第六章-一般毒性作用课件.ppt

1、第六章第六章 一般毒性作用一般毒性作用（common toxicity of chemical poison）毒性评价或安全性评价的基本目的毒性评价或安全性评价的基本目的毒理学研究方法毒理学研究方法 人体观察人体观察 流行病学研究流行病学研究动物实验动物实验人群调查人群调查以动物实验为中心，动物实验的设计、实施、结果观以动物实验为中心，动物实验的设计、实施、结果观察和评价是毒理学研究察和评价是毒理学研究 的基本功。的基本功。动物实验动物实验整体动物实验整体动物实验（in vivo）体外试验体外试验（in vitro）一般毒性一般毒性试试 验验特殊毒性特殊毒性试试 验验微微 生生 物物试试 验验

2、哺乳动物哺乳动物试试 验验急性毒性急性毒性亚急性毒性亚急性毒性亚慢性毒性亚慢性毒性慢性毒性慢性毒性致突变致突变致癌致癌致畸致畸致突变致突变器官水平器官水平组织水平组织水平细胞水平细胞水平亚细胞水平亚细胞水平分子水平分子水平v 实验设计的统计原则 随机随机：代表性：代表性 对照对照：鉴别处理因素与非处理因素的差异鉴别处理因素与非处理因素的差异及处理因素效应大小，消除和减少随机化原及处理因素效应大小，消除和减少随机化原则所不能控制的抽样误差及实验者操作熟练则所不能控制的抽样误差及实验者操作熟练程度等造成的差异程度等造成的差异 空白空白/阴阴/阳性对照，自身对照，历史性对照阳性对照，自身对照，历史性

3、对照 重复重复：样本量、重复次数：样本量、重复次数毒理学实验的基本原则v 动物选择 首先考虑代谢与毒性效应上与人一致首先考虑代谢与毒性效应上与人一致 注重对受试物毒性敏感的动物物种注重对受试物毒性敏感的动物物种 种属、品系、个体差异种属、品系、个体差异 自然寿命不太长、易于饲养和实验操自然寿命不太长、易于饲养和实验操作、经济易获得作、经济易获得 动物年龄、性别动物年龄、性别毒理学实验基本原则n根据对动物微生物控制的净化水平，实验动物分根据对动物微生物控制的净化水平，实验动物分为：无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物为：无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物（SPFSPF动物）、清洁动物和普通动物

4、。动物）、清洁动物和普通动物。n实验中小动物至少应为清洁动物及以上级别，国实验中小动物至少应为清洁动物及以上级别，国际上际上SPFSPF动物已成为毒理学实验的标准实验动物。动物已成为毒理学实验的标准实验动物。v 剂量分组 实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需和可靠的办法。危害的必需和可靠的办法。除对照组外，一般设除对照组外，一般设3 3个或个或3 3个以上剂量组，以观个以上剂量组，以观察剂量一反应察剂量一反应(效应效应)关系，确定受试化学物引起关系，确定受试化学物引起的毒效应及其毒性参数。的毒效应及其毒性参数。v 质量控制 优良实验室规

5、范（优良实验室规范（GLPGLP）实验操作规程实验操作规程 试剂选择试剂选择 仪器使用仪器使用 实验环境实验环境 目的要求补充参考书第一节第一节 急性毒性作用急性毒性作用acute toxicityacute toxicity 机体一次或24h内多次接触外源化学物后在短期内（最长14天）所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应一、急性毒性的概念急性毒性（急性毒性（acute toxicityacute toxicity）急性毒性的概念 In 1984,5,000 people died and 30,000 were permanently disabled due

6、to exposure to methyl isocyanate（异氰酸甲酯，MIC）from an industrial accident in India Many people die each year from inhaling carbon monoxide from faulty heaters急性毒性的概念需要注意需要注意 急性接触的次数 一次:经口、注射；呼吸道、皮肤(一段时间)24h多次 中毒效应出现的时间 不能仅以接触毒物后毒性症状出现的时间，主要以接触毒物的时间，观察时间：714天 强度 一次性大剂量，中毒症状明显，常发生死亡二、急性毒性试验的目的 求出致死剂量及其他急

7、性毒性参数 观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征 为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据 为毒理学机制研究提供线索 急性毒性的参数 半数致死剂量：LD50化合物经口急性毒性分级标化合物经口急性毒性分级标准准急性毒性的参数 剂量-反应曲线急性毒性的参数 ED,TD：ED50,TD50,急性毒性的参数 急性毒作用带：Zac=LD50/Limac 霍恩法（Horn）：4个剂量组 平均移动内插法（moving average interpolation）改进寇氏法（Karber法、平均致死量法）Bliss法（多用于新药临床毒理学研究，计算复杂）最大似然性法（maximu

8、m likelihood method），最精确的计算方法LD50的几种计算方法改进寇氏法改进寇氏法 霍恩法（Horn）平均移动内插法（moving average interpolation）改进寇氏法 Bliss法 最大似然性法（maximum likelihood method），最精确的计算方法LD50的几种计算方法总体原则总体原则三、急性毒性试验方法的要点 实验动物 染毒途径 染毒剂量 观察周期 观察指标的选择、计算方法和评价 急性毒性反应与人近似 易于饲养、操作方便 繁殖力较强，数量较大 价格较低，易于获得（一）实验动物的选择和要求一）实验动物的选择和要求主要原则主要原则除特殊需要

9、外，首选哺乳动物除特殊需要外，首选哺乳动物实验动物的物种和品系实验动物的物种和品系v 啮齿类啮齿类（rodent species）v 非啮齿类非啮齿类（nonrodent species）小鼠：昆明种、NIH、ICR 大鼠：Sprague-Dawley（SD）、Wistar 犬或猴 为了有利于预测化合物对人的危害，要求选择两种以上为了有利于预测化合物对人的危害，要求选择两种以上的实验动物，最好一种为啮齿类，一种为非啮齿类，分别求的实验动物，最好一种为啮齿类，一种为非啮齿类，分别求出其急性毒性参数。出其急性毒性参数。v 根据接触途径选择实验动物 急性经口和吸入毒性试验大鼠、小鼠 急性经皮毒性试验

10、成年大鼠、豚鼠、家兔实验动物的物种和品系 大鼠：180-240g 小鼠：18-25g 家兔：2-2.5kg实验动物的年龄和体重实验动物的年龄和体重v 刚成年、健康、未曾交配和受孕的动物v 小动物根据体重v 同一次试验同一批实验动物体重变异范围不应超过平均体重的20%实验动物的性别实验动物的性别 雌雄各半 如雌、雄动物毒效应有明显差异，应分别并求出雌性和雄性动物的LD50值 特殊的试验研究可仅作单一性别的急性毒性试验实验动物分组与数量实验动物分组与数量 根据组数和每组数量来决定数量 LD50，一般为4-6组 大、小鼠每组10只，犬类6只 严格遵循随机、均衡的原则实验动物的预检实验动物的预检 给药

11、前检疫观察 大、小鼠、兔、豚鼠1周，犬猴23周适应新环境，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响筛检健康状况不符合试验要求的动物实验动物的给药前禁食处理实验动物的给药前禁食处理 经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰 大、小鼠隔夜禁食，染毒2h后提供饲料 经口多次染毒可不禁食（二）受试物及处理（二）受试物及处理 理化特性 水溶液、混悬液、油溶液 水溶性受试物：蒸馏水、去离子水、生理盐水，保持与体内渗透压一致（注射）水不溶性受试物：溶于或悬浮于适当的有机溶剂中 受试物一般应临用前新配受试物成分和配方应稳定不变受试物成分和配方应稳定不变适宜容积染毒适宜容积染

12、毒 毒性较大的受试物给药量较小 毒性较低的受试物常需较大量的染毒 给药容积根据染毒途径和实验动物经口：20ml/kg(空腹动物)经皮：2ml/kg 静脉：1ml/kg(5min以上)受试物及处理(三三)染毒方法染毒方法 模拟实际接触的途径和方式 有利于不同化学物之间结果的比较 受试物的性质和用途 受试物毒性评价程序的要求 工业毒物：经呼吸道、皮肤 农用化学物：经口、皮肤、呼吸道 药品：经口、注射、皮肤 食品：经口 环境污染物：经口、呼吸道、皮肤 染毒途径染毒方法 消化道、呼吸道、皮肤、注射 染毒途径影响受试物急性毒性 染毒方法 不同途径的吸收量和吸收速率 吸收速率：静脉注射呼吸道肌肉注射腹腔注

13、射皮下注射消化道皮内注射经皮 同一受试物不同染毒途径LD50的大小通常符合上述规律经口（胃肠道）染毒LD50值来比较不同化学物急性毒性大小 灌胃：溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内，等容量灌胃法 吞咽胶囊：将受试物装入胶囊中，放至舌后部，迫使动物咽下。犬、猴 喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入染毒方法灌胃法灌胃法 灌胃法是用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内。小鼠的灌胃针长约45cm，直径为1mm，大鼠的灌胃针长约68cm，直径约1.2mm。灌胃针的尖端焊有一小圆金属球，金属球为中空的。焊金属球的目的是防止针头刺入气管或损伤消化道。针头金属球端弯曲成20左右的角度，以适应

14、口腔、食道的生理弯曲度走向染毒方法 鼠类的灌胃法：用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力,此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为34cm，大鼠或豚鼠为46cm。常用灌胃量小鼠为0.21ml，大鼠14ml，豚鼠15ml 静式吸入染毒 动式吸入染毒经呼吸道染毒v 气管内注入染毒方法v 吸入染毒静式吸入染毒染毒方法l方法：一定体积的密闭容器，加入易挥发的液态或气态受试物l染毒柜体积、动物数、时间，依据实验动物最低需气量计算l优点：简单、方便、受试物消耗少，

15、适合于小鼠l缺点：氧气减少，浓度不稳定，经皮吸收，不适合稍大动物，挥发性不强的受试物用此法受限实验动物最低需气量及不同体积染毒柜应放置动物数关系实验动物最低需气量及不同体积染毒柜应放置动物数关系 动物种动物种属属呼吸通气量呼吸通气量(L/小时小时)最低需气量最低需气量(L/小时小时)不同容积染毒柜放置动物数不同容积染毒柜放置动物数(只只)25L50L100L300L小小 鼠鼠大大 鼠鼠1.4510.183.4530.5356101121512364056 动式吸入染毒 将实验动物处于有空气流动的染毒柜中，新鲜空气不断流入，污染空气不断流出。温度、湿度、氧及二氧化碳分压相对恒定，并有随时补充受试

16、物，维持浓度稳定。可采样监测受试物浓度，可持续接触受试物，无时间限制 染毒方法动式吸入染毒装置的组成l染毒柜l机械通风系统l配气系统染毒方法动式吸入染毒设备动式吸入染毒设备A 整体暴露整体暴露 B 口鼻暴露口鼻暴露动式吸入染毒优缺点染毒方法l优点：受试物浓度和氧分压比较稳定l缺点：设备要求高，消耗受试物量很大，操作比较复杂，费时费工经皮肤染毒染毒方法 农药、化妆品、工业、环境、外用药物 常用大鼠 染毒方式：脱毛：化学或机械法脱毛（体表面积的10%）染毒：局部涂敷或大鼠、小鼠浸尾法 经注射途径染毒染毒方法 注射药品、机制研究、毒物代谢动力学 分类：几种动物不同注射途径注射量几种动物不同注射途径注

17、射量(ml)(ml)范围范围（四）（四）剂量选择剂量选择 参考新化学物的理化性质 参考相关资料 先用少量动物，以较大的剂量间隔染毒，找出10%-90%（或0%-100%）的致死剂量范围，然后设计正式实验的剂量和分组 根据试验所选的LD50计算方法确定剂量组数预试一般每组预试一般每组4只动物，每只动物，每次次3组，以组，以10倍为组距。根倍为组距。根据第一次预试结果判定需据第一次预试结果判定需要增加还是降低剂量，组要增加还是降低剂量，组距保持不变，直至粗略预距保持不变，直至粗略预测到测到LD100及及LD0为止。为止。各组剂量的计算i=（lgLD90-lgLD10）/（n-1）或 i=（lgLD

18、100-lgLD0）/（n-1）i为组距，n为设计的剂量组数。以最低剂量值（LD0或LD10）的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依次类推直至最高剂量组剂量选择剂量选择 化学物LD50大于2g/kg 或5g/kg，表明毒性不大 我国药品的毒理研究指导原则规定要以最大容积最高浓度给予动物后未见死亡不必计算LD50全面观察动物的各种反应和变化，仔细分析实验动物在染毒后出现的中毒表现、剂量效应、时间分布。观察记录的内容：中毒体征及发生过程 死亡情况和时间分布 体重 病理形态学变化（五）（五）毒性作用观察毒性作用观察毒性作用观察中毒体征及发生过程 详细观察和记录动物出现的中毒体征 发生

19、时间 体征发展的经过各个系统的特征初步确定急性毒性靶器官不同表现提供毒性机制的信息 续表6-1 啮齿类动物急性中毒表现 毒性作用观察死亡情况和时间分布 实验动物的死亡数对LD50值产生明显影响 分析中毒死亡时间的分布规律可以提供重要信息：原形，代谢体重毒性作用观察 反映动物中毒后综合性整体变化，比较客观简便的量化指标 应定期多次称量动物的体重变化，一般为每周1次或2次 对体重指标的变化要仔细观察和分析 体重变化的原因毒性作用观察影响食欲或消化系统的功能影响食物的吸收和利用影响水的摄取肾功能急性损伤毒性作用观察病理检查 死亡动物：大体病理变化，如脏器外观、大小、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或

20、其他改变 存活动物：观察期结束时亦应进行解剖检查，必要时做组织病理学检查（六）（六）观察时间和周期观察时间和周期 染毒以后应即刻开始观察动物中毒表现和死亡情况 给药当天应连续或多次观察，以后可根据情况，每天2次或多次观察直至试验周期结束 观察周期一般为14天 LD50(LC50)计算时以观察周期内各组动物的总死亡数为依据 不同化学物质引起动物死亡的时间存在个体差异 速杀型化学毒物仅计算24h的死亡率 观察时间和周期 急性毒性试验求出LD50(LC50)值，通过LD50值进行急性毒性分级(acute toxicity classification)，评价毒物的急性毒性强弱，比较毒物的急性毒性大小

21、四、急性毒性分级和评价急性毒性分级和评价 急性毒性分级和评价 按照急性毒性分级标准评价毒性大小是相对粗略的分级 报告：LD50、急性毒性级别；中毒体征、出现体征时间、死亡前征兆、死亡时间和剂量组间分布、存活动物的体重变化和恢复情况、死亡动物的病理变化IntroductionMethod and materialsResultsDiscussions1234举 例举 例1 材料与方法1.1 主要试剂：四硼酸钠、亚硒酸钠举 例举 例 结果 急性毒性试验：急性硒中毒动物在服药5min后出现急性硒中毒症状，最初表现为呕吐、腹泻，然后呼吸困难，四肢痉挛，直至死亡。急性硼中毒动物在服药60min后出现急性

22、中毒症状，表现为不好动、腹泻、口鼻出血，甚至惊厥死亡举 例 结果举 例 结果 联合作用评价结果举 例 讨论 L D5 0：四 硼 酸 钠 对 雌、雄 性 大 鼠1470mg/kg。亚硒酸钠对雄性大鼠14.70mg/kg，对雌性大鼠6.81mg/kg。联合 对 大 鼠 的 急 性 毒 性，雄 性 大 鼠 为1727.10mg/kg，雌性大鼠1717.94mg/kg举 例 讨论 我国工业毒物急性毒性分级标准评价：本实验四硼酸钠与亚硒酸钠混合毒物属于低毒类物质。该毒物的值可为亚慢性毒性实验提供染毒剂量水平的设计依据举 例v 毒理学资料的外推 种属差异及外推：致畸、致癌（自发、敏感、靶器官）高剂量效应与低剂量效应的差异与外推（高剂量和低剂量的效应性质不一定相同，剂量-反应曲线不同）对化学物的安全性评价需要充分利用国内外资料，根据毒理学实验和流调毒理学实验基本原则