蛋白质与酶工程酶学基本理论课件1.ppt

1、蛋白质与酶工程酶学基本理论蛋白质与酶工程酶学基本理论优选蛋白质与酶工程酶学基本理论酶的概念酶的概念v目前将生物催化剂分为两类酶、核酶（ribozyme）n酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物（substrate）具有高效催化作用的生物大分子，包括蛋白质和核酸。第第 一一 节节 酶的分类和命名酶的分类和命名酶的分类与命名原则（自学为主）P酶和R酶数量高达数千种 要准确地识别各种酶，避免发生混乱或误解，就必须建立一套酶的 分类(classification)和 命名(nomenclature)的原则 国际系统分类命名法原则（1）根据酶的底物来命名Ribonuclease 核糖核酸酶Protease

2、 蛋白酶（2）根据所催化的反应类型来命名Dehydrogenase 脱氢酶Phosphotransferase 磷酸转移酶Aminotransferase 转氨酶（3）上述两个原则结合 丙酮酸脱氢酶（4）上述原则再加上酶的来源如牛胰核糖核酸酶1、P酶的分类与命名 国际酶学委员会（international commission of enzyme,ICE)于1961年提出了酶的分类与命名方案，此后不断得到补充和修改 其建议每一种酶都有其推荐名和系统命名推荐名由两部分组成底物名称+催化反应类型+“酶”如葡萄糖氧化酶 *对于水解酶类，可省去“水解”,如淀粉酶，蛋白酶，乙酰胆碱酶等 *必要时再加上酶

3、的来源或其它特性，如菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶，碱性磷酸酶等 P酶的分类原则 1）按照其催化作用的类型，分为6大类 2）每大类中，按底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类 3）每一亚类中分为若干小类 4）每一小类包含若干个具体的酶 国际系统分类法及酶的编号、反应通式1、氧化还原酶（1）AH2BABH22、转移酶（2）ABCABC3、水解酶（3）ABH2OAOHBH4、裂合酶（4）ABAB 5、异构酶（5）AB 6、连接酶或合成酶（6）ABATPABADPPi 或 ABATPABAMPPPi六大类编号依次为 1.2.3.4.5.6亚类编号依次为 1.2.3.4.5.6.亚亚类编号依次为 1.2.3.

4、4.5.6.（1）氧化还原酶类（Oxidoreductases）包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等 其催化的反应通式AH2+B=A+BH2 被氧化的底物(AH2）为氢或电子供体 被还原的底物（B）为氢或电子受体 系统命名供体在前，受体在后，再加上氧化还原 酶字样，即“醇NAD+氧化还原酶”其推荐名某供体脱氢酶（谷氨酸脱氢酶）或某受体还原酶（硝酸还原酶）无催化化剂时需要的活化能18 kcal/mol或称活性部位(active site)，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。温度升高，酶促反应速度升高；在林贝氏方程基

5、础上，两边同乘S动力学特点：Vmax降低，表观Km不变。*AF为底物多糖链的糖基，位于酶的活性中心形成的裂隙中。系统命名底物+裂解的基团裂合酶,如草酸羧基裂合酶，表明其催化草酸在羧基位置发生裂解反应只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。温度升高，酶促反应速度升高；抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物的浓度；胶体钯催化时需要的活化能11.或某受体还原酶（硝酸还原酶）（2）根据所催化的反应类型来命名如菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶，碱性磷酸酶等胶体钯催化时需要的活化能11.温度升高，酶促反应速度升高；（2）转移酶类（Transferases）包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等

6、催化某基团从供体化合物转移到受体化合物上的一类酶。反应通式 AB+C=A+BC 系统命名供体受体+某基团转移酶 如L天冬氨酸2酮戊二酸氨基转移酶 推荐名 受体（或供体）+某基团转移酶 上述同一酶为 L天冬氨酸氨基转移酶（3）水解酶类（Hydrolases）包括蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶、肽酶等；一般不需要辅酶，催化各种化合物进行水解反应的一类酶，其反应通式为AB+H2O=AOH+BH 系统命名底物+发生水解作用的化学键位置+水解酶 如5核苷酸磷酸水解酶，其底物是5核苷酸，水解反应发生在磷酸酯键上 推荐名底物+酶，如5核苷酸酶（4）裂合酶类（Lyases）催化一个化合物裂解为2个较小的化合物及其逆反

7、应的一类酶，其反应通式AB=A+B 一般裂合酶在裂解反应方向只有一个底物，而在缩合反应方向却有2个底物系统命名底物+裂解的基团裂合酶,如草酸羧基裂合酶，表明其催化草酸在羧基位置发生裂解反应推荐名底物+脱羧酶或醛缩酶或脱水酶等，而在缩合反应方向则加“合酶”（synthase)如草酸脱羧酶（草酸=甲酸+CO2)苏氨酸醛缩酶（L苏氨酸=甘氨酸+乙醛），乙酰乳酸合酶（2乙酰乳酸+CO2=2丙酮酸）等 （5）异构酶（Isomerase）催化分子内部基团位置或构象转换的一类酶，其反应通式 A=B，按异构化的类型不同，分为多个亚类 底物+异构酶 或底物+消旋酶 或底物+变位酶 或底物+表异构酶 或底物+顺反

8、异构酶等如葡萄糖异构酶催化“D葡萄糖=D果糖”丙氨酸消旋酶催化“L丙氨酸=D丙氨酸”（6）连接酶或合成酶（Ligase or synthetase):其关系到很多生命物质的合成，其特点是需要ATP等作为能源，有的还需要金属离子作辅助因子，分别形成CO键（与蛋白质合成有关）、CS键(与脂肪酸合成有关）、CC键和磷酸酯键，是伴随着ATP等核苷三磷酸的水解，催化2个分子进行连接反应的酶，其反应通式 A+B+ATP=AB+ADP+Pi 或AB+AMP+PPi 系统名2个底物的名称+连接酶，推荐名合成产物+合成酶。如天冬氨酸氨连接酶，其推荐名是天冬氨酰合成酶（L天冬氨酸+氨+ATP=L天冬酰胺+ADP+

9、Pi）2）R酶的分类和命名 通常按照其催化的作用底物、反应类型和酶本身的机构特点进行分类（1）根据其底物是本身RNA还是其它分子，分为 分子内催化（自我催化）或分子间催化 (2）根据其催化反应的类型分为剪切酶（只剪）、剪接酶（剪+连接）和多功能酶（3）根据其结构特点，分为锤头型、发夹型、含I型间插序列（IVS）和含II型IVS的R酶A-E为：IPTG 0.与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去(NAD+)。系统命名底物+裂解的基团裂合酶,如草酸羧基裂合酶，表明其催化草酸在羧基位置发生裂解反应（一）酶蛋白合成的诱导和阻遏定义Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。诱导法利用反

10、应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗如：天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）*谷氨酸35和天冬氨酸52是催化基团；(决定反应的种类与性质)4）每一小类包含若干个具体的酶酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比一般催化剂高1071013倍。推荐名 受体（或供体）+某基团转移酶*AF为底物多糖链的糖基，位于酶的活性中心形成的裂隙中。05 mmol/L、0.酶的抑制剂(inhibitor)要准确地识别各种酶，避免发生混乱或误解，就必须建立一套酶的其推荐名某供体脱氢酶（谷氨酸脱氢酶）（4）裂合酶类（Lyases）05 mmol/L、0.分子内催化的R酶（1）自我剪切酶

11、即在一定条件下催化自身RNA分子进行剪切反应；都是RNA的前体，自我催化后，将前体剪切为成熟的RNA分子和另外一个RNA片段 如T4噬菌体RNA前体（215nt）催化自身成为成熟RNA(139nt）和一个76nt的片段（2）自我剪接酶在一定条件下催化自身RNA分子同时进行剪切和连接反应；都是RNA前体分子间催化的R酶据其所作用的底物分子不同，分为若干亚类（1）RNA剪切酶 （2）DNA剪切酶（3）多肽剪切酶（4）多糖剪切酶（5）多功能R酶催化其它分子进行多种反应的R酶，例如 L19 IVS能够催化RNA剪接、限制性内切、去磷酸等作用氧化还原酶类氧化还原酶类 Oxidoreductases转移酶

12、类转移酶类 Transferases水解酶类水解酶类Hydrolases裂合酶类裂合酶类Lyases异构酶类异构酶类Isomerases合成酶类合成酶类Synthetases Synthases分子内催化分子内催化R酶酶(in cis ribozyme)自我剪切酶自我剪切酶(self-cleavage rebozyme)自我剪接酶自我剪接酶(self-splicing rebozyme)分子间催化分子间催化R酶酶(in trans ribozyme)RNA剪切酶剪切酶 DNA剪切酶剪切酶 多肽剪切酶多肽剪切酶 多糖剪接酶多糖剪接酶 多功能多功能R酶酶 其它其它R酶酶蛋白类酶蛋白类酶proteo

13、zyme核酸类酶核酸类酶ribozyme酶酶enzyme酶的分类总结酶的分类总结酶的不同形式酶的不同形式v单体酶(monomeric enzyme)仅具有三级结构的酶。v寡聚酶(oligomeric enzyme)由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。v多酶体系(multienzyme system)由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。v多功能酶(multifunctional enzyme)或串联酶(tandem enzyme)一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。一、一、酶的分子组成酶的分子组成蛋白质部分：酶蛋白(ap

14、oenzyme)辅助因子(cofactor)金属离子小分子有机化合物全酶(holoenzyme)(simple enzyme)结合酶(conjugated enzyme)金属酶金属酶(metalloenzyme)(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失失（如羧基肽酶Zn、黄嘌呤氧化酶Mo等）。金属激活酶金属激活酶(metal-activated enzyme)(metal-activated enzyme)金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密不甚紧密（如己糖激酶Mg）。金属离子金

15、属离子小分子有机化合物在催化中的作用小分子有机化合物在催化中的作用尼克酰胺（维生素尼克酰胺（维生素PP之一）之一）尼克酰胺（维生素尼克酰胺（维生素PP之一）之一）维生素维生素B2（核黄素）（核黄素）维生素维生素B2（核黄素）（核黄素）维生素维生素B1（硫胺素）（硫胺素）泛酸泛酸硫辛酸硫辛酸维生素维生素B12生物素生物素吡哆醛（维生素吡哆醛（维生素B6之一）之一）叶酸叶酸NAD+（尼克酰胺腺嘌呤二核（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶苷酸，辅酶I）NADP+（尼克酰胺腺嘌呤二核（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶苷酸磷酸，辅酶II）FMN（黄素单核苷酸）（黄素单核苷酸）FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）（黄素

16、腺嘌呤二核苷酸）TPP（焦磷酸硫胺素）（焦磷酸硫胺素）辅酶辅酶A（CoA）硫辛酸硫辛酸钴胺素辅酶类钴胺素辅酶类生物素生物素磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛四氢叶酸四氢叶酸氢原子（质子）氢原子（质子）醛基醛基酰基酰基烷基烷基二氧化碳二氧化碳氨基氨基甲基、甲烯基、甲基、甲烯基、甲炔基、甲酰基甲炔基、甲酰基等一碳单位等一碳单位所含的维生素所含的维生素名名称称小分子有机化合物小分子有机化合物(辅辅 酶酶 或或 辅辅 基基)转移的基团转移的基团尼克酰胺（维生素尼克酰胺（维生素PP之一）之一）尼克酰胺（维生素尼克酰胺（维生素PP之一）之一）维生素维生素B2（核黄素）（核黄素）维生素维生素B2（核黄素）（核黄素）维生素

17、维生素B1（硫胺素）（硫胺素）泛酸泛酸硫辛酸硫辛酸维生素维生素B12生物素生物素吡哆醛（维生素吡哆醛（维生素B6之一）之一）叶酸叶酸NAD+（尼克酰胺腺嘌呤二核（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶苷酸，辅酶I）NADP+（尼克酰胺腺嘌呤二核（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶苷酸磷酸，辅酶II）FMN（黄素单核苷酸）（黄素单核苷酸）FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）（黄素腺嘌呤二核苷酸）TPP（焦磷酸硫胺素）（焦磷酸硫胺素）辅酶辅酶A（CoA）硫辛酸硫辛酸钴胺素辅酶类钴胺素辅酶类生物素生物素磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛四氢叶酸四氢叶酸氢原子（质子）氢原子（质子）醛基醛基酰基酰基烷基烷基二氧化碳二氧化碳氨基氨基甲基、

18、甲烯基、甲基、甲烯基、甲炔基、甲酰基甲炔基、甲酰基等一碳单位等一碳单位所含的维生素所含的维生素名名称称小分子有机化合物小分子有机化合物(辅辅 酶酶 或或 辅辅 基基)转移的基团转移的基团了解酶底物在体内的浓度水平一些抗体酶可有选择地使病毒外壳蛋白的肽键裂解，从而防止病毒与靶细胞结合4）每一小类包含若干个具体的酶了解酶底物在体内的浓度水平反应温度一般比较温和。系统命名供体在前，受体在后，再加上氧化还原抑制剂可用透析、超滤等方法除去。引入法借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能（二）酶促反应的作用效应Kinetics of EnzymeCatalyzed

19、 Reaction（三）酶促反应的可调节性如菠萝蛋白酶，木瓜蛋白酶，碱性磷酸酶等诱导法利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗 非必需激活剂(nonessential activator)（5）多功能R酶催化其它分子进行多种反应的R酶，例如 L19 IVS能够催化RNA剪接、限制性内切、去磷酸等作用将抗体转变为酶主要方法在林贝氏方程基础上，两边同乘S温度升高，酶促反应速度升高；要准确地识别各种酶，避免发生混乱或误解，就必须建立一套酶的必需基团(essential group)辅助因子分类辅助因子分类（按其（按其与酶蛋白结合的紧密程度与酶蛋白结合的紧密程度）辅酶辅酶

20、(coenzyme):(coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去方法除去(NAD+)。辅基辅基 (prosthetic group):(prosthetic group):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去滤的方法除去(FAD、FMN)。二、酶的活性中心二、酶的活性中心必需基团必需基团(essential(essential group)group)酶分子中氨基酸残基酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中侧链的化学基团中，一些一些与酶活性密切相关的化学与酶活性密切相关的化学基团基团。目目 录录或称活性

21、部位或称活性部位(active site)(active site)，指必需，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。物转化为产物。酶的活性中心酶的活性中心(active center)(active center)活性中心内的必需基团活性中心内的必需基团结合基团结合基团binding groupbinding group催化基团催化基团(catalytic group)(catalytic group)催化底物转变成产物催化底物转变成产物 位于活性中心以外，维持

22、酶活性中心应有位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。的空间构象所必需。活性中心外的必需基团活性中心外的必需基团底底 物物 活性中心以外活性中心以外的必需基团的必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团 活性中心活性中心 目目 录录溶菌酶的活性溶菌酶的活性中心中心*谷氨酸谷氨酸35和天和天冬氨酸冬氨酸52是催化是催化基团；基团；*色氨酸色氨酸62和和63、天冬氨酸天冬氨酸101和和色氨酸色氨酸108是结是结合基团；合基团；*AF为底物多为底物多糖链的糖基，位糖链的糖基，位于酶的活性中心于酶的活性中心形成的裂隙中。形成的裂隙中。活性中心活性中心 结合部位结合部位 必需基团必需基团 催

23、化部位催化部位 酶的结构酶的结构 活性中心以外的必需基团活性中心以外的必需基团 其它部分其它部分 三、同工酶和抗体酶三、同工酶和抗体酶1 1、同工酶、同工酶(isoenzyme)(isoenzyme)是指催化相同的化学反应但一级结构不同的是指催化相同的化学反应但一级结构不同的一组酶，其理化性质、免疫学性质等也不相同。一组酶，其理化性质、免疫学性质等也不相同。*生理及临床意义生理及临床意义 用于解释发育过程用于解释发育过程中阶段特有的代谢特中阶段特有的代谢特征；征；同工酶谱的改变有同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断；助于对疾病的诊断；同工酶可以作为遗同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分传标志，用于遗

24、传分析研究。析研究。心肌梗死和肝病病人血清心肌梗死和肝病病人血清LDHLDH同工酶谱的变化同工酶谱的变化1 1酶酶活活性性心肌梗死酶谱心肌梗死酶谱正常酶谱正常酶谱肝病酶谱肝病酶谱2 23 34 45 52、抗体酶（abzyme）或催化抗体（catalytic antibody)定义是具有催化功能的抗体 本质免疫球蛋白，其易变区被赋予了酶的属性，即具有催化作用的免疫球蛋白优势为人们提供了一条合理途径去设计需要的酶，尤其是目前难以获得的甚至是还没有的酶。将抗体转变为酶主要方法诱导法利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗 Pollack等以硝基苯酚磷酸胆碱酯作为半抗原诱

25、导产生单抗，经筛选找到加快其水解反应1.2万倍的抗体酶引入法借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原抗体互补性来设计 抗体酶的应用v一种抗体酶可切开血纤维蛋白（血凝块的主要成分），可以用于溶栓治疗v一些抗体酶可固定在癌细胞突出的蛋白质上，破坏癌细胞膜，将用于癌症治疗v一些抗体酶可有选择地使病毒外壳蛋白的肽键裂解，从而防止病毒与靶细胞结合v立体专一性抗体酶的研究，使生产高纯度立体专一性的药物成为现实，因此随之出现大量针对性强、药效高的药物v抗体酶的固定化已获得成功，将大大地推进工业化进程第三节第三节 酶的工作原理酶的工作原

26、理The Mechanism of The Mechanism of EnzymeCatalyzed Reaction EnzymeCatalyzed Reaction u酶与一般催化剂的共同点酶与一般催化剂的共同点在反应前后没有质和量的变化；在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。平衡点。（一）酶促反应具有极高的效率（一）酶促反应具有极高的效率 一、一、酶促反应的特点酶促反应的特点酶的催化效率通常比非催化反应高酶的催化效率通常比非催化反应高10108 81010

27、2020倍，倍，比一般催化剂高比一般催化剂高10107 710101313倍。倍。反应温度一般比较温和。反应温度一般比较温和。酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能活化能(activation energy)(activation energy)。酶比一般催化剂。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。更有效地降低反应的活化能。反应总能量改变 非催化反应活化能 酶促反应酶促反应 活化能活化能 一般催化剂催一般催化剂催化反应的活化能化反应的活化能 能能量量 反反 应应 过过 程程 底物 产物 酶促反应活化能的改变酶促反应活化能的改变 活化能：底

28、物分子从初态转变到活化态所需的能量。活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。H2O2 2H2O +O2 无催化化剂时需要的活化能18 kcal/mol 胶体钯催化时需要的活化能11.7 kcal/mol 过氧化氢酶催化需要的活化能2 kcal/mol根据酶对其底物结构选择的严格程度不同，根据酶对其底物结构选择的严格程度不同，酶的特异性可大致分为以下酶的特异性可大致分为以下3 3种类型种类型v绝对特异性绝对特异性(absolute specificity)(absolute specificity)只能作用于特定结只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的构的底物，进

29、行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物产物 。v相对特异性相对特异性(relative specificity)(relative specificity)作用于一类化合物作用于一类化合物或一种化学键。或一种化学键。v立体结构特异性立体结构特异性(stereo specificity)(stereo specificity)作用于立体异构作用于立体异构体中的一种。体中的一种。（二）酶促反应具有高度的特异性（二）酶促反应具有高度的特异性（三）（三）酶促反应的可调节性酶促反应的可调节性 对酶量的调节对酶量的调节生成量的调节生成量的调节降解量的调节降解量的调节 酶活性的调节酶活性的调节別构调节別构

30、调节共价修饰调节共价修饰调节酶原的激活酶原的激活酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包不断变化的内外环境和生命活动的需要。其中包括两方面的调节：括两方面的调节：反应温度一般比较温和。酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。4）每一小类包含若干个具体的酶调节对象 关键酶催化一个化合物裂解为2个较小的化合物及其逆反应的一类酶，其反应通式AB=A+B与定向排列(orientation arrange)斜率1/Vmax一些抗体酶可有选择地使病毒外壳蛋白的肽键裂解，从而防止病毒与靶细胞结合纵轴截

31、距为Vmax，斜率为-Km如5核苷酸磷酸水解酶，其底物是5核苷酸，水解反应发生在磷酸酯键上意义：K3=Vmax/E动力学特点：Vmax不变，表观Km增大。温度升高，酶促反应速度升高；意义 可用来比较每单位酶的催化能力,反映酶的工作效率。或称活性部位(active site)，指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。与对氨基苯甲酸竞争二氢蝶酸合成酶(LDH1 LDH5)2）每大类中，按底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类酶与一般催化剂的共同点（一）酶蛋白合成的诱导和阻遏二、酶促反应的机理二、酶促反应的机理（一）酶（一）酶-底物复合物的形成

32、与诱导契合假说底物复合物的形成与诱导契合假说*诱导契合假说诱导契合假说(induced-fit hypothesis)(induced-fit hypothesis)酶底物复合物酶底物复合物 E+S E+P ES ES 酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶程称为酶-底物结合的诱导契合假说底物结合的诱导契合假说目目 录录羧肽酶的诱导契合模式羧肽酶的诱导契合模式 底物底物目目 录录（二）酶促反应的作用效应（二）酶促反应的作用效应 1.1.邻近效应邻近效应(proximity

33、effect)(proximity effect)与定向排列与定向排列(orientation arrange)(orientation arrange)2.2.多元催化多元催化(multielement(multielement catalysis)catalysis)3.3.表面效应表面效应(surface effect)(surface effect)第四节第四节酶促反应动力学酶促反应动力学Kinetics of Kinetics of EnzymeCatalyzed EnzymeCatalyzed Reaction Reaction q概念概念 研究各种因素对研究各种因素对酶促反应速度

34、酶促反应速度的影响，并的影响，并加以定量的阐述。加以定量的阐述。q影响因素包括有影响因素包括有 底物浓度、酶浓度、底物浓度、酶浓度、pHpH、温度、抑制剂、温度、抑制剂、激活剂等。激活剂等。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。一、底物浓度对反应速度的影响一、底物浓度对反应速度的影响v单底物、单产物反应单底物、单产物反应v酶促反应速度一般在规定的反应条件下，酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用用单位时间内底物的消耗量或产物的生成量来单位时间内底物的消耗量或产物的生成量来表示表示v 在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。当底

35、物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。一级反应。目目 录录随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。混合级反应。目目 录录当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应应为零级反应目目 录录（一）米曼氏方程式（一）米曼氏方程式中间产物中间产物酶促反应模式酶促反应模式中间产物学说中间产物学说E+S k1k2k3ESE+P中间产物存在的证明中间产物存在的证明 H2O2 +H2O2 +过氧化物酶

36、过氧化物酶 （H2O2 H2O2 过氧化物酶）过氧化物酶）（褐色）（褐色）（红色）（红色）（H2O2 H2O2 过氧化物酶）过氧化物酶）+AH2 +AH2 过氧化物酶过氧化物酶+A+2H2O+A+2H2O （红色）（红色）(褐色）褐色）S S：底物浓度：底物浓度 V V：不同：不同SS时的反应速度时的反应速度 V Vmaxmax：最大反应速度：最大反应速度(maximum velocity)(maximum velocity)m m：米氏常数：米氏常数(Michaelis constant)(Michaelis constant)V VmaxmaxS S K Km m+S +S 自我剪切酶(s

37、elf-cleavage rebozyme)催化一个化合物裂解为2个较小的化合物及其逆反应的一类酶，其反应通式AB=A+B如葡萄糖氧化酶一些代谢物可与某些酶分子活性中心外的某部分可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。张力作用(distortion or strain)这种抑制作用称为竞争性抑制作用。系统命名底物+发生水解作用的化学键位置+水解酶6、连接酶或合成酶（6）ABATPABADPPi金属激活酶(metal-activated enzyme)（3）水解酶类（Hydrolases）酶的结构 活性中心以外的必需基团无催化化剂时需要的活化能18 kcal/mo

38、l意义 可用来比较每单位酶的催化能力,反映酶的工作效率。（二）Km与Vmax的意义酶与一般催化剂的共同点H2O2 2H2O +O2无催化化剂时需要的活化能18 kcal/mol磺胺类药物的抑菌机制斜率1/Vmax温度对淀粉酶活性的影响在林贝氏方程基础上，两边同乘SK Km mS S KKm m值等于酶促反应速度为最大反应速度一半值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是时的底物浓度，单位是mol/Lmol/L。2 2K Km m+S+S V Vmaxmax V VmaxmaxSS（二）（二）K Km m与与V Vmaxmax的意义的意义指导代谢方向指导代谢方向限速步骤限速步骤Km

39、Km最大的反应最大的反应可逆反应方向、多条反应途径可逆反应方向、多条反应途径KmKm小的反应小的反应趋势强。趋势强。了解酶底物在体内的浓度水平了解酶底物在体内的浓度水平 一般与一般与KmKm值相当。值相当。Vmax Vmax 定义定义VmaxVmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。酶浓度成正比。Vmax=K3 E Vmax=K3 E意义：意义：K K3 3=V=Vmaxmax/E/E 如果酶的总浓度已知，可从如果酶的总浓度已知，可从V Vmaxmax计算酶的转换数计算酶的转换数(turnover number)(turnover number)

40、，即动力学常数，即动力学常数 K K3 3。米曼氏方程式推导的假设之一：米曼氏方程式推导的假设之一：E E与与S S形成形成ESES复合物的反复合物的反应是快速平衡反应，而应是快速平衡反应，而ESES分解为分解为E E及及P P的反应为慢反应，反的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即应速度取决于慢反应即 V Vk k3 3ESES。（三）（三）m值与值与max值的测定值的测定1.1.双倒数作图法双倒数作图法(double reciprocal plot)(double reciprocal plot)，又，又称为林贝氏称为林贝氏(Lineweaver Burk)(Lineweaver Burk

41、)作图法作图法（林贝氏方程）（林贝氏方程）-1/Km 引入法借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。意义 可用来比较每单位酶的催化能力,反映酶的工作效率。抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度；系统命名底物+发生水解作用的化学键位置+水解酶(2）根据其催化反应的类型分为剪切酶（只剪）、剪接酶（剪+连接）和多功能酶只能催化热力学允许的化学反应；4）每一小类包含若干个具体的酶氧化还原酶类 Oxidoreductases优选蛋白质与酶工程酶学基本理论有的酶原可以视为酶的储存形式。温

42、度升高，酶促反应速度升高；金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失（如羧基肽酶Zn、黄嘌呤氧化酶Mo等）。催化一个化合物裂解为2个较小的化合物及其逆反应的一类酶，其反应通式AB=A+B限速步骤Km最大的反应酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。（1）RNA剪切酶（4）裂合酶类（Lyases）05 mmol/L、0.2.Hanes2.Hanes作图法作图法-Km 3.Eadie-Hofstee作图法纵轴截距为Vmax，斜率为-Km 4.四种作图法的区别四种作图法的区别二、酶浓度对反应速度的影响二、酶浓度对反应速度的影响当当SSEE，酶可被，酶可被底物饱和的情况下，

43、反底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。应速度与酶浓度成正比。关系式为关系式为V=K3 EV=K3 E0 V E 当当SESE时，时，V Vmax max=k=k3 3 E E 酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响 q双重影响双重影响 温度升高，酶促反应速度温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的质，温度升高，可引起酶的变性，使反应速度降低变性，使反应速度降低 。三、温度对反应速度的影响三、温度对反应速度的影响q最适温度最适温度 (optimum(optimum temperature)temperature)：酶促反应速度最快

44、时的环酶促反应速度最快时的环境温度。境温度。*低温的应用低温的应用酶酶活活性性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 温度 C 温度对淀粉酶活性的影响 四、四、pHpH对反应速度的影响对反应速度的影响q最适最适pH pH (optimum pH)(optimum pH)酶催化活性最大酶催化活性最大时的环境时的环境pHpH。0酶酶活活性性 pH pHpH对某些酶活性的影响对某些酶活性的影响 246810五、抑制剂对反应速度的影响五、抑制剂对反应速度的影响酶的抑制剂酶的抑制剂(inhibitor)(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白凡能使酶的催化活性下

45、降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。变性的物质称为酶的抑制剂。区别于酶的变性区别于酶的变性 抑制剂对酶有一定选择性抑制剂对酶有一定选择性 引起变性的因素对酶没有选择性引起变性的因素对酶没有选择性 抑制作用的类型抑制作用的类型不可逆性抑制不可逆性抑制 (irreversible inhibition)(irreversible inhibition)可逆性抑制可逆性抑制 (reversible inhibition)(reversible inhibition)：竞争性抑制竞争性抑制 (competitive inhibition)(competitive inhibition)非竞争性抑

46、制非竞争性抑制 (non-competitive inhibition)(non-competitive inhibition)反竞争性抑制反竞争性抑制 (uncompetitive inhibition)(uncompetitive inhibition)(一一)*概念概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心或活性抑制剂通常以共价键与酶活性中心或活性中心以外的必需基团相结合，使酶失活。中心以外的必需基团相结合，使酶失活。有机磷中毒有机磷中毒 巯基酶抑制剂巯基酶抑制剂？*概念概念抑制剂通常以非共价键与酶或酶底物复合物可逆抑制剂通常以非共价键与酶或酶底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可

47、用性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。透析、超滤等方法除去。竞争性抑制竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制 .竞争性抑制作用竞争性抑制作用反应模式反应模式定义定义 抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。*特点特点抑制程度取决于抑制程度取决于抑制剂与酶的相抑制剂与酶的相对亲和力及底物对亲和力及底物浓度；浓度；I I与与S S结构类似，结构

48、类似，竞争酶的活性竞争酶的活性中心；中心；动力学特点：动力学特点：V Vmaxmax不变，表观不变，表观K Km m增大。增大。抑制剂抑制剂 无抑制剂无抑制剂 1/V 1/S VSmaxVIK(1)SmKiiKI111m(1)VVKSVmaxmax*举例举例 丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶琥珀酸琥珀酸琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶FADFADFADHFADH2 2延胡索酸延胡索酸 磺胺类药物的抑菌机制磺胺类药物的抑菌机制与与对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸竞争竞争二氢蝶酸合成酶二氢蝶酸合成酶二氢蝶呤啶二氢蝶呤啶 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸二氢蝶酸二氢蝶酸合成酶合成酶

49、二氢叶酸二氢叶酸COOH H2N SO2NHR H2N 磺磺 胺胺 类类 药药 物物2.2.非竞争性抑制非竞争性抑制*特点特点抑制剂与酶活性抑制剂与酶活性中心外的必需基中心外的必需基团结合，底物与团结合，底物与抑制剂之间无竞抑制剂之间无竞争关系；争关系；抑制程度取决于抑制程度取决于抑制剂的浓度；抑制剂的浓度；动力学特点：动力学特点：V Vm a xm a x降低，表降低，表观观K Km m不变。不变。抑制剂抑制剂 1/V 1/V 1/S 1/S 无抑制剂无抑制剂 iiKI11I1m(1)(1)VVKSVKmaxmax.反竞争性抑制反竞争性抑制*特点：特点：抑制剂只与抑制剂只与酶底物复酶底物复合

50、物结合；合物结合；抑制程度取抑制程度取决与抑制剂决与抑制剂的浓度及底的浓度及底物的浓度；物的浓度；动力学特点：动力学特点：V Vmaxmax降低，表降低，表观观K Km m降低。降低。抑制剂抑制剂 1/V 1/V 1/S 1/S 无抑制剂无抑制剂 例如氰化物对芳香硫酸酯酶的抑制作用各种可逆性抑制作用的比较各种可逆性抑制作用的比较 动力学参数动力学参数表观表观Km Km增大增大不变不变减小减小最大速度最大速度Vmax不变不变降低降低降低降低林林-贝氏作图贝氏作图斜率斜率Km/Vmax增大增大增大增大不变不变纵轴截距纵轴截距1/Vmax不变不变增大增大增大增大横轴截距横轴截距-1/Km增大增大不变