蛋白质翻译剖析课件.ppt

1、第五章第五章 蛋蛋 白白 质质 翻翻 译译 5.1.基本概念基本概念 5.2.基本元件基本元件 5.3.Genetic Code 5.4.peptide synthesize 5.5.保证保证peptide准确翻译的机制准确翻译的机制 5.1.5.1.基基 本本 概概 念念 the second step of gene expression tRNA as a adapter(转接器转接器)for codon&amino acid tRNA loading aa by aa-tRNAaa 合成酶合成酶 (氨酰氨酰tRNA合成酶，合成酶，AARS)tRNA recognition codon

2、by anti-codon（反密码（反密码子）子）codon：universal triplex codon 三联体密码子三联体密码子two of three reading codon 三中读二三中读二codon in codon 广义密码子广义密码子 codon degeneracy：wobble hypothesis 摇摆假摇摆假说说 isoacceptor 同工受体同工受体 codon usage(codon bias)密码子的利用（偏爱）密码子的利用（偏爱）mechanism of exactly translationinitiation,loading,elongation,pr

3、oofreading 5.2.5.2.基基 本本 元元 件件5.1.1.tRNA mini RNA,4S,(74-94 Nt)tRNA phe,77Nt cloverleaf form(1964 Holly R.)4 arms&4 loops Nt more modified by methylation-aa 接受臂接受臂;loading aa at 3 end-DHU loop;contact with AARS-anti-codon loop;-TC loop;contact with 5s rRNA-extra loop;分类标准分类标准34ltRNAtRNACysCys表示转运半胱氨

4、酸的表示转运半胱氨酸的tRNAtRNAlCys-tRNACys-tRNAC y sC y s表示携带了半胱氨酸的表示携带了半胱氨酸的tRNAtRNACysCys tRNA的的”L”三维结构与功能三维结构与功能“L”构型的结构力构型的结构力-二级结构中双链区的碱基堆积力和氢键二级结构中双链区的碱基堆积力和氢键-二级结构中非双链区在二级结构中非双链区在“L”结构中，形成氢键结合结构中，形成氢键结合-“L”结构中碱基堆积力大结构中碱基堆积力大 使其拓扑结构趋于稳定使其拓扑结构趋于稳定-wobble base（摇摆碱基）（摇摆碱基）位于位于“L”结构末端结构末端 堆积力小堆积力小 自由度大自由度大 使

5、碱基配对摇摆使碱基配对摇摆-TC loop&DHU loop 位于位于“L”两臂的交界处，两臂的交界处，利于利于“L”结构的稳定结构的稳定“L”结构域的功能结构域的功能-aa accept arm 位于位于“L”的一端，契合于核糖体的的一端，契合于核糖体的肽肽基基 转移酶转移酶结合位点结合位点 P A,以利肽键的形成以利肽键的形成-anti-codon loop 位于位于”L”另一端，与结合在核糖体另一端，与结合在核糖体 小亚基上的小亚基上的codon of mRNA配对配对 A Paa-tRNAaa have GC content of 60%&Rich methylation each c

6、ell contains from several hundred to over 20,000 copies of rDNA gene rRNA synthesized in nucleolusRibosomal genes(rDNA)are different in several ways from other nuclear gene5.2.2.rRNA Prokaryote 23S,16S,5S /Eukaryote 28S-5.8S,18S,5S Rich methylation (m2U,m3A,m3U,m26A(二甲基二甲基)细菌核糖体细菌核糖体70S70S真核生物核糖体真核生

7、物核糖体80S80S In Prok.3-end of 16S rRNA富含富含CCU保守序列保守序列 互补互补mRNA 5 端的前导序列端的前导序列SD序列富含序列富含(AGG)5s rRNA 与与TC loop of tRNA部分同源，并可配对部分同源，并可配对lIn Euk.3-end of 18s rRNA 与原核生物高度相似与原核生物高度相似,但无与但无与 S.D.seq.互补的保守序列互补的保守序列 AMEAMECCUGCGGUUGGAUGACCUCCUUAMEAMECCUGCGGAAGGAUGAUUA16S细菌细菌18S rRNA哺乳动物哺乳动物高度相似高度相似 23s rRNA

8、-6 domains-有的与对抗生素的抗性有关有的与对抗生素的抗性有关-2660Nt region -I loop(alpha Sarcin)binding with complex of aa-tRNAaa(EF)-TuGTP (引起核糖体变构！引起核糖体变构！)G2661 C,aa-tRNAaa into A site go down-G2252,G2253双突变为双突变为C,将对转肽酶的活性产生抑制将对转肽酶的活性产生抑制mRNA具有两个必需的特征：具有两个必需的特征：可翻译的密码序列（开放阅读框架，可翻译的密码序列（开放阅读框架，ORF）核糖体结合位点（核糖体结合位点（RBS）5.2.

9、3.mRNA In Prokaryote5-end;300Nt leading seq.(A/G-AUG)S.D seq-AUGpoly-cistron9Nt betterrich A,U,Shine-Dalgarno seq.(S.D):富含富含嘌呤嘌呤 G mut.translation go down In Eukaryotemono-cistron5 m7Gppp-CCACC-A/G-3-A1U2G3G4leading seq.核糖体小亚基扫描核糖体小亚基扫描AUG的信号序列的信号序列 至关准确翻译起始至关准确翻译起始Kozak序列序列But mRNA of chloroplast s

10、hows similarities to prokaryote.5.3.Genetic Code5.3.1.Universal triplet codoncodon的特征的特征 codon是是mRNA 上连续排列的三个核苷酸序列，上连续排列的三个核苷酸序列，并编码一个氨基酸信息的遗传单位并编码一个氨基酸信息的遗传单位 codon具有通用性与保守性（除具有通用性与保守性（除mt）在一个基因序列中在一个基因序列中 codon具有具有53方向编码、方向编码、不不 重叠性和无标点性重叠性和无标点性Marshall Nirenberg(1961)ButIn vitro Poly(U)poly(Phe)p

11、eptide Poly(C)poly(Pro)peptide Poly(A)poly(Lys)peptide Poly(G)poly(Gly)peptidepoly(UCUCUC)poly(Ser-Leu-Ser-Leu)UCU/CUC Ser/Leu?密码子的破译密码子的破译(1968.nobel prize)M.Nirenberg&P.Leder(1964.Science 145;1399)In vitrotRNAaaRibosomeNitrocellulose filter UCU(tri-nucleotide)Ser-C14,Leu,Lys,Arg,Ser,Leu-C14,Lys,Ar

12、g,Ser,Leu,Lys-C14,Arg,Ser-C14.Leu-C14.Lys-C14.Gly-C14.61个个codons被破译，仅剩被破译，仅剩UAA,UAG,UGA(Stop codon).Genetic codonGenetic codon字典字典5.3.2.Degeneracy of codon(密码子的简并现象密码子的简并现象)a)简并现象的概念；简并现象的概念；-一种氨基酸有一种氨基酸有2个或个或2个以上个以上codon编码的遗传现象编码的遗传现象-编码一种编码一种aa的的4个个codon间间,仅仅3rd Nt 不同不同,称为称为codon family例；例；Ser(6 c

13、odons)1 codon family&2 extra codons CGU,CGC,CGA,CGG,AGA,AGG b)简并现象的机理；简并现象的机理；Isoacceptor tRNA;负载同一氨基酸，但识别负载同一氨基酸，但识别不同密不同密 码子码子的的tRNA Wobble hypothesis;反密码子反密码子:密码子密码子 1th-Nt :3 rd-NtmRNA5-CGU-CGC-CGA-CGG-AGA-AGG-3GCG GCU UCU353535A A AwobbletRNA3 isoacceptors1 codon family 2 extra codons 在在一定范围内一定

14、范围内的可的可选择配对选择配对现象现象 Wobble base的摇摆配对原则的摇摆配对原则13l由于变偶性的存在，由于变偶性的存在，细胞内只需要细胞内只需要3232种种tRNAtRNA就可以识别就可以识别6161个个编码氨基酸的密码子。编码氨基酸的密码子。Wobble base摇摆配对的机理摇摆配对的机理-tRNA的拓扑空间结构的拓扑空间结构34th摇摆位点位于拓扑结构的末端摇摆位点位于拓扑结构的末端，碱基堆积力小，碱基堆积力小，选择性配对的自由度大选择性配对的自由度大-34th摇摆位点被修饰的频率高摇摆位点被修饰的频率高 选择配对的关系发生变化选择配对的关系发生变化-34th几乎无几乎无 A

15、-线粒体中线粒体中 U34=N when U U*=A/G only 尤以尤以A34 I I=A/I=C/I=U5.3.3.codon usage(codon bias)tRNA拷贝数与拷贝数与codon使用频率对应使用频率对应-识别同一氨基酸的识别同一氨基酸的不同不同tRNA(isoacceptor)量不等量不等-不同生物间不同生物间同一同一isoacceptor的量不等的量不等tRNA abundance与与 codon usage(codon bias)协调性协调性是进化中形成的基因表达调控机制之一是进化中形成的基因表达调控机制之一生物生物GC%不等不等 各种各种codon的频率不等的频

16、率不等进化过程进化过程Codon usage Observed for E.coli Ribosome Protein1209 codonsCodon usage in the genes of Animals2244 codons（1）codon usage 正相关正相关 tRNA abundance 需要量多的蛋白质（除需要量多的蛋白质（除mRNA转录速率高外）转录速率高外）需要量少的蛋白质（除需要量少的蛋白质（除mRNA转录速率低外）转录速率低外）有关有关aa的的codon usage 高高 相应相应tRNA量多量多关键关键aa的的codon usage 低低 相应相应tRNA量少量少进

17、化中形成的蛋白质翻译调控机制进化中形成的蛋白质翻译调控机制 （modulator ）23/1209 10/1209 13/1209 3/1209Phe(UUC)(UUU)Tyr(UAC)(UAU)Anti-codon AAG1 AUG1（2）codon 与与anti-codon间的作用强度间的作用强度 codon usage5.3.4.遗传密码的变异性遗传密码的变异性a)线粒体中具有与通用密码不同的编码信息线粒体中具有与通用密码不同的编码信息 线粒体线粒体codon较为整齐（均为较为整齐（均为2/4/6）In mt 22 tRNA only(32 tRNA in universal code)

18、线粒体线粒体“三中读二三中读二”方式可减少方式可减少tRNACodons Comparing between in usual and in mtCodons Comparing between in usual and in mt密码子密码子通常含义通常含义线粒体线粒体AGAArg终止密码子终止密码子AUAIleMetUGA终止密码子终止密码子Trp Codon-reading“三中读二三中读二”方式（密码子家族中）方式（密码子家族中）codon UCU-UCA-UCG-UCCanti-codon AGUUC Ser codon N 3rd(U)A/U/C/G 仅起将仅起将codon隔开的作

19、用隔开的作用 Codon-reading其余的密码子由其余的密码子由tRNA识别第三位为识别第三位为A、G或或U、C的密码子。的密码子。wobble base G C/U wobble base U*G/A5.3.5 codon in codon or general genetic codon (广义密码广义密码)生物体除具有标准的通用密码保证蛋白质的准确翻译外生物体除具有标准的通用密码保证蛋白质的准确翻译外同时存在同时存在codon in codon减少有害突变减少有害突变生物的适应性生物的适应性2edNt of codon对氨基酸的编码特征对氨基酸的编码特征即为即为GGC or codo

20、n in codona)codon/anti-codon间的缔合能分析间的缔合能分析 2ed Nt of codon（N1N2N3）对对codon/anti-codon的缔合能贡献最大的缔合能贡献最大凡凡2edNt相同的相同的codon codon/anti-codon间的缔合能相似间的缔合能相似 对缔合能的贡献对缔合能的贡献 2Nt 1thNt 3rdNtb)codon对氨基酸性质的决定对氨基酸性质的决定2edNt of codon 对对氨基酸性质氨基酸性质和和蛋白质空间结构蛋白质空间结构 的决定度较大的决定度较大NUN 非极性、疏水和支链的氨基酸非极性、疏水和支链的氨基酸 -helix&-

21、sheet的形成者的形成者 位于蛋白质分子内部位于蛋白质分子内部 NA/GN 极性、亲水性氨基酸极性、亲水性氨基酸,位于蛋白质分子外部位于蛋白质分子外部 NCN 非极性、不带电荷的极性侧链非极性、不带电荷的极性侧链Codon in codon(依依 2edNt of codon预测氨基酸的性质预测氨基酸的性质)GGN 疏疏 UGU/C 疏疏 GGN MW 75 kdCUN UUU/C GCN 小小AUA/C AUA/C UCNGUN GUN CCNGCU CUN GUNUUU/C AUG CANUGU/G UGG UGU/CAUG CAU/C CUNACN 中中 UAG/C 中中 AUA/C

22、中中 N1N 2N 3 N1N 2N 3 N1N 2N 3不同方法测定不同方法测定aa的亲水性和分子量结果的亲水性和分子量结果 (1)(2)F.J.R.Taylor 1989 Bio-Systems 22.p177-187UCN 中中 GCN 中中 GAU/C 中中UGG GGN AAU/CUAU/C ACN GAA/GCAA/G UCN CAA/GAAA/G CCN AAA/GAAU/C CGN AUGGAA/G AAU/C CAU/CCAU/G CAA/G UUU/CGAU/C 亲亲 GAA/G CGNCGN GAU/C 亲亲 UAU/C AAA/G UGG 大大 204 kd2ed Nt

23、 =U (hydrophobic aa)A/G (hydrophilic aa)C (neutral aa or hydrophobic aa)c)Nt of codon 对蛋白质功能的决定对蛋白质功能的决定 1th&3rd Nt的摇摆的摇摆 对蛋白质的结构与功能影响不大对蛋白质的结构与功能影响不大 2edNt不能摇摆不能摇摆d)生物学意义生物学意义 依据依据codon in codon（2edNt of codon）判断氨基酸的性质判断氨基酸的性质 保证遗传的稳定保证遗传的稳定 蛋白质性质预测蛋白质性质预测 蛋白质定点诱变蛋白质定点诱变 蛋白质改造蛋白质改造（蛋白质工程）（蛋白质工程）5.4

24、.peptide synthesize5.4.peptide synthesizeProtein synthesis occurs in three subcellular compartments each contain different machinery in plantMore than 20,000 proteins50-10030-405.4.1.Direction of peptide elongation N C R1 O H R2 R3H O H ONCCNCC +NCCH OH H OHH H H R3 R1 O H R2H O H ONCC +NCCNCCH OH H

25、 OH H H H机制？H C N HH C H HSCH3C OP OH3 ACCA-O2ACCAP O3-OH2Met+tRNAf metOH 2 OH 3转酯转酯 aa 甲酰化甲酰化H C N HH C HSCH3C OHHC O甲酰甲硫氨酰-tRNA合成酶in Prok.f MettRNAf met&Met-tRNAmmet5.4.2.AminoacyltRNAaain Euk.MettRNAImet&Met-tRNAemet5.4.3.peptide synthesize AARSAminoacyl tRNA synthetase氨基酰氨基酰tRNA合成酶合成酶氨基酸活化氨基酸活化氨

26、基酰氨基酰tRNA合成合成氨基酰氨基酰-AMP a,氨基酸活化氨基酸活化b.Initiation factor of translation in Prok.b.Initiation factor of translation in Prok.IF-1 9.5kd 加强加强IF-2，IF-3的酶活的酶活IF-2 95kd-117kd 促使促使fMet-tRNA fmet 选择性的结合选择性的结合 在在30S亚基上亚基上IF-3 20kd 促使促使30S亚基结合于亚基结合于mRNA起始部位起始部位 具有具有解离解离30S与与50S亚基亚基的活性的活性核糖体小亚基是起始复合物的装配位点核糖体小亚基

27、是起始复合物的装配位点Initiation of translation in Prok.IF-2fmetfmet30s-mRNA complexBinary complexGTPCompleteInitiation complexfmetfmetIF3IF3Initiation of translation in Euk.Initiation of translation in Euk.eIF-2GTPMetMetSubunit Initiation ComplexSubunit binding to end of mRNAMetMetATPADP+Picomplexc.Initiation

28、 Enzyme 0f translation in Euk.c.Initiation Enzyme 0f translation in Euk.eIF-2 3种亚基种亚基 形成形成三元起始复合体三元起始复合体（eIF-2,GTP,tRNA)eIF-2A 65kd 促使促使Met-tRNAmet与与40S亚基结合亚基结合ieIF-1 15kd 促使促使mRNA 与与40S亚基结合亚基结合eIF-3 500kd 促使促使mRNA 与与40S亚基结合亚基结合eIF-4B 80kd 促使促使mRNA 与与40S亚基结合亚基结合 eIF-4A 50kd 促使与促使与mRNA,GTP结合结合eIF-4C

29、19kd 促使两亚基结合促使两亚基结合 eIF-5 150kd 释放释放eIF-2,eIF-3 eIF-4E (eIF-4F 的亚基的亚基)与与5端帽子结合端帽子结合 d.ribosome d.ribosome主要功能位点主要功能位点 P site(肽酰基结合位点，肽酰基结合位点，peptidyl attachment site)A site(氨酰基结合位点，氨酰基结合位点，Aminoacyl binding site)E site(退出位点，退出位点，Exit site of tRNA)Complete initiation Complex of translation Complete i

30、nitiation Complex of translation Translation domainExit domain membraneExit site5s sitePeptidyl transferaseP siteA siteEF-G siteEF-Tu sitemRNA site20 NtfMetMetfMet-tRNAmetfMet-tRNAmetid.Processing initiationd.Processing initiation?S.D.Sequence?Scanning sequenceP ACInitiationInitiationCCPAfMetMetAl三个

31、步骤：进位，肽键形成，移位l延伸因子（elongation factor）：EF-Tu,EF-Ts,EF-GElongation Elongation P AMetAUG APMet AUG UUU CUG UAG PheTs+ADP ATPTuTsGDPTuGTP PheP A AUG UUU CUG UAGMet PheMet PheTsTuGTPTuGDPEF-G be needed for translocation Temperate S 多肽的终止多肽的终止(Termination of peptide)(Termination of peptide)-When-When 终止密码

32、子进入核糖体终止密码子进入核糖体 A siteA site 释放因子释放因子1或或2识别识别 tRNA+mRNA+large&small subunit 核糖体解体核糖体解体肽酰转移酶转变成肽酰转移酶转变成酯酶活性，水解酯酶活性，水解RF-1识别识别UAA、UAG；RF-2识别识别UAA、UGA；RF-3释放肽链释放肽链核糖体释放因子，核糖体释放因子，RRF蛋白质释放因子，蛋白质释放因子，RFTerminationTerminationM F LPAAUG UUU CUG UAGM F LPA UUU CUG UAGTFM F LPA UUU CUG UAGM F LTF-stop codon

33、 usage-stop codon usage（统计学上的规律）（统计学上的规律）-UAA stop codon-UAA stop codon 终止效率高终止效率高UAG易被漏读易被漏读 E.coli 165 genesBacillus 52 genesYeast 105 genes 对对 codon bias 强强的基因的基因 多选用多选用UAA 对对 codon bias 弱弱的基因的基因 多选用多选用UGA该基因多选用该基因多选用2 或或3 个个 stop codonl氨基酸与氨基酸与tRNAtRNA专一性结合专一性结合l核糖体沿核糖体沿mRNAmRNA移动方向：移动方向：5353l肽链

34、延伸方向：肽链延伸方向：N N端端CC端端lGTPGTP作为能量作为能量5.4.4 5.4.4 翻译的跳跃现象翻译的跳跃现象 -GGA-UAG-UCC-50Nt UAGA UG CG CStem-loopIR IR5.4.5 真核、原核细胞蛋白质生物合成比较真核、原核细胞蛋白质生物合成比较原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞抑制剂抑制剂四环素、氯霉素、链霉素、四环素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、嘌呤毒素卡那霉素、嘌呤毒素放线菌素放线菌素D D、亚胺环己酮、亚胺环己酮、白喉毒素、嘌呤毒素白喉毒素、嘌呤毒素起始起始tRNAtRNAtRNAtRNAf fMetMettRNAtRNAi iMetMet55上

35、游上游SDSD序列序列扫描序列。扫描序列。eIF-4FeIF-4F可识别、可识别、结合结合55帽子结构帽子结构起始、延伸、终止起始、延伸、终止因子数量因子数量3 3、3 3、3 39 9、2 2、1 1线粒体、叶绿体中蛋白质合成过程线粒体、叶绿体中蛋白质合成过程 类似于原核细胞类似于原核细胞5.5.保证保证peptide准确翻译的机制准确翻译的机制DNA replication =10-11RNA transcription =10-4Peptide translation P(准确率准确率)=（1）n(氨基酸的数目氨基酸的数目)N P(=10-2)P(=10-3)P(=10-4)100 36

36、%91.5%99%200 4.9%84%97%1000 0.004%36%90%机制机制?5.5.1.氨基酸与氨基酸与tRNA间的间的负载专一性负载专一性 氨基酰氨基酰tRNA合成酶合成酶（AARS）对氨基酸的特异识别与结合对氨基酸的特异识别与结合 AARS：aa 结合位点结合位点,tRNA 结合位点结合位点,ATP site aa 结合位点对结构相似的氨基酸的结合位点对结构相似的氨基酸的双筛作用双筛作用 例；例；Cys HSCH2CHCOOH NH2 Ala HCH2CHCOOH NH2 Ala-RS结构相似结构相似错误识别错误识别错误负载错误负载 错误翻译错误翻译 How?aa+ATP错误

37、激活错误激活 aa-AMP+tRNAaaAARSaa-tRNAaaaa 结合位点结合位点具有具有 结合位点结合位点（结合结合 or 激活位点激活位点)水解位点水解位点（Hydrolytic Site）错误负载错误负载AARS 双筛作用双筛作用aa+AMP水解水解5.5.2.anti-codon 对对codon 的准确识读的准确识读 wobble hypothesis anti-codon modifying5.5.3.对第一个对第一个Met(AUG)的准确起译的准确起译a)Prok.mRNA -S.D.seq-AUG-Euk.mRNA cap-CCACC-A-3-AUGG+4-GGAGGPai

38、ring with 16srRNA 3-end72Nt&富含富含 AT 最佳最佳富含富含G,将阻止起译过程将阻止起译过程Scanning signalImportantKozak 位点位点不同的不同的mRNA cap 要求要求 eIF4F 的相对浓度差异的相对浓度差异核糖体小亚基核糖体小亚基 scanning CCACC from 5 to 3保证从第一个保证从第一个AUG 起译起译调控翻译速率调控翻译速率b)eIF-4F 识别识别capEuk.c)IF2(eIF2)&Tu,Ts(EF1,EF1)酶的专效作用酶的专效作用Prok.IF2+fMet-tRNAfmet30s subunitP site of ribosomeEuk.eIF2+Met-tRNAimet40s subunitP site of ribosomeA site of ribosomeTu+Met-tRNAmmetA site of ribosomeEF1+Met-tRNAemet