布郎运动、丁达具有胶体的一切特性（布郎运动、丁达尔现象、不能透过半透膜、具有吸附能尔现象、不能透过半透膜、具有吸附能力）力）v亲水胶体稳定性亲水胶体稳定性 ：（：（1 1）直径）直径1-100nm1-100nm；（2 2）水化层（）水化层（3 3）双电层）双电层v溶胶（蛋白质颗粒分散在水中）、凝胶溶胶（蛋白质颗粒分散在水中）、凝胶（水分散在蛋白质颗粒中）（水分散在蛋白质颗粒中）蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质v蛋白质溶液是一种胶体溶液；蛋白质溶液是一种胶体溶液；v特定的空间构象，分子量

22、一定特定的空间构象，分子量一定 分子筛分子筛层析；层析；v在大部分在大部分pHpH条件下，蛋白质分子同时存在两条件下，蛋白质分子同时存在两种电荷种电荷 等电点沉淀，盐溶，盐析，电等电点沉淀，盐溶，盐析，电泳，离子交换层析等；泳，离子交换层析等；v一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲水区域水区域 有机溶剂沉淀，疏水层析有机溶剂沉淀，疏水层析。四、蛋白质的沉淀四、蛋白质的沉淀 消除稳定蛋白质的因素，就会导致蛋白消除稳定蛋白质的因素，就会导致蛋白质沉淀。通常进行蛋白质沉淀的方法有以质沉淀。通常进行蛋白质沉淀的方法有以下几种：下几种：1.1.盐析法盐析法 2.2

23、.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 3.3.重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法 4.4.生物碱试剂和某些酸沉淀法生物碱试剂和某些酸沉淀法 5.5.热变性沉淀法热变性沉淀法 前两种方法可以使蛋白质不变性，后前两种方法可以使蛋白质不变性，后3 3种种方法通常会使蛋白质变性。方法通常会使蛋白质变性。蛋白质的盐析蛋白质的盐析硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度离子强度第二节第二节 蛋白质分离纯化及含量测定蛋白质分离纯化及含量测定蛋白质分离纯化的总目标蛋白质分离纯化的总目标:v增加制品的纯度或比活性（单位蛋白质增加制品的纯度或比活性（单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性）

24、重量中目标蛋白质的含量或生物活性）蛋白质分离纯化的基本原则蛋白质分离纯化的基本原则:v选择好的材料选择好的材料v了解目的蛋白质的稳定性了解目的蛋白质的稳定性v探索有效的抽提法和浓缩法探索有效的抽提法和浓缩法v建立一套层析的组合建立一套层析的组合v以较好的方法贮存以较好的方法贮存一、一、初初(粗粗)提提 v组织、细胞破碎组织、细胞破碎v缓冲液提取。缓冲液提取。二、粗分级分离二、粗分级分离 （粗纯化）（粗纯化）v盐析盐析 v有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 v等电点沉淀等电点沉淀v超滤浓缩等超滤浓缩等三、细分级分离三、细分级分离 （精纯化）（精纯化）v分子筛层析分子筛层析v亲和层析亲和层析v疏水疏水/反相

25、层析反相层析 v离子交换层析离子交换层析v吸附层析吸附层析v电泳等电泳等四、结晶四、结晶蛋白质分离纯化的步骤及具体方法蛋白质分离纯化的步骤及具体方法v蛋白质分子的大小蛋白质分子的大小v蛋白质溶解度蛋白质溶解度v蛋白质电荷状况蛋白质电荷状况v蛋白质吸附性质蛋白质吸附性质v蛋白质生物学亲和性蛋白质生物学亲和性依据蛋白质性质的分离纯化方法依据蛋白质性质的分离纯化方法一、依据分子大小不同的纯化方法一、依据分子大小不同的纯化方法1 1、透析和超滤、透析和超滤 透析：分离无机盐、透析：分离无机盐、单糖等小分子。单糖等小分子。超滤：分离无机盐、超滤：分离无机盐、单糖等小分子。单糖等小分子。透析示意图透析示意

26、图2 2、密度梯度离心、密度梯度离心蔗糖蔗糖 1.28g/cm1.28g/cm3 3聚蔗糖（聚蔗糖（FicollFicoll）4%8%12%16%20%3 3、凝胶过滤、凝胶过滤 也称分子排阻层析、分子筛层析，这也称分子排阻层析、分子筛层析，这是根据蛋白质分子大小不同来分离纯化是根据蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法。蛋白质的一种方法。1 1、盐析法、盐析法v在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐，在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐，使蛋白质沉淀下来，常用的中性盐为使蛋白质沉淀下来，常用的中性盐为(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4、NHNH4 4ClCl等。等。v中性盐对球状蛋

27、白的溶解度有显著的影响：中性盐对球状蛋白的溶解度有显著的影响：盐溶：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。盐溶：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。盐析：高浓度的中性盐，如饱和盐析：高浓度的中性盐，如饱和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4使使 蛋白质溶解度下降，从溶液中沉淀析出。蛋白质溶解度下降，从溶液中沉淀析出。二、依据溶解度差别的纯化方法二、依据溶解度差别的纯化方法蛋白质的盐析蛋白质的盐析221iiZmIv分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出：白质溶液中的几种蛋白质分段析出：鸡蛋清中球蛋白（鸡蛋清中球蛋白（50%(NH50%(N

28、H4 4)2 2SOSO4 4饱和饱和度），清蛋白（饱和度），清蛋白（饱和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4)。v在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等，其中以钠和磷酸钠等，其中以硫酸铵硫酸铵最为常用。最为常用。因为硫酸铵在水中的溶解度大而且因为硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系温度系数小数小(在在25 25 时，溶解度为时，溶解度为767g767gL L；00时，溶解度为时，溶解度为697g697gL)L)、不影响酶的活性不影响酶的活性，分离效果好分离效果好，而且，而且价

29、廉易得价廉易得。然而用硫酸。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其他中性盐进行盐析。也用其他中性盐进行盐析。硫酸铵沉淀蛋白质主要与盐浓度有关，硫酸铵浓硫酸铵沉淀蛋白质主要与盐浓度有关，硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数，这百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数，这是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时，会出现是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时，会出现相当大的非线性体积变化。相当大的非

30、线性体积变化。蛋白质溶液蛋白质溶液加入硫酸铵加入硫酸铵静止沉淀静止沉淀离心或过滤离心或过滤收集沉淀收集沉淀操作流程：操作流程：蛋白质的盐析蛋白质的盐析硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度离子强度v盐析作用主要是由于大量中性盐的加入，盐析作用主要是由于大量中性盐的加入，使水的活度降低，原来溶液中的大部分自使水的活度降低，原来溶液中的大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。坏蛋白质分子表面的水化层。2 2、有机溶剂沉淀法、有机

31、溶剂沉淀法与水互溶的有机溶剂与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙如甲醇、乙醇和丙酮等酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温低。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、度、pHpH和离子强度而变化。在一定温度、和离子强度而变化。在一定温度、pHpH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分离蛋白质。浓度也可以分离蛋白质。v有机溶剂冷却到有机溶剂冷却到-40-40至至-60-60v在不断地搅拌下逐滴加入有机溶剂以防在不断地搅拌下逐

32、滴加入有机溶剂以防局部浓度过高局部浓度过高v有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一使水溶液的介电常数降低。介电常数一使水溶液的介电常数降低。介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的吸引的降低将增加两个相反电荷之间的吸引力。蛋白质分子表面可解离基团的离子力。蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似，与蛋白质争夺水化水，致使盐析相似，与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体

33、的形成并沉淀。蛋白质聚集体的形成并沉淀。v聚乙二醇沉淀聚乙二醇沉淀 水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质沉淀。聚乙二醇的主要作用可起蛋白质沉淀。聚乙二醇的主要作用可能是脱去蛋白质的水化层。蛋白质在聚能是脱去蛋白质的水化层。蛋白质在聚乙二醇中的溶解度几乎与溶液中的盐浓乙二醇中的溶解度几乎与溶液中的盐浓度，度，pH甚至蛋白质的绝对（水中）溶解甚至蛋白质的绝对（水中）溶解度无关。这些表明聚乙二醇与蛋白质亲度无关。这些表明聚乙二醇与蛋白质亲水基团发生相互作用并在空间上阻碍蛋水基团发生相互作用并在空间上阻碍蛋白质与水相接近。白质与水相接近。3、等电点沉淀、等电点沉

34、淀利用两性电解质在等电点时溶解度最低，利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀法。称为等电点沉淀法。在溶液的在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀。集在一起而沉淀。4 4、温度对蛋白质溶解度

35、的影响、温度对蛋白质溶解度的影响 在一定的温度范围内，约在一定的温度范围内，约0 0一一4040之间，之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，例如人的血红蛋而增加，但也有例外，例如人的血红蛋白从白从0 0到到2525之间，溶解度随温度上升之间，溶解度随温度上升而降低。在而降低。在4040一一5050以上，大部分蛋白以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，在中性质变得不稳定并开始变性，在中性pHpH介介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一

36、般都在操作一般都在00或更低的温度下进行。或更低的温度下进行。一、电泳一、电泳v带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。率即异，在电泳时可以分开。1.1.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。电泳。2.2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。区域。三、依据电荷状况分离蛋白质三、依据电荷状况分离蛋白质（1 1）纸电泳

37、、薄膜电泳：用滤纸、薄膜作支）纸电泳、薄膜电泳：用滤纸、薄膜作支持物。持物。（2 2）粉末电泳：淀粉、纤维素粉作支持物。）粉末电泳：淀粉、纤维素粉作支持物。（3 3）凝胶电泳：用凝胶（聚丙烯酰胺、琼脂）凝胶电泳：用凝胶（聚丙烯酰胺、琼脂糖）作支持物。糖）作支持物。a)a)圆盘电泳（圆盘电泳（disc)disc)：玻璃管中进行的凝胶：玻璃管中进行的凝胶电泳。电泳。b)b)平板电泳（水平式、垂直式）：铺有凝平板电泳（水平式、垂直式）：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。胶的玻板上进行的电泳。最早的电泳装置最早的电泳装置聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)原理原理 v聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰

38、胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide(acrylamide，AcrAcr)和交联剂和交联剂N N，N-N-甲叉双甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide(methylene-bisacrylamide，BisBis)在加速剂四甲基乙二胺在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)和催和催化剂过硫酸铵化剂过硫酸铵(AP)(AP)的作用下聚合形成的三的作用下聚合形成的三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE)。凝。凝胶的浓度和孔径可调节。胶

39、的浓度和孔径可调节。v根据其有无浓缩效应，根据其有无浓缩效应，PAGEPAGE分为连续系统与分为连续系统与不连续系统两大类：不连续系统两大类：v连续电泳体系中缓冲液连续电泳体系中缓冲液pHpH值及凝胶浓度相同，值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；效应；v不连续电泳体系中，由于缓冲液离子成分、不连续电泳体系中，由于缓冲液离子成分、pHpH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。具

40、有浓缩效应，故分离效果更好。v不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶组不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶组成，两层玻璃板中排列顺序依次为上层浓缩胶、成，两层玻璃板中排列顺序依次为上层浓缩胶、下层分离胶。下层分离胶。PAGE原理原理v浓缩胶（浓缩胶（3 3），缓冲液为），缓冲液为pH6.7pH6.7的的Tris-Tris-HClHCl，其作用是使样品进入分离胶前，被，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的区带，从而提高分离效果。浓缩成窄的区带，从而提高分离效果。v分离胶（分离胶（7.07.07.57.5），缓冲液为），缓冲液为pH8.9pH8.9的的Tris-HClTris-HCl，大部分

41、蛋白质在此，大部分蛋白质在此pHpH条件下带负电荷。此胶主要起分子筛作条件下带负电荷。此胶主要起分子筛作用。用。v电极缓冲液为电极缓冲液为pH8.3pH8.3甘氨酸甘氨酸Tris-HClTris-HCl。分离胶分离胶浓缩胶浓缩胶样品样品聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳（聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳（disc）示意图）示意图 样品浓缩效应样品浓缩效应(1)(1)凝胶孔径的不连续性凝胶孔径的不连续性 上述凝胶中，浓缩胶为上述凝胶中，浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔

42、胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。很窄的区带。(2)(2)缓冲体系离子成分及缓冲体系离子成分及pHpH值的不连续性值的不连续性 在两层在两层凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷(简称简称Tris)Tris)及及HClHCl。TrisTris的作用是维持溶液的电中性及的作用是维持溶液的电中性及pHpH值，是缓冲值，是缓冲配对离子。配对离子。HClHCl在任何在任何pHpH溶液中均易解离出溶液中均易解离出ClCl-，在电场中迁移率快，走在最前面称

43、为快离子。在电场中迁移率快，走在最前面称为快离子。v在电极缓冲液中，除有在电极缓冲液中，除有TrisTris外，还有甘氨酸外，还有甘氨酸(glycine)(glycine)，其，其pIpI=6.O=6.O，在，在pH8.3pH8.3的电极缓冲液的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根中，易解离出甘氨酸根(NH(NH2 2CHCH2 2COOCOO-)，而在，而在pH6.7pH6.7的凝胶缓冲体系中，的凝胶缓冲体系中，GlyGly解离度仅有解离度仅有O.1O.11 1，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。v血清中大多数蛋白质血清中大多数蛋白质pIpI在在5.O5.O左右

44、，在左右，在pH6.7pH6.7或或8.38.3时均带负电荷向正极移动，迁移率介于快离时均带负电荷向正极移动，迁移率介于快离子与慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子子与慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带。形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带。v当进入当进入pH8.9pH8.9的分离胶时，的分离胶时，GlyGly解离度增加，其解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；因此有效迁移率超过蛋白质；因此ClCl-及及NHNH2 2CHCH2 2COOCOO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于相对沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于相对分子质量大，被留在后面，逐渐分成多个区

45、带。分子质量大，被留在后面，逐渐分成多个区带。(3)(3)电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性 电泳开始后，快离子电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。缩成狭窄的区带。分子筛效应分子筛效应 v大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。这就是分子筛效应。v蛋自质进入蛋自质进入pH8.9pH8.9的同一孔径

46、的分离胶后，分子的同一孔径的分离胶后，分子小且为球状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，小且为球状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后走在前面；反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质面，从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。分成各自的区带。v这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。分子后流出。电荷效应电荷效应 v在在pH8.9pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的分离胶中，各种带净

47、电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则的蛋白质有不同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反之，则慢。因此，各种蛋白质迁移快；反之，则慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳。泳。垂直板电泳的优越性垂直板电泳的优越性进行进行PAGEPAGE时，一般将溶胶灌在两块玻璃板之间，聚合后制时，一般将溶胶灌在两块玻璃板之间，聚合后制成垂直板，垂直板电泳的优越性有：成垂直板，垂直板电泳的优越性有：表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，条带更清表面积大而薄，便于通冷却水以降低热效应，

48、条带更清晰；晰；在同一块胶板上，可同时进行在同一块胶板上，可同时进行1010个以上样品的电泳，便个以上样品的电泳，便于在同一条件下比较分析鉴定，还可用于印迹转移电于在同一条件下比较分析鉴定，还可用于印迹转移电泳及放射自显影；泳及放射自显影；胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高，不仅胶板制作方便，易剥离，样品用量少，分辨率高，不仅可用于分析，还可用于制备；可用于分析，还可用于制备；胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于长期保存胶板薄而透明，电泳染色后可制成干板，便于长期保存与扫描；与扫描；可进行双向电泳。可进行双向电泳。垂直板电泳垂直板电泳v测定分子量测定分子量v纯度鉴定纯度鉴定SDS-

49、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等电聚焦等电聚焦(IEF)v等电聚焦电泳：利用两性电解质在凝胶中建立等电聚焦电泳：利用两性电解质在凝胶中建立pHpH梯度，当蛋白质移动到其等电点时梯度，当蛋白质移动到其等电点时pH pH，净电荷为，净电荷为零，在电场中不再移动。零，在电场中不再移动。等电点的测定等电点的测定 二、离子交换层析二、离子交换层析 离子交换层析是利用离子交换剂上的离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团可解离基团(活性基团活性基团)对各种离子亲和力对各种离子亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。不同而达到分离目的的一种层析分离方法。v离子交换剂是含有若干

50、活性基团的不溶性离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分物质高分子物质。通过在不溶性高分物质(母母体体)上引入若干可解离基团上引入若干可解离基团(活性基团活性基团)而而制成。制成。v离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的不离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。常用的阳离子交换剂为同进行分离纯化。常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素（羧甲基纤维素（CM-CCM-C），阴离子交换剂为），阴离子交换剂为二乙基氨基乙基纤维素（二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-CDEAE-C）。）。v按活性基团的性质不同，离子交换剂可按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离