基因组注释详解讲解课件.ppt

1、基基 因因 组组 注注 释释基因组测序相关技术发展基因组测序相关技术发展198119861989199119941998200020022003200620072008In the coming future200920102005Affy launches Gene Expression microarraysRise of Genbank databases from DNA sequencingABI commercializes first automated DNA sequencerLow hanging fruit:cystic fibrosis mutationidentifi

2、ed3700 DNA Analyzer in Human Genome Project;DNA sequencing goes industrialFirst microarray publication-on ArabidopsisILMN launches gene expression arraysHuman Genome Project&Celera Genomics completes first draft genomeHapmap project launchedHapmap 1st phase data releaseAffy&ILMN both launched 100K g

3、enotyping arraysRise of Genome Wide Association Studies(GWAS)Roche GS FLX launchedILMN bought Solexa;launches GAABI SOLiD 1.0Launched!The SequencingShake up!SOLiD 3.0:100GB out of the box!The 3rd Generation Sequencing will be launchedILMN HiSeq 2000 launched30X的覆盖率(Solexa or SOLiD)序列预处理（质量控制）基因组分型技术

4、 SNP、Indel、CNV、染色体结构变异及注释 与表型相关的全基因组关联分析和功能连锁性分析实实 验验数据分析数据分析 30X以上的覆盖率(Solexa or SOLiD)序列预处理（质量控制）甲基化位点检测及注释 转录组测序(RNA-seq sequencing)microRNA测序(microRNA sequencing)实实 验验数据分析数据分析 mRNA打断、反转录、加接头 De novo 454 构建转录图谱 Reference barcode建库 Solexa，SOLiD 序列预处理（质量控制）表达丰度统计 注释(功能、代谢通路、表达差异比较)未知转录本的分析实实 验验数据分析

5、数据分析 microRNA提取、两头加接头、反转录、建库 (Solexa or SOLiD)序列预处理（质量控制）已知microRNA丰度统计 未知microRNA预测及丰度统计 元基因组测序(meta-genome sequencing)未知病毒检测(Unknown virus detecting)实实 验验数据分析数据分析 DNA提取、建库 序列预处理（质量控制）拼接、注释(功能、代谢通路)丰度统计、比较元基因组实实 验验数据分析数据分析 低量RNA、DNA处理、建库 与宿主、微生物、病毒数据库比较 未知病毒的发现及预测v基于BAC的方法：先把基因组打碎成200300kb的片段并制成BAC

6、文库，再选择一些BAC进一步打碎成3kb左右的小片段，测序并拼接。v全基因组鸟枪法：把基因组直接打碎成3kb左右的小片段，测序并拼接。v 全基因组DNAv 随机打成大片段 选择并克隆v 大片段排序，选择v 再打碎，克隆，测序，拼接基因组DNA随机打碎测序并拼接v 能充分利用正反向测序的配对信息,避免重复序列造成的错误拼接v 能处理数以百万甚至千万计的数据 程序并行化 高效率比对 能逐步拼接SequenceGENESCANORF FinderGENEMARKGene PredictionBlastnFastaHomology Search编码区启动子转录起始位点非翻译区被转录区 起始密码子 终止

7、密码子53 上游 转录终止位点下游SequenceGENESCANORF FinderGENEMARKGene PredictionBlastnFastaHomology Searchv一段序列 从起始密码子（start codon）开始,到终止密码子（stop codon）结束，而且其中不包含其它终止密码子。微生物基因组中 80%-90%的序列参与编码 主要问题：如果有两个或更多重叠的阅读框，哪一个是基因(假定只可能有一个)最可靠的方法 同源搜索(使用 BLAST 或 FASTA等)主要困难：在无已知同源性信息的情况下寻找基因vWebAccesshttp:/bioweb.pasteur.fr

8、/seqanal/interfaces/getorf.htmlvApplication(Download Emboss)i.Code to use：选择不同的codon usage table，包含有：(1)Standard (2)Standard(with alternative initiation codons)(3)Vertebrate Mitochondrial (4)Yeast Mitochondrial (5)Mold,Protozoan,Coelenterate Mitochondrial and Mycoplasma/Spiroplasma (6)Invertebrate M

9、itochondrial (7)Ciliate Macronuclear and Dasycladacean (8)Echinoderm Mitochondrial (9)Euplotid Nuclear (10)Bacterial (11)Alternative Yeast Nuclear (12)Ascidian Mitochondrial (13)Flatworm Mitochondrial (14)Blepharisma Macronuclear (15)Chlorophycean Mitochondrial (16)Trematode Mitochondrial (17)Scened

10、esmus obliquus (18)Thraustochytrium Mitochondrialii.最小的开放阅读框由多少个核甘酸组成，预设值为30，也就是10个氨基酸。iii.Type of output：可选择不同的输入结果，包含有：(1)Translation of regions between STOP codons (2)Translation of regions between START and STOP codons (3)Nucleic sequences between STOP codons (4)Nucleic sequences between START a

11、nd STOP codons (5)Nucleotides flanking START codons (6)Nucleotides flanking initial STOP codons (7)Nucleotides flanking ending STOP codonsfastagcgphylipemblswissncbinbrfgenbankigcodatastrideracedbstadentextfitchmsfclustalphylipphylip3asn1Metagenomics Metagenomics Community GenomicsCommunity Genomics

12、 Environmental GenomicsEnvironmental Genomicsv Who is there?diversity&abundancev What they are doing?Metabolic&interactionv Why they are there?Ecological relationsSpecies complexityAcid mine drainage1 100 1000 10000Sea waterHuman gutSoilAABCDAIsolated genome single source of DNAMetagenome multiple s

13、ource of DNAXreadsassembliesgenesannotationTraditional genomicsreadsassembliesORFsannotationMetagenomics?Huge Multiple organisms Fragmental Huge Partial ORFs Wrong ORFsQ:Solution?A:Clustering.Protein families Novel families ORF validation Huge Multiple organisms Uneven coveragetranscriptionRNA splic

14、ingproteintranslationexon1DNAexon2exon3intron1intron2promotergtgtagagupstreamdownstream5UTR3UTRgtgtagagPrimary RNAtranscript35Mature RNAUTSuga,uaa,uag3 aaa5v找出在一段DNA序列中，是否存在ORF，亦及“基因”。v判明基因的结构,包括起止位置,外显子/内含子边界,启动子,polyA区域,非转译区（UTR）等。v预测真基因和“假基因”（pseudogene）及可能的剪切位点。基于同源性的基因预测法“从头开始”(Ab initio)预测法 综合

15、使用以上两种方法:如TwinScan 其它方法:如数字信号处理，Z曲线,等将基因组序列与EST（expressed sequence tag，表达序列标记)或cDNA等相比较(用Sim4等方法),从而找出与 mRNA相对应的区域。将基因组序列与蛋白质数据库相比较(用 BLASTX等方法)，从而找出可能的编码区。将预测得到的多肽与蛋白质数据库相比较将基因组序列与同源性相近物种的基因组相比较,找出保守区域。v 优点：优点：基于已有的生物学数据,因此结果更有生物学意义v 缺点缺点:受限于已有的生物学数据 数据库可能存在的误差 对于相似程度应如何定义a.序列局部相似比较。试图发现有生物意义保守序列，而

16、不一定要全局相似。可以由局部相似得出两序列可能有相同功能或功能相关。b.比较得到的是相似性，并非同源性，我们必须根据相似性结合其他证据做出判断。vBlast Web:http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Application:http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/download.shtmlv BLAST找出的结果仅仅是表示两条序列之间有局部相似，与同源性关系不大，认定功能相同或相关也不是充分的。一定要结合其他的分析结果判断。v BLAST结果中相似部分需要认真仔细观察。看看相似的部分是生物上功能重要的保守部分，还是一些无关紧要的重复序

17、列v 结合已知的信息（比如该蛋白不可能有某种功能和可能有某种功能），注意在比较中排在后面的是否与其他已知信息相符的记录v 统计上有意义与生物上有意义是有差别的http:/ 母女一块竞逐母女一块竞逐 v也有出问题的时候，虽然很相似，但可能没有什么关系v Blast No Hits 并不是表明找不到同源accaggttacccggttaaccttacccagatttac|accaggtaaccaggttaactttactcagatttac默认WordSize=11,如果找不到11个完全匹配的就无法延伸出Hits 可以修改WordSize,但是wordsize越小会导致搜索速度慢找到无用的匹配也会增

18、多 解决方案：PatternHunter,ssearch(fasta)v通过同源比对进行蛋白功能注释：Gene Duplication引入的同源比对判断误差，并不是匹配分数最高的就是功能类似解决方案:需要引入物种进化树辅助判断 隐马科夫模型（Hidden Markov Model，HMM）*人工神经网络（Neural Network）动态规划法 决策树 语言学方法 线性判别法v GENESCANhttp:/genes.mit.edu/GENSCAN.htmlv GENEMARKhttp:/opal.biology.gatech.edu/GeneMark/eukhmm.cgiv FGENESHh

19、ttp:/ structural features of rice chromosome 4Statistics of Annotated Chromosome 4Total Genes4,658Average gene size(bp)2,779Gene density(bp per gene)7,441Average exon per gene4.4Average exon size(bp)340Average intron size(bp)376Average BAC GC(%)44.16Average gene GC(%)47.22Average intergenic GC(%)42.

20、30Average exon GC(%)53.0Average intron GC(%)39.0 Classification of repetitive sequences on chromosome 4Number of repeatsLength of repeatsPercentage of lengthretrotransposon 89514,016,12655.60%transposon3471913,10212.60%MITES138851,448,63820.00%other repeat5693851,19911.80%total320007,229,065-Functio

21、nal classificationCellular metabolism55511.92%Transcription2595.56%Signalling2565.51%Transport1984.14%Plant defence1613.47%Protein fate851.84%Growth811.76%Other306365.76%Total4658Indica Guangluai4Japonica NipponbareTotal length(bp)2,319,7282,426,015Number of genes388415Gene density(bp per gene)5,979

22、5,846Average exons per gene5.25.1Average introns per gene4.24.1Average exon size(bp)281306Average intron size(bp)320316Number of SNPs9,0569,056SNPs in exon1,4952,132SNPs in intron1,6551,974SNPs in intergenic region5,9064,950Number of Indels63138Indels 10Kb311Indels 1-10Kb3725Indels 90)ReferenceGet C

23、DSsPredicted GeneCollectionGeneCollectionGeneDBFormatdbGeneDBFormatdbGeneBBHClustWProCalDs/DnClassificationGO classificationKegg Pathway1.Genome Sequencer 20 GS 20 2005 GS FLX2007 454 life Sciences/Roach 2.Solexa Genome Analysis System SolexaSolexa Ltd/illumina3.Sequencing by Oligonucleotide Ligatio

24、n and Detection SOLiD 2007 SummerAgencourt/ABI SequencerRead lengthHigh-throughputRunning timeCost454 GS-20100 bp20 Mb/run200 k reads/run5.5 h5000-7000 USD/run0.00025USD/bp 454 GS-FLX200-250 bp100 Mb/run500 k reads/run7-8 h-1030Solexa25-35 bp1000 Mb/run28 m reads/run2-3d3000 USD/runSolid25-50 bp100 Mb2-4 m reads/run1 d?ABI 3730Xl700 bp70 kb/run96 reads/run2 h150 USD/run0.0025USD/bp深度测序数据分析流程深度测序数据分析流程