大学精品课件：第十七章 细胞工程（胡以平）.ppt

1、第十七章第十七章 细胞工程细胞工程 （cell engineering） 第一节第一节 概述概述 第二节第二节 动物细胞工程涉及的主要技术动物细胞工程涉及的主要技术 第三节第三节 动物细胞工程的应动物细胞工程的应 内内 容容 第一节第一节 概概 述述 是在细胞水平上，采用细胞生物学、发育生物学、 遗传学及分子生物学等学科的理论与方法，按照人们 的需要和设计对细胞的遗传性状进行人为修饰，以获 得具有产业化价值或其他利用价值的细胞或细胞相关 产品的综合技术体系，也称细胞技术。细胞工程是现 代生物技术（biotechnology）的基本组成部分之一。 一、细胞工程（一、细胞工程（cell engin

2、eering） 是指应用生命科学和工程学的基本原理及其相 关技术，对微生物、动物或植物等有机体进行人工 操作或改造，以实现人类某些特殊需求的综合性技 术体系。又称生物工程（bioengineering）。 二、生物技术（二、生物技术（biotechnology） 旧石器时代，神农氏传授种植谷物的方法。 新石器时代，利用谷物造酒，世界上最早的发酵技 术。 周代后期，豆腐、酱油和醋的制作技术，沿用至今。 公元10世纪，开始使用预防天花的活疫苗，并在人 群中广泛接种，以后通过丝绸之路传至欧洲。 三、生物技术发展简史三、生物技术发展简史 中国中国 三、生物技术发展简史三、生物技术发展简史 西方西方 公

3、元前6000年前，苏美尼尔人和巴比伦人已开始 制作啤酒。 公元前4000年前，埃及人开始制作面包。 1860年，巴斯德单一霉菌纯粹培养技术。 1878年，啤酒酵母单一培养技术。 1881年，细菌的纯粹培养技术。 1929年，青霉素发现。 1946年，用细菌生产出氨基酸。 1952年，用微生物转化荷尔蒙获得成功。 1953年，沃森和克里克提出了DNA双螺旋结构。 1972年，美国斯坦福大学构建了第一个重组DNA 分子。 1977年，在美国旧金山建立了世界上第一家遗传 工程公司。 传统生物技术（traditional biotechnology）：旧 时期的制造酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶及 其他

4、食物的传统工艺。 现代生物技术（modern biotechnology）： 上世纪新出现的各种生物技术。 四、生物技术分类四、生物技术分类 基因技术基因工程 细胞技术细胞工程 基因酶技术酶工程 发酵技术发酵工程 蛋白质技术蛋白质工程 五、现代生物技术的五大体系五、现代生物技术的五大体系 六、现代生物技术的安全性与伦理问题六、现代生物技术的安全性与伦理问题 转基因是否会破坏重要生长基因或激活癌基因？ 生物武器？ 环境危害？ 克隆人问题？ 基因诊断是否会侵犯人类隐私权？ 宗教问题？ 动物保护问题？ 重要生物技术的垄断？ 第二节第二节 动物细胞工程涉及的主要技术动物细胞工程涉及的主要技术 细胞工程

5、 微生物细胞工程 植物细胞工程 动物细胞工程 动物细胞工程所涉及的研究领域动物细胞工程所涉及的研究领域 生产医用蛋白 生产基因工程动物 核移植与动物克隆 组织工程 细胞治疗 一、大规模细胞培养一、大规模细胞培养 （large-scale cell culture） 是在人工条件下（设定pH、温度、氧溶等）， 高密度大规模的在生物反应器（bioreactor）中培养 细胞用于生产生物产品的技术，它是细胞工程的重 要组成部分。 （一）大规模细胞培养的原则（一）大规模细胞培养的原则 1、增加培养容积 2、增大细胞的附着面积 3、抑制细胞凋亡 4、无血清培养 首要考虑因素 培养的容积越大，细胞的产量就

6、越高 是提高悬浮生长细胞产量的最重要因素 1 1、增加培养容积、增加培养容积 提高细胞产量的另一个重要因素 培养容器中添加细胞附着生长的支持物 常用的支持物主要有： 微载体（microcarrier） 中空纤维（hollow fiber） 微胶囊（microcapsule） 2 2、增大细胞的附着面积、增大细胞的附着面积 高分子微细实心颗粒，100300m 集单层培养和悬浮培养的特点于一体 增大细胞附着面积十分明显 （1）微载体（microcarrier） HEK 292 cells on microcarriers infected with Adenovirus with GFP mark

7、er Glass Ball Spinner System Cells on microcarrier GCS technology enables life science researchers to mimic in vivo morphology in an in vitro environment 半透膜性两端开口的中空纤维，直径约200m 细胞附着于外表面，内部有培养液通过 利于分泌型表达蛋白的纯化，不易放大培养 （2）中空纤维（hollow fiber ） Cross-section through hollow fiber culture system showing extra

8、capillary space Hollow Fiber Cell Culture System 半透性膜所围成的囊，直径200m左右 细胞生长在囊的内壁 细胞密度大(108/ml), 产物浓度高, 分离纯化相对简单 需研究人员自行制备 （3）微胶囊（microcapsule） Fluorescence microscopy image of FITC-peroxides loaded polypeptide microcapsules A scanning electron microscope image of a fractured microcapsule, once filled w

9、ith healing agent 3、抑制细胞凋亡、抑制细胞凋亡 培养的后期，维持细胞的高活力是关键 细胞凋亡是大规模培养时细胞死亡的主要原因 细胞静止（cell rest）技术可以有效降低营养成 分消耗和代谢毒物产生，对提高培养细胞表达 目的蛋白的产率是一种有效的手段 4 4、无血清培养、无血清培养 血清培养基与无血清培养基的比较血清培养基与无血清培养基的比较 血清培养基 无血清培养基 质量稳定 性 存在批次的差异 有明确的质量标准，避免了批次 差异 培养基成 分 影响细胞生长的因子多、复杂 程度高、不明确因素多 成分明确，培养基可针对不同的 细胞株进行成分优化，以达到最 佳培养效果 与产

10、品纯 化的关系 血清中蛋白含量 45g/l，成分 复杂，且易被病毒或支原体污 染，不利于下游纯化工作，产 业化成本高 下游产品纯化容易，产品回收率 高，不存在病原体污染问题，易 于产业化 实用性 适用细胞谱系较宽 适用细胞谱系窄。对某于具体的 某种细胞的培养，通常摸索其培 养条件。由于培养基的黏度小， 其细胞在培养过程中易受机械损 伤 （二）大规模细胞培养系统（二）大规模细胞培养系统 1.悬浮培养系统 2.气流驱动培养系统 3.微载体培养系统 4.灌注培养系统 1.悬浮培养系统（悬浮培养系统（suspension culture system） 细胞产量是最高的 仅适合于悬浮生长细胞 旋转细胞

11、培养系统（Rotary Cell Culture System , RCCS） 2.气流驱动培养系统（气流驱动培养系统（airlift culture system） 被成功培养的细胞有：HeLa、BHK21、人 类原始淋巴细胞以及植物细胞等 凡适合于在搅拌悬浮培养体系中生长的细胞 都可以在本培养体系中生长，如用于制备单 克隆抗体的杂交瘤细胞 不需要发动机和搅拌装置 3.微载体培养系统（微载体培养系统（microcarrier culture system） 微载体与搅拌悬浮培养相结合的一种培养体系 适于贴壁生长细胞的大规模培养 微载体培养技术复杂 4.灌注培养系统（灌注培养系统（perfus

12、ion culture system） 可使细胞始终处于一个较好的营养状态和生存环境 可以在 “旧”培养基中连续收集培养细胞所分泌 的某些产物 可以根据特殊的要求，通过改变培养液的组成实现 对于细胞状态的人为调控 A B C D A B C D （三）影响细胞生长的因素（三）影响细胞生长的因素 1.量化评估大规模培养细胞的营养需求量化评估大规模培养细胞的营养需求 2.探索大规模培养细胞合适的生存环境探索大规模培养细胞合适的生存环境 3.鉴定细胞的健康状况鉴定细胞的健康状况 二、核移植（二、核移植（nuclear transfer） 是指利用显微注射装置，将一个细胞的核植入于另 一个已经去核的细

13、胞中，以得到重组细胞的技术。通常 所说的核移植，则是指将一个二倍体的细胞核植入于另 一个已经去核的细胞（受精卵或处于M期的卵母细胞） 中，以得到重组细胞，并使其在一定环境中生长发育， 最后获得新的个体的综合技术体系。 去/取核（A/B）-新核/移入（C/D） （一）核移植技术的基本技术流程（一）核移植技术的基本技术流程 1受体细胞的选择 早期多采用受精卵（合子）细胞作为受体细胞，后 发现处于M II期的卵母细胞更适合作受体细胞。 受精卵及处于M II期卵母细胞的细胞质，可使所植 入的细胞核基因组的发生重编程（reprogramming），以 致处于不同分化程度的供核细胞得以去分化、恢复到全 能

14、性状态。由此获得的重构卵，进入到正常的发育程序， 从而获得遗传背景完全源于供核细胞的动物个体。 2供核细胞的选择 供体细胞主要有两大类：早期采用胚胎细胞作 为供核细胞。现已知，未分化的原始生殖细胞 （PGCs）与胚胎干细胞（ES细胞）、胎儿体细胞、 成年体细胞甚至是高度分化的神经细胞、淋巴细胞 等均可作为供核细胞的来源。 对不同供核细胞来源的克隆研究结果表明，克隆 效率一般随其供核细胞分化程度的提高而下降。 3去核 细胞核移植能否成功的关键与前提。 目前的去核方法主要有以下几种： （1）紫外线照射去核 （2）盲吸法去核 （3） 蔗糖高渗处理去核法 （4）透明带打孔去核法 （5）超速离心法 4重

15、构胚的组建重构胚的组建 通常做法：采用显微操作，直接将供核细胞移植到已去核的 MII期卵母细胞（或受精卵）的透明带下，然后通过细胞融合 （电融合或仙台病毒介导），使供核细胞与受体细胞发生融合， 实现细胞核与细胞质的重组。存在问题：供核细胞质参与重构 胚，这有可能导致克隆动物组织细胞中线粒体的多样性。 另一种做法：以显微针抽吸供核细胞，分离出其细胞，然后 将核直接注入已去核的受体细胞中，直接构成重组胚，该法主 要被用于克隆小鼠的制作。 5重构胚的激活 正常受精过程中，会发生一系列的精子激活卵母 细胞的事件。因而，在重构胚组合成功后，也必须 要模拟体内的自然受精过程，对重构胚施以激活。 激活通常采

16、用化学激活与电激活方法。 激活处理后的重构胚，继续培养后，能够卵裂的， 表明重构胚已激活。否则，则激活失败。 6重构胚的培养与移植 重构胚激活后，需经一定时间的体外培养，或放 入中间受体动物（家兔、山羊等）的输卵管内孵育培 养数日，待获得发育的重构胚（囊胚或桑椹胚）后， 方可将之移植至受体的子宫里，经妊娠、分娩获得克 隆个体。 （二）核移植技术可使用不同的供核细胞（二）核移植技术可使用不同的供核细胞 胚胎细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全 能性容易 成体细胞核移植：细胞分化程度高，恢复全 能性不容易 1938年，Spemann，两栖类动物细胞核移植。 1952年，Briggs和King，青蛙细

17、胞核移植。 1963年，童第周，金鱼等鱼类核移植成功。 1981年，Illmensee和Hoppe，哺乳动物克隆试验。 1983年，Solter 和McGrath，小鼠胚胎细胞和内细 胞团细胞为供核细胞获得克隆后代。 1984年， Willadsen，世界上第一只以未分化的胚 胎细胞为供核细胞的核移植绵羊。 1995年7月，Wilmut等，已分化的胚胎细胞作为供 核细胞，克隆了Megan和Morag。 1胚胎细胞核移植 克隆羊克隆羊Megan和和Morag 1962年，Gorden，紫外线照射方法，非洲爪蟾 的未受精的卵细胞的核失活，同种爪蟾的小肠 上皮细胞的核植入其中，结果约1的重组卵发 育

18、为成熟的爪蟾。这一成功，标志着由体细胞 核培育动物的技术体系在两栖类获得了成功。 1997年2月23日，Wilmut等，乳腺细胞作为供核 细胞，成功地培育了克隆羊“多莉”（Dolly）。 1997年7月，Wilmut等，以培养的皮肤成纤维细 胞为供核细胞，成功地培育了克隆羊“Polly” 。 2成体细胞核移植 这一成果的重要生物学意义：这一成果的重要生物学意义： 它证明了一个已完全分化的动物体细胞仍然保持着 胚胎细胞的全部遗传信息，并且经此技术处理后， 体细胞恢复了失去的全能性形成完整个体。 它的成功提示我们可以按照人的意志去改选、生产 物种。 多利羊的诞生及生长表明，利用克隆技术复制哺乳 类

19、动物的最后技术障碍已被突破，在理论上已成为 可能。 Dolly as a lamb with her surrogate mother Dolly, first mammal cloned from an adult cell Dolly, as an adult Cat clone Donor Surrogate mother with clone (Cc) Out of 87 implants only Cc survived to birth Cc as an adult Epigenetics Piglets clones created by PLL Therapeutics in

20、2000 The piglets carry a silenced copy of alpha 1,3 galactosyl transferase, or GT, an enzyme involved in organ rejection In order to guarantee compatibility a second GT gene must also be silenced （三）人类治疗性克隆（三）人类治疗性克隆 human therapeutic cloning 三、基因转移技术三、基因转移技术 Gene Transfection 基因移转是实现细胞表型定向改造的基本技术 之

21、一。目前已被有效使用的方法有很多，分为物理 法、化学法和生物法三大类。 1.电穿孔法 利用脉冲电场提高细胞膜 的通透性，在细胞膜上形成 纳米大小的微孔，使外源 DNA转移到细胞中。 该方法简单，广泛运用于 培养细胞的基因转移，基因 转移效率最高可达10-3。 （一）物理和化学转化法（一）物理和化学转化法 2. 显微注射法 显微注射法主要用于制备转基因动物。该方法转 入的基因随机整合在染色体DNA上，有时会导致转基 因动物基因组的重排、易位、缺失或点突变，但这种 方法应用范围广，转基因长度可达数百kb。 显微操作系统 显微注射 3.脂质体包埋法 将待转化的DNA溶液与天然或人工合成的磷脂 混合，

22、后者在表面活性剂存在的条件下形成包埋水 相DNA的脂质体结构。当这种脂质体悬浮液加入到 细胞培养皿中，便会与受体细胞膜发生融合，DNA 片段随即进入细胞质和细胞核内。该方法基因转移 效率很高，据报道最高时，100%离体细胞可以瞬时 表达外源基因。 转 染 复 合 物 形 成 过 程 示 意 图 脂质体脂质体 膜融合膜融合 4. 磷酸钙转染法 受二价金属离子能促进细菌细胞吸收外源DNA的启 发，人们发展了简便有效的磷酸钙共沉淀转化方法。此 法将待转化的 DNA溶解在磷酸缓冲液中，然后加入 CaCl2溶液混匀，此时DNA与磷酸钙共沉淀形成大颗粒； 将此颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37下保温416h

23、； 除去DNA悬浮液，加入新鲜培养基继续培养7天即可 进行转化株的筛选。在上述过程中，DNA颗粒也是通 过胞饮作用进入受体细胞的。 5. DEAE-葡聚糖法 最早的动物细胞转化方法是将外源DNA片段与 DEAE-葡聚糖等高分子碳水化合物混合，此时DNA 链上带负电荷的磷酸骨架便吸附在DEAE的正电荷 基团上，形成含DNA的大颗粒。后者黏附于受体细 胞表面，并通过其胞饮作用进入细胞内。但这种方 法对许多细胞类型的转化率极低。 通过病毒感染的方式将外源基因导入动物细胞内 是一种常用的基因转导方法。根据动物受体细胞类型 的不同，可选择使用具有不同宿主范围和不同感染途 径的病毒基因组作为转化载体。目前

24、常用的病毒载体 包括：DNA病毒载体（腺病毒载体、腺相关病毒载体、 牛痘病毒载体）、反转录病毒载体和慢病毒载体等。 用作基因转导的病毒载体都是缺陷型的病毒，感染细 胞后仅能将基因组转入细胞，无法产生包装的病毒颗 粒。 （二）生物转化法（二）生物转化法 腺病毒科为线型双链DNA病毒，无包膜，呈二十 面体，共有93个成员，分两个属：哺乳动物腺病毒属 和禽腺病毒属。目前已鉴定的人腺病毒有6个亚 属其中常用来构建载体的腺病毒主要是C亚属的2型 （Ad2）和5型病毒（Ad5）。腺病毒感染人体细胞是 裂解型的，不会致癌，但对啮齿目动物细胞来说，绝 大多数的腺病毒成员均能致癌。腺病毒基因组DNA全 长36k

25、b，其包装上限为原基因组的105，即37.8kb。 腺病毒作为转化载体的特点是：基因组重排率低， 安全性好，不整合染色体，不导致肿瘤发生；宿主 范围广，对受体细胞是否处于分裂周期要求不严格； 外源基因在载体上容易高效表达。 病毒载体也具有一些缺点，如所有的病毒载体都会 诱导产生一定程度的免疫反应，都或多或少的存在 一定的安全隐患，转导能力有限，以及不适合于大 规模生产等。 第三节第三节 动物细胞工程的应用动物细胞工程的应用 一、生产医用蛋白一、生产医用蛋白 单克隆抗体的生产 -B 淋巴细胞杂交瘤技术 复杂的人体蛋白的生产 -真核细胞表达体系（CHO细胞） 组织型纤溶酶原激活剂（tPA） 凝血因

26、子 促红细胞生成素 1975年G Kohler和C Milstein建立了B淋巴细胞杂 交瘤技术制备单克隆抗体。B淋巴细胞杂交瘤技术将 淋巴细胞产生单一抗体的能力和骨髓瘤无限增生的 能力巧妙地结合起来，并可进一步筛选获得专一性 的抗体。单克隆抗体的最主要的优点在于它的专一 性、均质性、灵敏性以及无限量制备的可能性。 （一）单克隆抗体的生产（一）单克隆抗体的生产 单单 克克 隆隆 抗抗 体体 的的 生生 产产 单抗在生物工程技术中占有很重要的地位，其用途 包括以下几方面： 作为体外诊断试剂； 作为体内诊断试剂； 作为导向药物的载体。 导向药物是指对病变部位具有特异选择性的药 物，将来抗癌药物、抗

27、生素等的导向制剂将普遍 取代目前的常规药。 作为治疗药物用于治疗的单克隆抗体必须具有专 一性高、稳定性好、亲合力强、分泌量大、针对 非脱落抗原在靶细胞上的分布密度高等特点，但 这是很难获得的。 此外，近来也有报道用单克隆抗体检测工业生产 及各种焊缝管道中的早期腐蚀；作为某些化学工 业的催化剂等。 由于微生物缺乏蛋白翻译后的加工修饰系统，故许多 人体蛋白必须用真核动物细胞表达。第一个由重组哺 乳动物细胞规模化生产的医用蛋白是 “组织型纤溶酶 原激活剂”（tPA）的溶血栓药物。另一个由哺乳动物 细胞生产的人重组蛋白是凝血因子VIII。人凝血因子 VIII是一种需要修饰才有活性的蛋白质，故必须采用

28、重组哺乳动物细胞进行生产。此外，生物活性严格依 赖于糖基化修饰的人促红细胞生成素（EPO）也必须 用动物细胞生产，用于治疗因肿瘤化疗或肾脏疾病所 致的红细胞减少症。 （二）获得复杂人体蛋白（二）获得复杂人体蛋白 二、生产基因工程动物二、生产基因工程动物 基因工程动物（ genetically engineered animal） 是通过遗传工程的手段对小鼠基因组的结构或组成 进行人为的修饰或改造，并通过相应的动物育种技 术，最终获得修饰改造后的基因组在世代间得以传 递和表现的工程化动物。 人们可以在动物基因组中引入特定的外源基因， 使外源基因与动物本身的基因组整合，培育出可将外 源基因稳定的遗

29、传给下一代的转基因动物（transgenic animal），也可以在动物基因组的特定位点引入所设 计的基因突变，导致基因失活或替换，培育出基因剔 除动物（gene knock-out animal）或基因重组动物 （gene knock-in animal）。 转基因动物（转基因动物（transgenic animal） 正正 常常 动动 物物 基基 因因 组组 引入病毒基因组引入病毒基因组 模拟病毒性疾病的发模拟病毒性疾病的发 病过程，进行药物有病过程，进行药物有 害型和有效性评价害型和有效性评价 引入药用蛋白基因引入药用蛋白基因 生产药用蛋白生产药用蛋白 引入靶引入靶DNA 研究目的基因

30、研究目的基因 的功能的功能 超级小鼠（超级小鼠（supermouse） 表达绿色莹光蛋白 （GFP）基因的转 基因小鼠 组织特异性表达报告 基因LacZ的转基因小 鼠 Transgenic Pig: Xenotransplantation Rosengard AM, et al. Tissue expression of human complement inhibitor, decay- accelerating factor, in transgenic pigs. A potential approach for preventing xenograft rejection. Trans

31、plantation. 1995 15;59(9):1325-33. Brandl U, et al. Transgenic Animals in Experimental Xenotransplantation Models: Orthotopic Heart Transplantation in the Pig-to-Baboon Model. Transplant Proc. 2007;39(2):577-8. Transgenic pigs expressing complement inhibitor, human decay-accelerating factor （hDAF,衰变

32、加速因子）衰变加速因子） 将外源DNA注射入受精卵 的雄原核内 Micromanipulator system for transgene 转基因动物生物反应器是指利用转基因活体动物 的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工 业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一般是药用 蛋白或营养保健蛋白。 用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、 精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕）个 体等。 转基因动物生物反应器转基因动物生物反应器 （transgenic animal bioreactors） 乳腺生物反应器乳腺生物反应器(mammary gland bioreactor)，或称，或

33、称 动物个体乳腺表达系统，动物个体乳腺表达系统， 即用于在乳腺中生产生物活即用于在乳腺中生产生物活 性物质的转基因动物。性物质的转基因动物。 将某种具有重要价值的生物活性蛋白的基因导入动将某种具有重要价值的生物活性蛋白的基因导入动 物的受精卵中培养出转基因动物，使外源基因在动物物的受精卵中培养出转基因动物，使外源基因在动物 的乳腺中高效表达并分泌到乳汁中，再从乳汁中提取的乳腺中高效表达并分泌到乳汁中，再从乳汁中提取 目的基因产物。目的基因产物。 A transgenic industry for future Transgenic sheep Tracy, a transgenic sheep

34、, 1999. Wright G, Carver A, Cottom D, et al. High level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep. Biotechnology (N.Y.) 1991;9:830-4. www.beep.ac.uk/content/456.0.html AAT and Transgenic sheep http:/www.scienceandsociety.co.uk/pr/632030877/Science_&_Society _Pict

35、ure_Library_10319243.jpg GM sheep grow bigger, produce more milk and wool A group of transgenic sheep, genetically modified with an extra copy of sheep growth hormone gene, in a field. Webster and Peter Transgenic Goats Milk Kicks Up Immunity transgenic goats can successfully produce milk containing

36、 the enzyme Lysozyme, and that this milk exhibits an antibacterial effect when fed to young goats and pigs. August 04, 2006 Transgenic Chicken Hatching the Golden Egg: A New Way to Make Drugs” in Science Vol. 300, page 729-730, 2 May,2003. First Transgenic Pigs Photo: Leaner pork chops from a geneti

37、cally engineered pig. Beltsville Area photo http:/www.ba.ars.usda.gov/history/photos/1980_1.html Bacon Thats Good For You? Researchers Create Pigs That Produce Heart-healthy Omega-3 Fatty Acids Of these piglet littermates photographed three weeks after birth, the one in the middle and one on the rig

38、ht have the omega-3 fatty acid gene. (Photo credit: University of Missouri- Columbia) (Nat. Biotechnol.24, 435436, 2006) 去除特定的内源基因去除特定的内源基因 基因剔除（基因剔除（Knockout）动物）动物 正正 常常 动动 物物 基基 因因 组组 研究相应的研究相应的 功能丧失功能丧失 定时定点去除特定的内源基因定时定点去除特定的内源基因 建立特定基因缺建立特定基因缺 陷型小鼠品系，陷型小鼠品系， 作为医药研究的作为医药研究的 动物模型动物模型 组成型基因剔除小鼠组成型基

39、因剔除小鼠 诱导型基因剔除小鼠诱导型基因剔除小鼠 Knockout 小 鼠 建 立 过 程 小 鼠 建 立 过 程 Impaired Nociception and Pain Sensation in Mice Lacking the Capsaicin Receptor Caterina et al. Science 14 April 2000: Vol. 288. no. 5464, pp. 306 - 313 基因重组（基因重组（Knock-in)动物动物 Myf5 +/+ Myf5-/- MygKi/ Myg5 美国麻省理工学院Jaenisch实验室 （用肌细胞生成素基因（ MygKi

40、 ）替代Myf5基因） 三、组织工程（三、组织工程（tissue engineering） 是指应用工程学和生物学的原理和方法来研究正常 或病理状况下哺乳动物组织的结构、功能和生长的 机理，进而开发能够修复、维持或改善损伤组织的 人工生物替代物的一门学科。 组织工程的一般方法： 大规模扩增从体内获得的细胞大规模扩增从体内获得的细胞 在聚合物骨架上种植这些细胞在聚合物骨架上种植这些细胞 细胞增殖、分化，形成具有特定形态和功细胞增殖、分化，形成具有特定形态和功 能的工程组织能的工程组织 组织工程的基本方法组织工程的基本方法 组织工程皮肤的支架组织工程皮肤的支架 组织工程皮肤组织工程皮肤 组织工程膀

41、胱（组织工程膀胱（artificial bladderartificial bladder） Artificial bladder being developed by James J. Yoo M.D., Ph.D.at the Department of Urology at Harvard Medical School. 四、细胞治疗（四、细胞治疗（cell therapy） 将体外培养的、具有正常功能细胞植入病人 体内（或直接导入病变部位），以代偿病变细胞 所丧失的功能。或采用基因工程技术，将所培养 的细胞在体外进行遗传修饰后，再将其用于疾病 的治疗。 细胞治疗示意图细胞治疗示意图 M

42、ouse embryonic stem cells injected into rat brains express the AHD2 protein marker (yellow) characteristic of cells lost in Parkinsons disease. 神经干细胞神经干细胞(red)用于颅内肿瘤用于颅内肿瘤(green)的治疗的治疗 干细胞治疗临床实验的进展干细胞治疗临床实验的进展 思考题思考题 1.简述生物工程和细胞工程的基本概念。 2.简述大规模细胞培养的基本原则。 3.简述大规模细胞培养的基本培养体系。 4.简述核移植的基本技术路线 。 5.简述基因转移

43、的常用方法 。 6.简述动物细胞工程的主要应用领域。 7.试述组织工程的基本方法 。 8.试述细胞治疗的基本方法。 推荐阅读资料推荐阅读资料 1.胡以平.医学细胞生物学.北京:高等教育出版社， 2009 2.杨抚华：医学细胞生物学，科学出版社，2007 3. Pinkert C A: Transgenic animal technology(2nd edition).Academic Press. San Diego，2002 4. Davis JM: Basic Cell Culture(2nd edition). Oxford, Oxford University University.

44、2002 5.Alberts B, et al. Molecular Biology of the Cell M.5th ed. NEW YORK&LONDON:Garland Publishing,Inc,2008. Cell Nature Science EMBO Annual Review of Cell Biology Trends in Cell Biology Cell Research 科学通报 中国科学 主要期刊杂志主要期刊杂志 生物学网站生物学网站 生物通 生物谷 生物秀 生物谷论 丁香园论坛 中国生物论坛 NCBI-American http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/