酶分子的修饰课件.ppt

1、精选版课件ppt1精选版课件ppt2 酶分子的化学修饰，就是在酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对酶进行分子水平上对酶进行改造，以达到改构和改性的目的改造，以达到改构和改性的目的.即在体外将酶分子通过人工的方法与一些即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基化学基团团(物质物质)，特别是具有，特别是具有生物相容性生物相容性的物质，进行的物质，进行共共价连接价连接，从而，从而改变酶的结构和性质改变酶的结构和性质。这种物质被称。这种物质被称为修饰试剂。为修饰试剂。精选版课件ppt3 酶具有酶具有稳定性差稳定性差，活力不够高，以及，活力不够高，以及可可能具有抗原性能具有抗原性等弱点使酶的应用受限制。

2、因等弱点使酶的应用受限制。因此人们希望通过酶分子修饰来改善这些弱点，此人们希望通过酶分子修饰来改善这些弱点，来提高酶的使用范围和应用价值。来提高酶的使用范围和应用价值。为什么要进行酶分子修饰？为什么要进行酶分子修饰？精选版课件ppt4提高酶的提高酶的活力活力 activityactivity增强酶的增强酶的稳定性稳定性 stabilitystability降低或消除酶的降低或消除酶的抗原性抗原性 immunological immunological propertyproperty研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对金属离子

3、和各种物理因素对酶分子空间构象酶分子空间构象的的影响影响 structure structure 回本章目录精选版课件ppt5第一节第一节 酶分子的修饰方法酶分子的修饰方法酶分子的修饰：酶分子的修饰：酶的表面修饰酶的表面修饰 酶的内部修饰酶的内部修饰.1.1 酶的表面修饰酶的表面修饰1.1.1 化学固定化化学固定化 一般是通过酶表面的一般是通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基酸性或碱性氨基酸残基将酶将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的环境的改共价连接到惰性载体上，由于酶所处的环境的改变，会使酶的性质，特别是动力学性质发生改变，会使酶的性质，特别是动力学性质发生改变变精选版课件ppt6固定在电荷载

4、体上，由于介质中的质子靠近载体，固定在电荷载体上，由于介质中的质子靠近载体，并与载体上的电荷发生作用，使酶的最适并与载体上的电荷发生作用，使酶的最适pH向向碱性碱性(阴离子载体阴离子载体)或向酸性或向酸性(阳离子载体阳离子载体)方向偏移。方向偏移。因此在生产工艺中需几个酶协同作用时，因此在生产工艺中需几个酶协同作用时，由于固由于固定化可使不同酶的最适定化可使不同酶的最适pH彼此靠近。彼此靠近。如将糖化酶固定在阴离子载体上，其最适如将糖化酶固定在阴离子载体上，其最适pH由由4.5升到升到6.5，与，与D-木糖异构酶的最适木糖异构酶的最适PH(7.5)靠近，靠近，这样可简化高果糖浆生产工艺。这样可

5、简化高果糖浆生产工艺。精选版课件ppt71.1.2 酶的小分子修饰作用酶的小分子修饰作用 用小分子修饰剂共价修饰酶，可使酶稳定性提用小分子修饰剂共价修饰酶，可使酶稳定性提高。这主要是利用一些适宜的小分子修饰剂来修饰高。这主要是利用一些适宜的小分子修饰剂来修饰酶表面的一些基团：酶表面的一些基团：COOH、一、一NH3+、SH、OH、咪唑基、咪唑基等。等。如将如将胰凝乳蛋白酶表面的胰凝乳蛋白酶表面的氨基氨基修饰成亲水性更修饰成亲水性更强的强的基团基团，酶的热稳定性在，酶的热稳定性在60时提高了时提高了1000倍，倍，温度更高时稳定化效应更强烈。这个稳定的酶能经温度更高时稳定化效应更强烈。这个稳定的

6、酶能经受灭菌的极端条件而不失活，因而有利于医疗用酶受灭菌的极端条件而不失活，因而有利于医疗用酶马肝醇脱氢酶马肝醇脱氢酶(HLADH)的的Lys乙基化、糖基化和乙基化、糖基化和甲基化甲基化都能增加其活力。其中甲基化使酶活力增加都能增加其活力。其中甲基化使酶活力增加最大，同时酶的稳定性也提高了。最大，同时酶的稳定性也提高了。精选版课件ppt81.1.3 酶的大分子修饰酶的大分子修饰分为大分子分为大分子非共价修饰非共价修饰和和大分子共价修饰两类大分子共价修饰两类 （1）大分子的非共价修饰）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如互作

7、用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、聚乙二醇、右旋糖苷右旋糖苷等它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能等它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。一些添加物，如一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。有些来自嗜热菌能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。有些来自嗜热菌的酶具有较高稳定性，其原因正是由于保护性大分子的酶具有较高稳定性，其原因正是由于保护性大分子(如如肽和聚胺肽和聚胺)发挥作用的结果。发挥作用的结果。另一类添加物就是

8、另一类添加物就是蛋白质蛋白质。蛋白质分子之间相互作用。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，时，其表面区域内排除了水分子，降低了介电常数降低了介电常数，因而，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加。因此酶的多聚体增加了相互作用力，其稳定性也就增加。因此酶的多聚体或酶聚合体的活力和稳定性比单体高或酶聚合体的活力和稳定性比单体高精选版课件ppt9（2）大分子共价修饰）大分子共价修饰 利用利用水溶性水溶性大分子与酶大分子与酶结合结合使酶的使酶的空间结构空间结构发生发生某些某些精细改变精细改变，从而改变酶的特性与功能的方法，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法，简称大分子结合

9、法。称为大分子结合修饰法，简称大分子结合法。用可溶性大分子，如用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、聚乙二醇、右旋糖苷、葡萄葡萄糖、环状糊精、肝素、蔗糖聚合物、羧甲基纤维糖、环状糊精、肝素、蔗糖聚合物、羧甲基纤维素、聚氨基酸素、聚氨基酸等，通过共价键连接于酶分子的表等，通过共价键连接于酶分子的表面、形成一层覆盖层。面、形成一层覆盖层。这些大分子修饰剂在使用前一般需这些大分子修饰剂在使用前一般需经过活化经过活化，然，然后在后在一定条件一定条件下与酶分子中的下与酶分子中的侧链基团以共价键侧链基团以共价键结合对酶分子进行修饰。结合对酶分子进行修饰。精选版课件ppt10大分子共价修饰后的这种大分子共价

10、修饰后的这种可溶性酶可溶性酶有许多有用的有许多有用的性质：如用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶性质：如用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(SOD)，不仅降低或不仅降低或消除酶的抗原性消除酶的抗原性，且，且提高了稳定性提高了稳定性，抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期，从抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期，从而提高了酶药效。而提高了酶药效。日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶上所得产物溶于上所得产物溶于有机溶剂有机溶剂，在有机溶剂存在下能，在有机溶剂存在下能够有效地起作用。嗜热菌蛋白酶在水介质中通常够有效地起作用。嗜热菌蛋白酶在水介质中通常催化肽链裂解，但用

11、聚乙二醇共价修饰后，其催催化肽链裂解，但用聚乙二醇共价修饰后，其催化活性显著改变，在有机溶剂中化活性显著改变，在有机溶剂中催化肽键合成催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。已用于制造合成甜味剂。精选版课件ppt11 右旋糖酐经高碘酸活化后，酶上氨基共价结合形成右旋糖酐经高碘酸活化后，酶上氨基共价结合形成修饰酶。修饰酶。右旋糖酐的活化：右旋糖酐的活化：大分子结合修饰后的酶，呈现出来的催化特性：大分子结合修饰后的酶，呈现出来的催化特性：（1 1）通过修饰提高酶活力）通过修饰提高酶活力（2 2）通过修饰增加酶的稳定性）通过修饰增加酶的稳定性（3 3）通过修饰降低或消除抗原性）通过修饰降低或消除抗原性精

12、选版课件ppt121.1.5 脂质体包裹脂质体包裹 酶脂质体包埋，能使一些被酶脂质体包埋，能使一些被包埋的包埋的大分子的酶进入大分子的酶进入细胞内细胞内。许多医药酶，如许多医药酶，如SOD、溶菌酶、溶菌酶等，由于分子量大，等，由于分子量大，不易进入细胞内，且在体内半衰期短，产生免疫原不易进入细胞内，且在体内半衰期短，产生免疫原性反应。为此，可通过酶的表面化学修饰来解决，性反应。为此，可通过酶的表面化学修饰来解决，如如SOD用聚乙二醇用聚乙二醇(PEG)修饰，修饰，修饰修饰后其在体内的后其在体内的稳定件及免疫原性都大大改善。稳定件及免疫原性都大大改善。但如何让修饰后的但如何让修饰后的SOD进入细

13、胞内？进入细胞内？可以采用脂质体包裹的方法。可以采用脂质体包裹的方法。精选版课件ppt13 脂质体是天然脂类和或类固醇组成的微球体。脂质体是天然脂类和或类固醇组成的微球体。酶分子可包埋在其内部。它可通过酶分子可包埋在其内部。它可通过与细胞的膜融合与细胞的膜融合或或内吞作用内吞作用而进入细胞内。而进入细胞内。脂质体无毒、易制作，亦被用作基因载体。把脂质体无毒、易制作，亦被用作基因载体。把经过表面修饰的经过表面修饰的SOD包埋在脂质体中便可进入细胞。包埋在脂质体中便可进入细胞。Michelsonn发现，被包装的发现，被包装的SOD进入细胞的能力进入细胞的能力比非脂质体大得多，但包装后的比非脂质体大

14、得多，但包装后的SOD进入胞内能进入胞内能力与力与脂质体成分脂质体成分及及电荷特性电荷特性有关。有关。精选版课件ppt14使用一些能与酶使用一些能与酶非共价非共价地相互作用而又能有效地地相互作用而又能有效地保护保护酶的一些添加物酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。与外部水相连，从而保护酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过能通过调节酶的微环境调节酶的微环境来保护

15、酶的活力。来保护酶的活力。另一类添加物就是另一类添加物就是蛋白质蛋白质。蛋白质分子之间相互作用。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内时，其表面区域内排除了水分子排除了水分子，因而增加了相互作，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。用力，其稳定性也就增加了。非共价修饰非共价修饰精选版课件ppt15用用可溶性大分子可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过通过共价键连接于酶分子的表面共价键连接于酶分子的表面，形成一层，形成一层覆盖层覆盖层。例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降，不仅可以降低或低或消除酶的抗原性消除酶

16、的抗原性，而且，而且提高了抗蛋白酶的能力提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与每分子核糖核酸酶与6.56.5分子的右旋糖酐结合，可以分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的使酶活力提高到原有酶活力的2.252.25倍；倍；每分子胰凝乳蛋白酶与每分子胰凝乳蛋白酶与1111分子右旋糖酐结合，酶活力分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的达到原有酶活力的5.15.1倍倍 共价修饰共价修饰精选版课件ppt16聚乙二醇聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、

17、无残留、无免疫原性，并溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。酶酶 半衰期半衰期相对稳定性相对稳定性 天然天然SODSOD 6 min 6 min 1 1 右旋糖酐右旋糖酐-SOD-SOD 7 h 7 h 70 70 Ficoll(Ficoll(低分子量低分子量)SOD)SOD 14 h 14 h 140 140 Ficoll(Ficoll(高分子量高分子量)SOD)SOD 24 h 24 h 240 240 聚乙二醇聚乙二醇-SOD-S

18、OD 35 h 35 h 350 350此外，还有此外，还有脂质体包裹、反相胶团微囊化脂质体包裹、反相胶团微囊化等等修饰方法修饰方法 精选版课件ppt171.2 酶分子内部的修饰酶分子内部的修饰1.2.1非催化活性基团的修饰非催化活性基团的修饰 用化学试剂与酶蛋白上的用化学试剂与酶蛋白上的非非催化活性基团部位催化活性基团部位的的一一些些氨基酸残基氨基酸残基进行共价连接进行修饰的方法。进行共价连接进行修饰的方法。被修饰的残基可以是被修饰的残基可以是亲核的亲核的(Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His)，也可以是，也可以是亲电的亲电的(Tyr、Trp)还可以是可氧化的还可以是可氧化的(Ty

19、r、Trp、Met)。对这类非催化残基的修饰可改变酶的对这类非催化残基的修饰可改变酶的动力学性质动力学性质，改变酶对，改变酶对特殊底物的束缚能力。特殊底物的束缚能力。精选版课件ppt181.2.2 催化活性基团的修饰催化活性基团的修饰通过通过有目的、选择性有目的、选择性修饰侧链成分来实现修饰侧链成分来实现催化活催化活性基团部位内的性基团部位内的氨基酸的取代，这种将氨基酸侧氨基酸的取代，这种将氨基酸侧链转化为另一种链转化为另一种新的氨基酸新的氨基酸侧链的方法，叫化学侧链的方法，叫化学突变法。突变法。如将枯草杆菌蛋白酶活性部位的如将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转化为残基转化为Cys残基，新产

20、生的巯基蛋白酶对肽或脂没有水解能力，残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或脂没有水解能力，但能水解一些高度活化的底物，如硝基苯脂。这种方但能水解一些高度活化的底物，如硝基苯脂。这种方法由于受到专一试剂、有机化学工业水平的限制，没法由于受到专一试剂、有机化学工业水平的限制，没有有蛋白质工程蛋白质工程技术普遍，但它通过产生非蛋白质氨基技术普遍，但它通过产生非蛋白质氨基酸的能力，可以有力地补充蛋白质工程技术。酸的能力，可以有力地补充蛋白质工程技术。精选版课件ppt191.2 酶分子内部的修饰酶分子内部的修饰1.2.3 酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰 酶蛋白主链修饰主要是靠酶蛋白主链修饰主要是靠酶法酶法对酶蛋白

21、的对酶蛋白的主链主链进进行相关修饰。行相关修饰。如用蛋白酶对如用蛋白酶对ATP酶有限水解，切除其十几个残基后，酶有限水解，切除其十几个残基后，酶活力提高了酶活力提高了5.5倍。该活化酶仍为四聚体，亚单位倍。该活化酶仍为四聚体，亚单位分子量变化不大。这说明天然酶平时处于分子量变化不大。这说明天然酶平时处于非最佳非最佳的催的催化构象状态。化构象状态。精选版课件ppt20把酶分子中的把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子金属离子换成另一种金属离子，使，使酶的酶的特性和功能发生改变特性和功能发生改变的修饰方法，称为金属的修饰方法，称为金属离子置换修饰。离子置换修饰。酶分子中的金属离子取代可以改变酶的专

22、一性、酶分子中的金属离子取代可以改变酶的专一性、稳定性及其抑制作用。稳定性及其抑制作用。-淀粉酶中的淀粉酶中的钙离子钙离子（CaCa2+2+），谷氨酸脱氢酶中的），谷氨酸脱氢酶中的锌离子锌离子(Zn(Zn2+2+)，过氧化氢酶分子中的，过氧化氢酶分子中的铁离子铁离子(Fe(Fe2+2+)，酰基氨基酸，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（酶分子中的锌离子（ZnZn2+2+）,超氧化物歧化酶分子中的超氧化物歧化酶分子中的铜铜、锌离子锌离子(Cu(Cu2+2+,Zn,Zn2+2+)精选版课件ppt21 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重

23、新加入原有的金属离子，丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的可以使有的可以使酶的酶的活力提高或者增加酶的稳定性活力提高或者增加酶的稳定性。精选版课件ppt22p酶的分离纯化：酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经分离纯化，除首先将欲进行修饰的酶经分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。去杂质，获得具有一定纯度的酶液。b.b.除去原有的金属离子：除

24、去原有的金属离子：在纯化的酶液中加入一定量金属在纯化的酶液中加入一定量金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）等，使酶分子中的金）等，使酶分子中的金属离子与属离子与EDTAEDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将层析等方法，将EDTA-EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时酶金属螯合物从酶液中除去。此时酶往往成为无活性状态。往往成为无活性状态。c.c.加入置换离子：加入置换离子：去离子的酶液中加入一定量另一种金属去离子的酶液中加入一定量另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置离子，酶蛋白与新加

25、入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可得到经过金属离子置换后的酶。换离子，就可得到经过金属离子置换后的酶。精选版课件ppt23p 金属离子置换修饰只适用于那些在分子金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中结构中本来含有金属离子本来含有金属离子的酶。的酶。p 用于金属离子置换修饰的金属离子，一用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是般都是二价金属离子二价金属离子。精选版课件ppt24 金属酶的金属取代举例金属酶的金属取代举例 如酰化氨基酸水解酶活性部位中的如酰化氨基酸水解酶活性部位中的Zn2+被被Co2+取取代后的酶，其代后的酶，其最适最适pH和底物专一性和底物专一性都有改变：都有改变：Zn

26、酶对乙酰酶对乙酰Ala的最适的最适pH8.5而而Co酶为酶为7.0；钴酶；钴酶对对N氯乙酰氯乙酰Ala等等6种底物的水解活力增加，而种底物的水解活力增加，而对对N氯乙酰氯乙酰Met等三种底物的活力降低。在使用等三种底物的活力降低。在使用时时对不同底物可以选用不同的酶对不同底物可以选用不同的酶Zn/Co酶。酶。FeSOD中的中的Fe被被Mn取代后，取代后，酶的稳定性和抑酶的稳定性和抑制作用制作用发生显著改变：发生显著改变：Mn-SOD对对H2O2稳定性显稳定性显著增加而对著增加而对NaN3的抑制作用显著降低。的抑制作用显著降低。精选版课件ppt25第二节第二节 酶侧链基团的修饰酶侧链基团的修饰酶

27、化学修饰的目的，主要是酶化学修饰的目的，主要是提高酶的稳定提高酶的稳定性性和和消除消除作为外源物质在体内的作为外源物质在体内的抗原性抗原性。要达到这些目的，在要达到这些目的，在修饰原理、修饰剂和修饰原理、修饰剂和反应条件反应条件的选择以及对酶学性质的了解等的选择以及对酶学性质的了解等方面，都必须有足够的了解。方面，都必须有足够的了解。精选版课件ppt262.1被修饰酶的性质被修饰酶的性质 在开展酶的修饰工作前对被修饰酶的酶学性质必在开展酶的修饰工作前对被修饰酶的酶学性质必须有一个较为全面的了解。须有一个较为全面的了解。2.1.1 酶的稳定性酶的稳定性 被修饰酶对热、对酸碱的稳定性，作用温度及被

28、修饰酶对热、对酸碱的稳定性，作用温度及PH范范围以及最适温度、最适围以及最适温度、最适PH的情况等应有所了解。的情况等应有所了解。2.1.2 酶活性中心的状况酶活性中心的状况 酶催化活性主要依赖于酶的活性中心。因此对酶活性酶催化活性主要依赖于酶的活性中心。因此对酶活性中心的组成，如：酶蛋白中哪些中心的组成，如：酶蛋白中哪些氨基酸残基氨基酸残基或其或其侧链侧链基团基团参与了酶活性中心是否需要辅因子，此外还需参与了酶活性中心是否需要辅因子，此外还需了解酶分子形状、寡聚酶的亚基组成等。了解酶分子形状、寡聚酶的亚基组成等。精选版课件ppt272.1.3 酶侧链基团的性质及反应性酶侧链基团的性质及反应性

29、 选择性修饰试剂必须要与多肽链中某一种特定的选择性修饰试剂必须要与多肽链中某一种特定的氨基酸残基侧链基团氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密发生化学反应，并形成紧密共价结合。共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧链基团有：酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧链基团有：巯基、氨基、羧基、巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基咪唑基、羟基、酚基、酚基、胍基、胍基、吲哚基、硫醚基及吲哚基、硫醚基及二硫键二硫键等。等。精选版课件ppt282.1.3 酶侧链基团的性质及反应性酶侧链基团的性质及反应性 （1）对巯基的化学修饰）对巯基的化学修饰 巯基是蛋白质的一类巯基是蛋白质的一类重要的亲核基团，因此常被用来

30、修饰。修饰方法重要的亲核基团，因此常被用来修饰。修饰方法大体上有如下几种：大体上有如下几种：烷基化试剂。烷基化试剂。烷基试剂中用得最多的是碘乙烷基试剂中用得最多的是碘乙酸、巯基乙醇、谷胱甘肽酸、巯基乙醇、谷胱甘肽(GSH)、碘乙酰胺碘乙酰胺。ESH+ICH2COOH ESCH2COOH 汞试剂。汞试剂。这类试剂如这类试剂如HgCl2、对氯汞苯甲酸、对氯汞苯甲酸(pCMB)和和2氯汞硝基苯酚等。氯汞硝基苯酚等。精选版课件ppt29Ellman试剂。试剂。5，5二硫二硫-二二-（2硝基苯甲酸硝基苯甲酸)是目前最常用的巯基修饰试剂，又称是目前最常用的巯基修饰试剂，又称Ellman试剂试剂，还可用来测

31、定酶蛋白巯基含量。还可用来测定酶蛋白巯基含量。精选版课件ppt30(2)氨基的化学修饰氨基的化学修饰乙酸酐修饰乙酸酐修饰 2，4，6三硝基苯磺酸修饰。三硝基苯磺酸修饰。精选版课件ppt312，4二硝基氟苯修饰二硝基氟苯修饰(Sanger反应反应)Sanger反应的作用？反应的作用？氨基的烷基化。氨基的烷基化。这类试剂包括卤代乙酸、这类试剂包括卤代乙酸、芳香卤和芳香磺酸等。芳香卤和芳香磺酸等。精选版课件ppt32丹磺酰氯丹磺酰氯(DNS)修饰。修饰。苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯(PITC)修饰修饰(即即Edman反应反应)精选版课件ppt33(3)羧基的化学修饰羧基的化学修饰(4)咪唑基的修饰反应咪

32、唑基的修饰反应。(5)吲哚基的化学修饰吲哚基的化学修饰 甲硫氨酸侧链基团的化学修饰甲硫氨酸侧链基团的化学修饰 胍基的化学修饰胍基的化学修饰精选版课件ppt34(8)二硫键的化学修饰二硫键的化学修饰2巯基乙醇修饰巯基乙醇修饰 精选版课件ppt35二硫苏糖醇二硫苏糖醇(DTT)修饰修饰精选版课件ppt36（9）酚基的化学修饰）酚基的化学修饰 N乙酰咪唑修饰乙酰咪唑修饰 碘化反应碘化反应 精选版课件ppt37对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。做好基础课做好

33、基础课（1 1）酶的稳定性）酶的稳定性 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pHpH、抑制剂等。、抑制剂等。（2 2）酶活性中心的状况）酶活性中心的状况 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。亚基数等。精选版课件ppt38修饰反应尽可能在修饰反应尽可能在酶稳定条件下酶稳定条件下进行，并尽量不破进行，并尽量不破坏坏酶活性功能的必需基团酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的，使修饰率高，同时酶的活力回收高。活力回收高。（1 1）pHpH与离子强度与离子强度 pHpH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。

34、由决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。于它们的解离状态不同，反应性能也不同。（2 2）修饰反应的温度与时间）修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。一性的修饰反应。（3 3）反应体系中酶与修饰剂的比例）反应体系中酶与修饰剂的比例 回本章目录精选版课件ppt39因此谨慎因此谨慎选择修饰反应条件选择修饰反应条件是必须的。当然，这是必须的。当然，这些修饰条件随着些修饰条件随着修饰反应修饰反应的不同而不同，因此，的不同而不同，因此，需要经过需要经过大量实验摸索大量实验摸索才能确定

35、才能确定.2.2.1 pH与离子强度与离子强度 pH决定了酶蛋白分子中决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态反应基团的解离状态。由。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。于它们的解离状态不同，反应性能也不同。例如在例如在pH25时，碘乙酸可以时，碘乙酸可以选择性选择性地与地与Met的侧链基团的侧链基团发生修饰反应，而在此发生修饰反应，而在此pH条件下，可被碘乙酸修饰的基团，条件下，可被碘乙酸修饰的基团，如如巯基、咪唑基和氨基巯基、咪唑基和氨基等，都处于等，都处于不反应不反应的状态。的状态。另一方面，有些修饰试剂在另一方面，有些修饰试剂在不同不同pH条件条件下与同一下与同一基团可基团可形成不同产

36、物形成不同产物。精选版课件ppt40 2.2.2 修饰反应的温度与时间修饰反应的温度与时间 严格控制严格控制温度和时间温度和时间可以减少以至可以减少以至消除一些非专一消除一些非专一性的修饰性的修饰反应。反应。如用聚乳糖作修饰剂表面修饰酶（还原剂为氢硼化氰，如用聚乳糖作修饰剂表面修饰酶（还原剂为氢硼化氰，BH3CN）时在）时在8时时10d内几乎无反应而当温度从内几乎无反应而当温度从25上升上升到到37时反应速度加快了时反应速度加快了3倍，而且随倍，而且随pH的升高而加快。的升高而加快。用用甲酸甲酸氧化酶蛋白的反应，在低温氧化酶蛋白的反应，在低温(约约10)下修饰反应仅下修饰反应仅限于限于Cys、

37、胱氨酸和、胱氨酸和Met残基上，而在残基上，而在较高温度较高温度下，甲酸可下，甲酸可以与以与Trp、Tyr、Ser、Scr以及以及Thr残基发生反应。残基发生反应。2.2.3 反应体系中酶与修饰剂的比例反应体系中酶与修饰剂的比例 用聚乙二醇用聚乙二醇(PEG)修饰酶时，活化修饰酶时，活化PEG的多少能控制酶分子的多少能控制酶分子的修饰程度。的修饰程度。精选版课件ppt412.3 酶蛋白酶蛋白修饰反应修饰反应的的主要类型主要类型 化学修饰剂与酶蛋白反应的类型主要有如下几种：化学修饰剂与酶蛋白反应的类型主要有如下几种：2.3.1 酯化酯化及相关反应及相关反应 酯化及相关反应，主要的修饰试剂包括酯化

38、及相关反应，主要的修饰试剂包括乙酰眯唑、乙酰眯唑、二异丙基氟磷酸二异丙基氟磷酸(DFPA)、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯、酸乙酯、O甲基异脲甲基异脲。在室温在室温(2025)、pH4.59.0条件下，主要与酶蛋白中的条件下，主要与酶蛋白中的氨基、羟基、氨基、羟基、酚基及巯基酚基及巯基等侧链基团发生酰基化反应：等侧链基团发生酰基化反应：精选版课件ppt42精选版课件ppt432.3.2 烷基化烷基化反应反应 这类修饰剂主要有这类修饰剂主要有2，4二硝基氟苯、碘乙酸、二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰碘乙酰胺、碘甲烷、苯甲酰卤代物等，通常胺、碘甲烷、苯甲酰卤代物等，通常带有一个活泼

39、的负带有一个活泼的负电性的卤素原子电性的卤素原子，使，使烷基带有部分正电烷基带有部分正电性，导致性，导致酶蛋白酶蛋白亲核基团烷基化亲核基团烷基化。常被修饰的基团有。常被修饰的基团有氨基、巯基、羧基、氨基、巯基、羧基、甲硫基、咪唑基甲硫基、咪唑基等。等。精选版课件ppt442.3.3 氧化还原反应氧化还原反应 氧化剂氧化剂有有H2O2、N溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺等；另外一类是光等；另外一类是光氧化试剂。它们都具有氧化性，能将侧链基团氧化。受氧化试剂。它们都具有氧化性，能将侧链基团氧化。受氧化的侧链基团有氧化的侧链基团有巯基、甲硫基、吲哚基和酚基巯基、甲硫基、吲哚基和酚基等。等。还原剂还原剂有

40、有2巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇(DTT)等。等。它们主要作用于它们主要作用于二硫键二硫键。连四硫酸钠连四硫酸钠、连四硫酸钾作为氧化剂作用温和，同时，、连四硫酸钾作为氧化剂作用温和，同时，在修饰反应中用作在修饰反应中用作巯基保护剂巯基保护剂。例如：。例如：精选版课件ppt452.3.4 芳香环取代反应芳香环取代反应四硝基甲烷四硝基甲烷(TetranitroMethane，TNM)反应反应：由于蛋由于蛋白质中氨基酸残基上的酚羟基在白质中氨基酸残基上的酚羟基在3和和5位上容易发生亲电取代位上容易发生亲电取代的碘化和硝代反应，其中四硝基甲烷是这类修饰剂中的典型的碘化和

41、硝代反应，其中四硝基甲烷是这类修饰剂中的典型例子例子四硝基甲烷四硝基甲烷作用于作用于Tyr残基的酚羟基残基的酚羟基后，形成后，形成3硝基硝基酪氨酸衍生物。其产物具有特殊光谱酪氨酸衍生物。其产物具有特殊光谱。精选版课件ppt462.3.5 溴化氰溴化氰BrCN)裂解反应裂解反应 BrCN裂解裂解Met反应可在自发诱导重排条件下导致肽反应可在自发诱导重排条件下导致肽键断裂：键断裂：精选版课件ppt47第三节第三节 酶蛋白肽链的修饰酶蛋白肽链的修饰酶蛋白肽链的修饰包括酶蛋白肽链的修饰包括对对酶蛋白肽链的大分子酶蛋白肽链的大分子修饰反应，耍注意的问修饰反应，耍注意的问题是题是修饰剂修饰剂分子量大小、链

42、的长度。一般要求分子量大小、链的长度。一般要求修饰剂具有修饰剂具有较大的分子量、良好的生物相容性较大的分子量、良好的生物相容性和水溶性。这样，经修饰的酶，和水溶性。这样，经修饰的酶，其半衰期较长，其半衰期较长，活力回收较高活力回收较高。下面将介绍。下面将介绍些主要的些主要的修饰反修饰反应和应和修饰剂。修饰剂。精选版课件ppt48利用利用酶分子主链的切断和连接酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。能的方法。酶蛋白主链修饰之一主要是靠酶蛋白主链修饰之一主要是靠酶切酶切/酶原

43、激活法酶原激活法。a a、胃蛋白酶原的激活、胃蛋白酶原的激活 HCl胃胃蛋蛋白白酶酶原原pH1.52（从从N N端端失失去去4 44 4个个氨氨基基酸酸残残基基）自自身身激激活活胃胃蛋蛋白白酶酶精选版课件ppt49精选版课件ppt50b b、胰蛋白酶原（、胰蛋白酶原（trypsinogentrypsinogen）的激活）的激活 精选版课件ppt51精选版课件ppt52c c、胰凝乳蛋白酶原（、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogenchymotrypsinogen）的激活）的激活 精选版课件ppt53 肽链有限水解修饰酶蛋白主链修饰 酶切/酶原激活法 胰凝乳蛋白酶原（chymotryp

44、sinogen）的激活精选版课件ppt543.1 聚乙二醇及其修饰反应聚乙二醇及其修饰反应聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）具有良好的）具有良好的生物相容性和水溶性生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的消除酶的抗原性抗原性使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。它被广泛用于酶的修饰。被修饰的酶分子被盖上一层疏松的亲水外壳，导致流被修饰的酶分子被盖上一层疏松的亲水外壳，导致流体动力学发生改变，从而产生了许多有用的性质，比体动力学发生改变，从而产生了许多有用的性质，比如：修饰酶能在

45、如：修饰酶能在广泛的广泛的pH范围溶解范围溶解；不被离子交换剂；不被离子交换剂吸附；吸附；电泳迁移率下降电泳迁移率下降；沉降速度较天然酶慢等。；沉降速度较天然酶慢等。聚乙二醇用作修饰剂时应注意下面几个问题：聚乙二醇用作修饰剂时应注意下面几个问题：精选版课件ppt55(1)PEG分子量为分子量为750一一5000的修饰效果较好，用的修饰效果较好，用甲甲氧基氧基PEG效果更好。效果更好。(2)修饰效果不仅与其分子量有关，还与修饰效果不仅与其分子量有关，还与所用活化剂所用活化剂及其与酶的配比及其与酶的配比有关。有关。般活化般活化PEG与酶的配比为与酶的配比为1550：1（mol)时，酶活性最多保留时

46、，酶活性最多保留40以上。以上。(3)在多数情况下在多数情况下酶的抗原性酶的抗原性随分子随分子表面自由氨基被表面自由氨基被其修饰而降低其修饰而降低，当，当50以下自由氨基被修饰后，酶以下自由氨基被修饰后，酶基本没有抗原性了，但酶活性也随自由氨基的减少基本没有抗原性了，但酶活性也随自由氨基的减少而下降，因此在选择方法上，应尽量选择对酶活性而下降，因此在选择方法上，应尽量选择对酶活性影响小的修饰方法。影响小的修饰方法。PEG的修饰方法主要有以下几种。的修饰方法主要有以下几种。精选版课件ppt563.1.1 叠氮法叠氮法 此法是将此法是将PEG末端羟基转化为叠氮基，然后与末端羟基转化为叠氮基，然后与

47、酶反应。酶反应。（1)PEG甲氧甲酰甲酯制备，甲氧甲酰甲酯制备，PEG与与氯代醋酸酐氯代醋酸酐及重氮甲烷反应，生成及重氮甲烷反应，生成PEG甲氧甲酰甲酯，甲氧甲酰甲酯，再与再与亚硝酸钠亚硝酸钠反应生成叠氮化合物而反应生成叠氮化合物而活化活化。精选版课件ppt57精选版课件ppt583.1.2 琥珀酸酐法琥珀酸酐法 此法常用此法常用二溴代琥珀酸酐二溴代琥珀酸酐在温和的碱性条件下将在温和的碱性条件下将PEG活化，活化，经减压浓缩制得活化经减压浓缩制得活化PEG，活化活化PEG与酶分子上氨基与酶分子上氨基发生交发生交联反应，而得修饰酶：联反应，而得修饰酶：精选版课件ppt593.1.3三氯均嗪法三氯

48、均嗪法 PEG经经三氯氯均嗪活化三氯氯均嗪活化后，用石油醚抽提或减压蒸馏，制得后，用石油醚抽提或减压蒸馏，制得活化活化PEG，后者与酶交联，制得修饰酶：，后者与酶交联，制得修饰酶：精选版课件ppt603.1.4羰二亚胺法羰二亚胺法 此法是将此法是将PEG用无水三乙胺、对用无水三乙胺、对磺酰氯甲苯处理后，磺酰氯甲苯处理后，再加再加NaN3沸腾回流处理沸腾回流处理36h制得制得PEGN3，PEGN3再再转变成转变成PEGNH2，PEGNH2通过羰二亚胺与酶分子通过羰二亚胺与酶分子上羧基上羧基交联：交联：精选版课件ppt61 3.1.5 重氮重氮 法法 此法是将此法是将PEG末端羟基转化为末端羟基转

49、化为重氮基团重氮基团，再在弱碱性条件，再在弱碱性条件下下与酶分子的酚基、咪唑基与酶分子的酚基、咪唑基等反应，而生成修饰酶。主要等反应，而生成修饰酶。主要反应有以下三种。反应有以下三种。(1)对对硝基苄基氯活化法硝基苄基氯活化法精选版课件ppt62(2)N羧甲氨基苯甲酐活化法羧甲氨基苯甲酐活化法精选版课件ppt63(3)4氟氟2硝基重氮物活化法硝基重氮物活化法精选版课件ppt643.2 糖类的修饰反应糖类的修饰反应3.2.1 右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯的修饰反应右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯的修饰反应 右旋糖苷是由右旋糖苷是由葡萄糖通过葡萄糖通过1，6糖苷键连接而糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的生

50、物相容性和水溶性。成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性。其多糖上的双羟基经活化后可与酶分子上游离氨基相其多糖上的双羟基经活化后可与酶分子上游离氨基相结合、从而修饰了酶。结合、从而修饰了酶。（1）溴化氰法）溴化氰法 （2）高碘酸氧化法）高碘酸氧化法精选版课件ppt653.2 糖类的修饰反应糖类的修饰反应3.2.2糖肽糖肽(Glycopeptide)的修饰反应的修饰反应 糖肽是蛋白酶水解人纤维蛋白或糖肽是蛋白酶水解人纤维蛋白或Y一球蛋白所得到一球蛋白所得到的产物。其分子上具有游离氨基，活化后与酶分的产物。其分子上具有游离氨基，活化后与酶分子上氨基反应，从而可修饰酶。子上氨基反应，从而可修饰