第七章重组DNA导入受体细胞课件.ppt

1、第七章 重组DNA导入受体细胞 载体与目的基因连接后，体系中可能存在下载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分子：列分子：a.未连接的载体分子未连接的载体分子b.未连接的未连接的DNA片段片段c.载体的自连载体的自连d.含有错误插入片段的重组含有错误插入片段的重组DNA分子分子e.重组重组DNA分子分子 转化过程中，这些分子同时被转转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。移到宿主细胞内。未连接的分子即使被细菌摄取，只未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特殊的条件下才能复制，寄主的有在特殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些酶可降解这些DNA片段。片段。自连的载体和错误插入的重组质自连的载体

2、和错误插入的重组质粒可以进入宿主细胞进行正常的复制粒可以进入宿主细胞进行正常的复制一、转化方法一、转化方法 自然界中，转化并不是细菌遗传信自然界中，转化并不是细菌遗传信息传递的主要方式，实验室中只有小部息传递的主要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的转化。分的细菌可以很容易的转化。正常条件下，大部分细菌包括大肠正常条件下，大部分细菌包括大肠杆菌，只能吸收有限的杆菌，只能吸收有限的DNA，为了提高，为了提高转化效率，建立了一系列的转化方法：转化效率，建立了一系列的转化方法：供体菌游离供体菌游离DNADNA供体菌供体菌DNADNA（转化因子）（转化因子）转化示意图转化示意图 a.热激法转化感

3、受态细胞热激法转化感受态细胞 b.PEG介导的原生质体转化介导的原生质体转化 c.高压电穿孔法转化高压电穿孔法转化 d.显微注射法转化显微注射法转化 e.接合转化接合转化f.噬菌体转染噬菌体转染 大肠杆菌常用转化方法的比较大肠杆菌常用转化方法的比较 转转 化化 方方 法法转转 化化 效效 率率Ca 诱诱 导导107-8原生质体转化原生质体转化105-6噬菌体转化噬菌体转化107-8电电 穿穿 孔孔 法法106-9（100Kb）接接 合合 转转 化化104-5一）受体细胞应具备的条件一）受体细胞应具备的条件 a.限制性缺陷型限制性缺陷型RecB-，RecC-，hsdR-（外切、内切酶）（外切、内

4、切酶）b.重组整合缺陷型重组整合缺陷型RecA-（对于用于基（对于用于基因扩增或基因高效表达的受体）因扩增或基因高效表达的受体）c.具有较高的转化效率具有较高的转化效率 d.具有与重组体互补的遗传性状具有与重组体互补的遗传性状 e.感染与寄生缺陷型感染与寄生缺陷型 安全角度的要求。安全角度的要求。二）大肠杆菌感受态的制备与转化二）大肠杆菌感受态的制备与转化 感受态细胞感受态细胞(Competent cells):受体受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外膜的通透性发生变化，成为能容许有外源源DNA的载体分子通过的感受态细胞的载

5、体分子通过的感受态细胞(competent cells)。1、热激法转化感受态细胞、热激法转化感受态细胞2 2、氯化钙法转化、氯化钙法转化 在某些情况下，在某些情况下，CaCl2只影响只影响DNA的结合，并不影响细胞的吸收，的结合，并不影响细胞的吸收，当当DNA分子加到处理的细胞内，仍然分子加到处理的细胞内，仍然吸附在细胞的外部，并没有转化到细吸附在细胞的外部，并没有转化到细胞质中，将胞质中，将DNA带入感受态细胞的条带入感受态细胞的条件可提高温度到件可提高温度到42。3、PEG介导的原生质体转化介导的原生质体转化4、高压电穿孔法、高压电穿孔法（1）基本原理）基本原理在高压电场的作用下，细胞膜

6、发生临时性破裂形在高压电场的作用下，细胞膜发生临时性破裂形成微孔，细胞外环境中的核酸分子便会穿孔而入，并成微孔，细胞外环境中的核酸分子便会穿孔而入，并最终进到细胞核内部。最终进到细胞核内部。(2)影响因素影响因素脉冲的最大电压脉冲的最大电压 脉冲持续的时间脉冲持续的时间 与与DNA浓度则无多大关系浓度则无多大关系电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。对于不适合用传统方法转染的细胞，用电穿孔法对于不适合用传统方法转染的细胞，用电穿孔法得到的永久转化的频率约为得到的永久转化的频率约为10-410-5之间。之间。5、显微注射法转化、显微注射法转化在显微镜下，

7、用显微操作装置对细胞进行解剖在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖手术、人工受精、细胞核移植、基因注入、细手术、人工受精、细胞核移植、基因注入、细胞内微量注射、胚胎切割等的技术。胞内微量注射、胚胎切割等的技术。（1）真正的显微注射）真正的显微注射(true microinjection)法法 DNA是由注射针直接注入细胞是由注射针直接注入细胞（2）“穿刺穿刺”(pricking)导入法导入法 DNA是处在细胞周围培养基中，它通过穿刺形成是处在细胞周围培养基中，它通过穿刺形成的小孔进入细胞的内部，或是随穿刺的针头一道进入的小孔进入细胞的内部，或是随穿刺的针头一道进入的。的。用显微注射法转移基因

8、的效率明显地超出其它方用显微注射法转移基因的效率明显地超出其它方法。显微注射用的受体细胞，多数是沿培养皿贴壁生法。显微注射用的受体细胞，多数是沿培养皿贴壁生长的长的单层细胞单层细胞。显微注射分为显微注射分为 6、接合转化、接合转化不需要细菌细胞不需要细菌细胞的直接接触的直接接触基因重组的范围基因重组的范围更小，只限于更更小，只限于更小的一段染色体小的一段染色体片段和少数几个片段和少数几个紧密连锁的基因紧密连锁的基因 细菌的细菌的“接合接合”状态状态接合-F+FF+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient染色体染色体质粒F+菌F-菌F质粒的半保留转移质粒的半保留转移F+菌染色体H

9、fr质粒F+菌F质粒转移的不同结果质粒转移的不同结果F 质粒二、二、phage DNA的转化的转化 两种方法可以将噬菌体两种方法可以将噬菌体DNA转入细菌：转入细菌：1）转染（转染（transfection）：是将纯化）：是将纯化的噬菌体的噬菌体DNA通过热激的方法转化感受态通过热激的方法转化感受态大肠杆菌的过程。大肠杆菌的过程。2）体外装配（体外装配（in vitro packaging）：）：DNA的转染效率不高，如果将重组的的转染效率不高，如果将重组的分分子装配成头子装配成头-尾结构的病毒粒子，将极大的尾结构的病毒粒子，将极大的提高效率。提高效率。噬菌体转化大肠杆菌的方法 一）一）DNA

10、的转染的转染 DNA的转染作用，是一种低效的过程。的转染作用，是一种低效的过程。使用未经任何基因操作处理的新鲜制备的使用未经任何基因操作处理的新鲜制备的 DNA，其，其典型的转染效率（即每微克典型的转染效率（即每微克DNA转染产生的噬菌斑转染产生的噬菌斑数目），也仅为数目），也仅为 105106之间。之间。体外连接的结果，转染效率便下降到了体外连接的结果，转染效率便下降到了104103左右。左右。二）二）噬菌体的体外装配噬菌体的体外装配 有两种不同的系统可以应用：有两种不同的系统可以应用：一种是一种是cos位点突变的噬菌体的单品系位点突变的噬菌体的单品系系统。系统。另一种系统需要两种不同的缺陷品系，另一种系统需要两种不同的缺陷品系，一个是基因一个是基因D的突变体，另一个品系是基的突变体，另一个品系是基因因E的突变体。的突变体。噬菌体体外装配的两种系统噬菌体体外装配的两种系统