高产酒率酿酒酵母单倍体分离和杂交育种课件.ppt
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- 高产 酿酒 酵母 单倍体 分离 杂交育种 课件
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1、许燕晴 08411441 摘要摘要 本文在筛选获得一批酒精发酵力较强的二倍体酿酒酵母菌株的基础上,优化产孢本文在筛选获得一批酒精发酵力较强的二倍体酿酒酵母菌株的基础上,优化产孢条件,应用筛选获得的高产酒精的单倍体菌株,经条件,应用筛选获得的高产酒精的单倍体菌株,经杂交育种杂交育种构建高产酿酒酵母菌株。构建高产酿酒酵母菌株。以以二倍体菌株二倍体菌株ZJD3ZJD3一一3 3、ZJD3ZJD3一一4 4、ZJD3ZJD3一一7 7、ZJD3ZJD3一一9 9和和ZJD3ZJD3一一11(11(称为称为ZJD3ZJD3系列系列)及非及非整倍体菌株整倍体菌株c19c19为实验菌株为实验菌株,经对产孢培
2、养基的优选,确认,经对产孢培养基的优选,确认McClaryMcClary产孢培养基产孢培养基为适宜为适宜的高产孢率培养基。在该培养基上经的高产孢率培养基。在该培养基上经2525、7 7天培养,酿酒酵母的产孢率可达到天培养,酿酒酵母的产孢率可达到47%47%。对对ZJD3ZJD3系列二倍体菌株进行单倍体分离,获得单倍体系列二倍体菌株进行单倍体分离,获得单倍体7171株株。对筛选所得单倍体菌株,。对筛选所得单倍体菌株,以及实验室原有单倍体菌株以及实验室原有单倍体菌株c36c36、c36c36一一8 8、c36c36一一9 9进行交配型和发酵性能测定,交配型进行交配型和发酵性能测定,交配型为为a a
3、型的单倍体与交配型为型的单倍体与交配型为的单倍体数目差异较大。得交配型的单倍体数目差异较大。得交配型a a的单倍体菌株的单倍体菌株3030株,株,交配型交配型的单倍体菌株的单倍体菌株1818株。从中筛选获得发酵性能较强的单倍体菌株株。从中筛选获得发酵性能较强的单倍体菌株4 4株,其中株,其中1 1株株为为a a型,型,3 3株为株为型,发酵性能最强的型,发酵性能最强的zs-5zs-5菌株其同等条件下酒精发酵后的酒度高出二菌株其同等条件下酒精发酵后的酒度高出二倍体亲株倍体亲株4.5%4.5%。以得到的以得到的4 4株强发酵菌株和单倍体菌株株强发酵菌株和单倍体菌株c36c36、c36c36一一8
4、8、c36c36一一9 9以及非整倍体菌株以及非整倍体菌株 C19C19为杂交亲株,分别进行群体杂交,发现不同交配型单倍体混合为杂交亲株,分别进行群体杂交,发现不同交配型单倍体混合2h2h后开始出现哑铃型后开始出现哑铃型细胞,平板分离培养细胞,平板分离培养48h48h后,经鉴定共获得杂合子后,经鉴定共获得杂合子124124株,经酒精发酵测验,从中筛选株,经酒精发酵测验,从中筛选获得发酵性能优良的酵母菌株获得发酵性能优良的酵母菌株6 6株。结果表明,株。结果表明,95%95%以上的杂合子酒精发酵性能优于杂以上的杂合子酒精发酵性能优于杂交亲株,最优者比杂交单倍体亲株提高交亲株,最优者比杂交单倍体亲
5、株提高 17.7%17.7%,比原始二倍体菌株高,比原始二倍体菌株高15.5%15.5%。经杂交育经杂交育种与重复酒精发酵测验,最终确认种与重复酒精发酵测验,最终确认zjzj一一1 1、zjzj一一2 2、zjzj一一3 3、zjzj一、一、zjzj一一5 5、zjzj一一6 6等等6 6株株高产酒精的菌株,为进一步选育构建超级工程菌株奠定了扎实基础。高产酒精的菌株,为进一步选育构建超级工程菌株奠定了扎实基础。前言前言 酒精生产用酒精生产用酿酒酵母酿酒酵母属于属于子囊菌亚门中的酵母菌科成员子囊菌亚门中的酵母菌科成员,主要,主要以出芽方式进行繁殖以出芽方式进行繁殖,属单细胞真核微生物属单细胞真核
6、微生物。利用酿酒酵母发酵糖类生产乙醇的历史非常悠久,。利用酿酒酵母发酵糖类生产乙醇的历史非常悠久,目前世界乙醇目前世界乙醇产量的产量的80%80%以上是通过酿酒酵母以淀粉质或其他糖质原料发酵生产的以上是通过酿酒酵母以淀粉质或其他糖质原料发酵生产的.酵母菌在厌氧条件下发酵己糖生成酒精,其生化途径主要由两个阶段组成。第一个酵母菌在厌氧条件下发酵己糖生成酒精,其生化途径主要由两个阶段组成。第一个阶段为己糖通过糖酵解途径阶段为己糖通过糖酵解途径(EMP(EMP途径途径)分解生成丙酮酸。第二个途径丙酮酸由脱羧酶催化分解生成丙酮酸。第二个途径丙酮酸由脱羧酶催化形成乙醛和二氧化碳,乙醛进一步被还原生成乙醇。
7、葡萄糖发酵生成乙醇的总反应简式形成乙醛和二氧化碳,乙醛进一步被还原生成乙醇。葡萄糖发酵生成乙醇的总反应简式为为:C6H206 C6H2062C2H50H+2C02+2C2H50H+2C02+能量能量 就理论而言,酿酒酵母行酒精发酵,每消耗就理论而言,酿酒酵母行酒精发酵,每消耗 1mol 1mol葡萄糖可产生葡萄糖可产生 2mol 2mol乙醇,即乙醇,即180180克克葡萄糖产生葡萄糖产生9292克乙醇,理论得率为克乙醇,理论得率为51.n%51.n%。可在生产实际中,远未达到此得率。原因是酵。可在生产实际中,远未达到此得率。原因是酵母发酵过程中除主要生成乙醇外,还生成少量的其他副产物,包括甘
8、油、有机酸母发酵过程中除主要生成乙醇外,还生成少量的其他副产物,包括甘油、有机酸(乙酸、乙酸、乳酸、墟拍酸等乳酸、墟拍酸等)、杂醇油、杂醇油(高级醇高级醇)、醛类等,大约有、醛类等,大约有4 4一一10%10%的碳源将被用于形成副物,的碳源将被用于形成副物,加之工艺条件与其他环境因素的影响,实际可发酵性糖的利用率更低。我国目前工业规加之工艺条件与其他环境因素的影响,实际可发酵性糖的利用率更低。我国目前工业规模的酒精生产因不同地区、企业、所用原料与酵母种类、工艺条件等方面的差异,糖醇模的酒精生产因不同地区、企业、所用原料与酵母种类、工艺条件等方面的差异,糖醇转化率一般在转化率一般在8585一一9
9、0%90%之间。之间。自改革开放以来,由于我国经济与社会的持续快速发展,能源需求快速增长与供给自改革开放以来,由于我国经济与社会的持续快速发展,能源需求快速增长与供给能力严重不足的矛盾日益突出,环境空气污染的日益加剧,己经成为制约社会可持续健能力严重不足的矛盾日益突出,环境空气污染的日益加剧,己经成为制约社会可持续健康发展的瓶颈之一。康发展的瓶颈之一。20002000年后,国家开始具体实施发展可再生、替代性、环保型能源战年后,国家开始具体实施发展可再生、替代性、环保型能源战略,先后在我国黑龙江、吉林、河南、安徽四省布局建设以农作物所含有淀粉或糖质原略,先后在我国黑龙江、吉林、河南、安徽四省布局
10、建设以农作物所含有淀粉或糖质原料生产可再生、环保型、替代性能源料生产可再生、环保型、替代性能源-燃料乙醇的定点生产基地,燃料乙醇的定点生产基地,20062006年生产规模已年生产规模已达到达到100100余万吨,并以较快速度发展至本五年计划末达到近余万吨,并以较快速度发展至本五年计划末达到近500500万吨万吨/年的生产规模。年的生产规模。由于燃料乙醇的大规模生产消耗了数量比较巨大的淀粉与糖质原料,导致相应原料由于燃料乙醇的大规模生产消耗了数量比较巨大的淀粉与糖质原料,导致相应原料的市场价格较快速上扬,燃料乙醇生产成本不断上升,虽然现燃料乙醇定点生产得到国的市场价格较快速上扬,燃料乙醇生产成本
11、不断上升,虽然现燃料乙醇定点生产得到国家一定的财政补贴,但目前原料价格上涨幅度已使燃料乙醇生产企业濒临亏损边缘。因家一定的财政补贴,但目前原料价格上涨幅度已使燃料乙醇生产企业濒临亏损边缘。因此,构建酒精高产酵母,对于降低燃料乙醇生产成本,确保燃料乙醇生产企业利润,促此,构建酒精高产酵母,对于降低燃料乙醇生产成本,确保燃料乙醇生产企业利润,促进其自身稳定发展,顺利实现国家新能源战略目标,保持社会与经济可持续健康发展等进其自身稳定发展,顺利实现国家新能源战略目标,保持社会与经济可持续健康发展等均具重要的意义。均具重要的意义。长期以来,提高酵母酒精发酵的得率不外乎探索新发酵工艺和选育高产长期以来,提
12、高酵母酒精发酵的得率不外乎探索新发酵工艺和选育高产酿酒酵母菌株。高产菌株的选育主要是从自然界或已知能产酒精的酵母中分离酿酒酵母菌株。高产菌株的选育主要是从自然界或已知能产酒精的酵母中分离筛选。从自然界筛选的野生酵母一般很难具有用于发酵工业生产的理想特性,筛选。从自然界筛选的野生酵母一般很难具有用于发酵工业生产的理想特性,需要进一步的驯化培养和利用育种技术进行改良,使其达到工业大生产的要求。需要进一步的驯化培养和利用育种技术进行改良,使其达到工业大生产的要求。诱变育种是菌种选育的重要方法之一,通过各种物理和化学因子诱变,能够得诱变育种是菌种选育的重要方法之一,通过各种物理和化学因子诱变,能够得到
13、性能增强的酵母菌株。随着原生质体融合和基因工程技术的不断成熟,采用到性能增强的酵母菌株。随着原生质体融合和基因工程技术的不断成熟,采用原生质体融合和重组原生质体融合和重组DNADNA技术实现高产酒率酿酒酵母菌株的构建,其研究报道技术实现高产酒率酿酒酵母菌株的构建,其研究报道屡见不鲜。通过代谢工程手段阻断酿酒酵母甘油的合成或降低甘油的合成量,屡见不鲜。通过代谢工程手段阻断酿酒酵母甘油的合成或降低甘油的合成量,以提高乙醇发酵的糖醇转化率,也已有实验室条件下获得成功的报道。可见工以提高乙醇发酵的糖醇转化率,也已有实验室条件下获得成功的报道。可见工业微生物优良菌株的选育从自然选择、驯化育种业微生物优良
14、菌株的选育从自然选择、驯化育种 、诱变育种、诱变育种 、杂交育种、杂交育种 、代谢调节育种代谢调节育种 发展到基因工程育种发展到基因工程育种 ,在减少盲目性、省时、降低工作量、提,在减少盲目性、省时、降低工作量、提高选育效率等方面已取得长足的进步。高选育效率等方面已取得长足的进步。工业微生物遗传育种,选用哪种或先后采用哪几种方法为宜,应根据所工业微生物遗传育种,选用哪种或先后采用哪几种方法为宜,应根据所用菌株的特性,目的产物生成的代谢途径与调控模式、工业化实际应用时的工用菌株的特性,目的产物生成的代谢途径与调控模式、工业化实际应用时的工艺条件等因事制宜,具体把握。艺条件等因事制宜,具体把握。酿
15、酒酵母属真核生物酿酒酵母属真核生物,结构组成与代谢调控体系复杂结构组成与代谢调控体系复杂。酿酒酵母酒精发。酿酒酵母酒精发酵的代谢,属细胞基础代谢范畴,酵母细胞高效率吸收利用可发酵性糖生长代酵的代谢,属细胞基础代谢范畴,酵母细胞高效率吸收利用可发酵性糖生长代谢生成乙醇的效率受细胞全能性调控网络协调控制,属本源性多基因、多步骤、谢生成乙醇的效率受细胞全能性调控网络协调控制,属本源性多基因、多步骤、全局性高度协调的基因表达调控模式。因此,要人为地方向明确地提升其代谢全局性高度协调的基因表达调控模式。因此,要人为地方向明确地提升其代谢水平,又要使其良好适应环境多变的大规模工业生产条件并收到实效,技术难
16、水平,又要使其良好适应环境多变的大规模工业生产条件并收到实效,技术难度极其大。作者所在实验室曾用高温热击、多级诱变为主的技术途径,在技术度极其大。作者所在实验室曾用高温热击、多级诱变为主的技术途径,在技术创新上有所突破,成功选育耐高温、高转化率酒精生产菌株,并在酒精工业上创新上有所突破,成功选育耐高温、高转化率酒精生产菌株,并在酒精工业上实际应用,取得较显著的经济与社会效益。该技术体系虽目前与今后仍不失为实际应用,取得较显著的经济与社会效益。该技术体系虽目前与今后仍不失为一种行之有效的高产酵母选育方法,但该研究成果的问世几近十年,工耗大、一种行之有效的高产酵母选育方法,但该研究成果的问世几近十
17、年,工耗大、费时多、周期长和效率低。费时多、周期长和效率低。现尚未见通过基因或代谢工程获得工业化高效率酒精生产菌株的报道。这现尚未见通过基因或代谢工程获得工业化高效率酒精生产菌株的报道。这主要是由于基因工程技术在工业微生物育种方面虽已取得不少成果,但目前的主要是由于基因工程技术在工业微生物育种方面虽已取得不少成果,但目前的技术水平主要适用于新增受外源基因及其调控系统调控的代谢类型,或内源性技术水平主要适用于新增受外源基因及其调控系统调控的代谢类型,或内源性单基因、寡基因控制的代谢水平的提高。单基因、寡基因控制的代谢水平的提高。酵母杂交酵母杂交在基础研究与酒精高产酵母选育方面,有关专著与论文中可
18、见报在基础研究与酒精高产酵母选育方面,有关专著与论文中可见报道,道,它是一种相对传统的微生物育种手段,通过杂交可以把不同菌株的优良经它是一种相对传统的微生物育种手段,通过杂交可以把不同菌株的优良经济性状集于重组体中,克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷济性状集于重组体中,克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷;通通过杂交可以扩大变异范围,改变产品的质量和产量,甚至出现新的品种,实践过杂交可以扩大变异范围,改变产品的质量和产量,甚至出现新的品种,实践中已取得不少成果。中已取得不少成果。例如,日本的小田等人用酒精酵母和卡尔斯伯酵母杂交获例如,日本的小田等人用酒精酵母和卡尔斯伯酵母
19、杂交获得的杂交株,其乙醇产量和菌体生长量都比亲本有显著的提高,且发酵麦芽糖得的杂交株,其乙醇产量和菌体生长量都比亲本有显著的提高,且发酵麦芽糖的能力比亲株明显增强。但止目前尚未见较为系统地探索研究酒精生产工业菌的能力比亲株明显增强。但止目前尚未见较为系统地探索研究酒精生产工业菌株的杂交育种规律,成功构建工业化规模应用的高性能酒精酵母菌株的报道。株的杂交育种规律,成功构建工业化规模应用的高性能酒精酵母菌株的报道。本文试图结合工业化高产酒精酵母构建课题的研究内容,对现有优良的工业化本文试图结合工业化高产酒精酵母构建课题的研究内容,对现有优良的工业化应用的酒精生产菌株的产孢条件、子囊发育、产孢率、交
20、配型分布规律、杂交应用的酒精生产菌株的产孢条件、子囊发育、产孢率、交配型分布规律、杂交与及其子代中高产株的分布与产酒优势性状的分离组合规律等进行较为系统地与及其子代中高产株的分布与产酒优势性状的分离组合规律等进行较为系统地研究,为建立相对高效率的通过杂交选育构件酒精高产酵母菌株的技术体系莫研究,为建立相对高效率的通过杂交选育构件酒精高产酵母菌株的技术体系莫定基础,同时为促进遗传学理论与技术的发展做出新的贡献定基础,同时为促进遗传学理论与技术的发展做出新的贡献材料与方法材料与方法1.菌株 酵母二倍体:ZJD3-3 ZJD3-4 ZJD3-7 ZJD3-9 ZJD3-11 非整倍体:C19 单倍体
21、:C36 C36-8 C36-9 Z2-3 Hs25 Hs27培养基培养基固体斜面完全培养基固体斜面完全培养基(YPD(YPD)1%酵母提取物 2%葡萄糖 2%蛋白胨 1.5%琼脂 pH自然115C湿热灭菌30min,用于制备斜面和平板。产孢培养基产孢培养基(McClary)葡萄糖 0.1%KCI 0.18%NaAC 0.82%酵母膏 0.25%琼脂 2%产孢培养基产孢培养基(SPM)(SPM)葡萄糖 0.1%KCl l%KH2P04 5mmol/L 酵母膏0.25%琼脂 2%基本培养基基本培养基葡萄糖 2%KH2PO4 0.1%MgSO4.7H2O 0.05%(NH4)2SO4 0.5%琼脂
22、 2%PH 6.0酒母培养基酒母培养基玉米面粉糖化缪,加糖化酶过夜(2024h)后,缪液用两层纱布过滤,取滤过液,加水调整其糖度为14Bx。115C湿热灭菌30min。如暂不使用,则置于-20冰箱中冷藏,化冻后再灭菌使用。发酵培养基发酵培养基23一26Bx的玉米面粉糖化缪,不需要糖化过夜与过滤。加压闷煮lh后,直接使用。无需灭菌。甘油保种培养基甘油保种培养基50%甘油十50%YPD(加琼脂的固体培养基),分装至甘油管中。115C湿热灭菌3Omin,用于保种。试剂试剂斐林试剂斐林试剂甲液:精确称取分析纯硫酸铜(CuSO45H2O)69.278克,加水溶解后,稀 释定容至1000毫升。乙液:称取酒
23、石酸钾钠(KNaC4H4O64H2O)346克和氢氧化钠(NaOH)100 克,加水溶解后,稀释定容至1000毫升。0.2%0.2%标准葡萄糖溶液标准葡萄糖溶液取分析纯葡萄糖置105一110C干燥1.5一2h,冷却后,精确称取2.000克,溶于水后,稀释定容至1000毫升。液化酶液化酶2000020000u/u/mlml,糖化酶糖化酶100000100000u/u/mlml,O.O.1N1N氢氧化钠氢氧化钠称取4克分析纯氢氧化钠(NaOH),溶于少量已煮沸并冷却的蒸馏水中,弃去下面碳酸钠沉淀物,取上层清液,用上述蒸馏水稀释至1000毫升。1%1%次甲级蓝溶液次甲级蓝溶液称取次甲级蓝1克加水溶解
24、,稀释至100毫升。1%1%酚酞指示剂酚酞指示剂称取酚酞1克,溶解于100毫升95%酒精中。0.85%0.85%氯化钠溶液氯化钠溶液(生理盐水生理盐水)0.8一0.9Kg/cm压力下高压蒸汽灭菌 20minSNSN浓硫酸浓硫酸 量取比重为1.84的分析纯浓硫酸135毫升,缓缓注入已盛有800毫升水的1000毫升容量瓶中,待冷却至常温后,加水稀释至刻度。柠檬酸一磷酸缓冲液柠檬酸一磷酸缓冲液(C CPB)PB)0.lmol/L 柠檬酸0.2mol/L NaHPo4(0.8一0.9Kg/cm压力下高温蒸汽灭菌)10%10%蜗牛酶蜗牛酶,使用前用高渗CPB缓冲液配置,0.45um滤膜抽虑灭菌 10%1
25、0%琉基乙醇琉基乙醇 主要设备与器材主要设备与器材台式离心机,台式离心机,TGLTGL一一 16C 16C,糖液计,一糖液计,一2525,010010,10201020,20302030,酒精计,酒精计,010010,10201020,电热恒温水槽,电热恒温水槽,DK-8BDK-8B,电子天平,电子天平,MettlerPM460 MettlerPM460显微镜,显微镜,XSJXSJ一一l l血球计数板,血球计数板,XBXB一一K-25,K-25,灭菌锅,灭菌锅,ZDXZDX一一35BI35BI,振荡器,振荡器,HZHZ一一931IK931IK、HzHz一一2010K2010K,磁力搅拌器,磁力
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