食品中菌落总数和大肠菌群的检测最新版课件.pptx
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1、 目前,食品卫生标准中的微生物指标一般分为目前,食品卫生标准中的微生物指标一般分为菌落菌落总数总数、大肠菌群和致病菌大肠菌群和致病菌三项。三项。细菌计数细菌计数 食品中菌落总数通常指食品中菌落总数通常指1g,1ml或或1cm2面积食品上的面积食品上的细菌数目而言的,而不考虑其种类。细菌数目而言的,而不考虑其种类。由于检测计数方法的不同由于检测计数方法的不同,一般有两种表示方法(一般有两种表示方法(菌落菌落总数总数和和细菌总数细菌总数)。)。食品卫生标准中的微生物指标概论食品卫生标准中的微生物指标概论菌落总数:菌落(Colony)菌落菌落(colony):生长在固生长在固体培养基上,来源于一个体
2、培养基上,来源于一个细胞,肉眼可见的细胞群细胞,肉眼可见的细胞群体。体。一种一种是在严格规定条件下(样品处是在严格规定条件下(样品处理,培养基及其理,培养基及其pH培养温度与时间、计培养温度与时间、计数方法等),使适应这些条件的每一个数方法等),使适应这些条件的每一个活菌细胞必须而且只能生成一个肉眼可活菌细胞必须而且只能生成一个肉眼可见的菌落,经过计数所获得的结果称为见的菌落,经过计数所获得的结果称为该该食品的菌落总数食品的菌落总数。另一种另一种是将食品经过适当处理(溶解和稀是将食品经过适当处理(溶解和稀释)后,在显微镜下对细菌细胞数进行直释)后,在显微镜下对细菌细胞数进行直接计数,这样计数的
3、结果,既包括活菌,接计数,这样计数的结果,既包括活菌,也包括尚未被分解的死菌体,因此称为也包括尚未被分解的死菌体,因此称为细细菌总数菌总数。目前我国食品卫生标准中规定的细菌总目前我国食品卫生标准中规定的细菌总数实际上是指数实际上是指菌落总数菌落总数。即指的是在平板。即指的是在平板计数培养基上长出的菌落数。计数培养基上长出的菌落数。那么检测食品中的菌落总数有何卫生学意义呢?那么检测食品中的菌落总数有何卫生学意义呢?一方面,它可以作为一方面,它可以作为食品被污染程度的标志食品被污染程度的标志。检测食检测食品中的菌落总数,可以了解食品在生产中,从原料加工品中的菌落总数,可以了解食品在生产中,从原料加
4、工到成品包装受外界污染的情况从而反映食品的卫生质到成品包装受外界污染的情况从而反映食品的卫生质量。一般来说、菌落总数越多,说明食品的卫生质量越量。一般来说、菌落总数越多,说明食品的卫生质量越差,遭受病原菌污染的可能性越大。而菌落总数仅少量差,遭受病原菌污染的可能性越大。而菌落总数仅少量存在时,存在时,病原菌污染的可能性就会降低或者几乎不存在病原菌污染的可能性就会降低或者几乎不存在。许多实验结果表明,食品中细菌总数能够反映出许多实验结果表明,食品中细菌总数能够反映出食食品的新鲜程度品的新鲜程度、是否变质以及生产过程的一般卫生状况、是否变质以及生产过程的一般卫生状况等。一般来讲,食品中细菌总数越多
5、,则表明该食品污等。一般来讲,食品中细菌总数越多,则表明该食品污染程度越重,腐败变质的可能性越大。染程度越重,腐败变质的可能性越大。另一方面,它可以用来另一方面,它可以用来预测食品可能存预测食品可能存放的期限程度放的期限程度。如实验表明,菌数为。如实验表明,菌数为105cfu/cm2的鱼,在的鱼,在0下可保持下可保持6d,而,而菌数为菌数为103cfu/cm2时,保存期可达时,保存期可达12d。但上述规则也有例外,有些食品成品但上述规则也有例外,有些食品成品的的菌落总数并不高菌落总数并不高,但由于已有细菌繁殖,但由于已有细菌繁殖并并已产生了毒素已产生了毒素,且毒素性状稳定,仍存,且毒素性状稳定
6、,仍存留于食品中;再有一些食品如酸泡菜和酸留于食品中;再有一些食品如酸泡菜和酸乳等,本身就是通过微生物的作用而制成乳等,本身就是通过微生物的作用而制成的,且是活菌制品。的,且是活菌制品。自然界细菌的类很多,各种细菌的生理特性和所要求的生自然界细菌的类很多,各种细菌的生理特性和所要求的生活条件不尽相同,(如活条件不尽相同,(如嗜温菌嗜温菌30-37,4.83hr;嗜冷菌嗜冷菌 20-25 5-7d或或5-10 10-14d;嗜热菌嗜热菌 45-55 2-3天)如果要检天)如果要检验样品中所有种类,必须用不同培养基及不同培养条件去满足验样品中所有种类,必须用不同培养基及不同培养条件去满足其要求,才
7、能把各种细菌都检验出来,这样工作量将会很大。其要求,才能把各种细菌都检验出来,这样工作量将会很大。我们也知道,自然界尽管细菌种类很多,但我们也知道,自然界尽管细菌种类很多,但异养、中温、异养、中温、好气性细菌占绝大多数好气性细菌占绝大多数。因此,严格讲,用这种方法所得到的。因此,严格讲,用这种方法所得到的结果,主要是一些结果,主要是一些能在能在平板计数琼脂培养基平板计数琼脂培养基上生长的,好氧性上生长的,好氧性嗜温细菌的菌落总数嗜温细菌的菌落总数。但是把它们作为细菌总数已得到公认。但是把它们作为细菌总数已得到公认。这不仅在食品的卫生检验中,而且在一切微生物区系分析中,这不仅在食品的卫生检验中,
8、而且在一切微生物区系分析中,都把它们作为了细菌总数的指标。都把它们作为了细菌总数的指标。注意:是并不是所有食品都规定细菌指标,如酸乳、酸泡注意:是并不是所有食品都规定细菌指标,如酸乳、酸泡菜等。菜等。0 mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。n2 适宜范围菌落数的第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;修改了标准的中英文名称;1、平皿分4部分点数(见图)由于检测计数方法的不同,一般有两种表示方法(菌落总数和细菌总数)。蒸馏水 1 000 mL1、平皿分4部分点数(见图)蒸馏水 1 000 mL1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(Lauryl Sulfate Tryptose,LST)肉汤:充分混匀,
9、制成1:10 的样品匀液。其中包括大肠杆菌、产气杆菌和一些中间类型的细菌,这群细菌能在含有胆盐的培养基上生长。及时将15 mL20 mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。增加了第二法“菌落总数PetrifilmTM测试片法”;2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。2冰箱:25。3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。稀释度 1:100(第一稀释度)1:1000(第二稀释度)因此,菌落总数的测定对评价食品的新鲜因此,菌落总数的测定对评
10、价食品的新鲜度和卫生质量有着一定的卫生指标的作用,度和卫生质量有着一定的卫生指标的作用,但本能单凭此一项指标来判定食品的卫生但本能单凭此一项指标来判定食品的卫生质量,还必须配合大肠菌群和致病菌等检质量,还必须配合大肠菌群和致病菌等检验,才能作出比较全面、准确的评价。验,才能作出比较全面、准确的评价。一、菌落总数测定法一、菌落总数测定法菌落总数菌落总数(aerobic plate count)食品检样经过处理,在一定条件下培养后食品检样经过处理,在一定条件下培养后(如培养如培养基成分、培养温度和时间、基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等、需氧性质等),所得,所得1mL(或或1g)检样中形成菌
11、落的总数。本标准规定的培检样中形成菌落的总数。本标准规定的培养条件下所得结果,只包括一群在平板计数琼脂上生养条件下所得结果,只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。本标准与本标准与GB/T 4789.2-2008相比主要修改如下:相比主要修改如下:修改了标准的中英文名称;修改了标准的中英文名称;(食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定/食品卫生微生物学检验 菌落总数测定)修改了菌落总数计算公式中的解释;修改了菌落总数计算公式中的解释;修改了培养基和试剂;修改了培养基和试剂;删除了第二法删除了第二法 菌落总数菌
12、落总数PetrifilmTM 测试片法。测试片法。(培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂;培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂;菌落总数计算公式进行了修改;菌落总数计算公式进行了修改;增加了第二法增加了第二法“菌落总数菌落总数PetrifilmTM测试片法测试片法”;)-2008 5),用蒸馏水稀释到975 mL,调节pH,再加入0.3 恒温水浴箱:46 1。区别:培养基pH值(4.若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。低于30CFU个菌落的平板记录具体菌落数,大于300的可记录为多不可计。增加了第二法“菌落总数PetrifilmTM测试片法”;5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121高压灭菌
13、15min。N 样品中菌落数;5 之间,必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。如果食品中检出大肠菌群,表明该食品曾受到人或温血动物粪便污染。由于检测计数方法的不同,一般有两种表示方法(菌落总数和细菌总数)。稀释度 1:100(第一稀释度)1:1000(第二稀释度)称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中,121 高压灭菌15 min。由于大肠菌群都是直接或间接来自人或温血动物的粪便,来自粪便以外的极为罕见,所以大肠菌群作为食品卫生标准有以下两方面的意义。1、平皿分4部分点数(见图)例:10-4 样品稀释液1 mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落
14、,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:1006/10104/g(mL)=6.2)灭菌温度(121/15min)目前我国食品卫生标准中规定的细菌总数实际上是指菌落总数。2 煌绿乳糖胆盐(Brilliant Green Lactose Bile,BGLB)肉汤:0 mL,沿管壁缓慢注于装有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。1n2)d(232+244+33+35)/(2+0.1、平皿分4部分点数(见图)3.1恒温培养箱:恒温培养箱:361 301。3.2冰箱:冰箱:
15、25。3.3恒温水浴箱:恒温水浴箱:461。3.4天平:感量天平:感量0.1g。3.5 均质器均质器3.6 振荡器振荡器3.7无菌吸管:无菌吸管:1mL(具(具0.01mL刻度)、刻度)、10mL(具(具0.1mL刻度)或微量移液器及其吸头。刻度)或微量移液器及其吸头。3.8无菌锥形瓶:容量为无菌锥形瓶:容量为250mL、500mL。3.9无菌培养皿:直径为无菌培养皿:直径为90mm。3.10pH计或计或pH比色管或精密比色管或精密pH试纸。试纸。3.11放大镜或放大镜或/和菌落计数器或和菌落计数器或PetrifilmTM自自动判读仪。动判读仪。3.12无菌刀、剪子、镊子等无菌刀、剪子、镊子等
16、。4.1平板计数琼脂培养基平板计数琼脂培养基(Plate count agar PCA),见附录见附录A中中A.1。pH 7.00.2 4.2磷酸盐缓冲稀释液,见附录磷酸盐缓冲稀释液,见附录A中中A.2。pH 7.24.3 无菌生理盐水无菌生理盐水,见附录见附录A中中A.3:称取:称取8.5g氯化钠溶氯化钠溶于于1000mL蒸馏水中,蒸馏水中,121高压灭菌高压灭菌15min。(4.4 1 mol/L 氢氧化钠(氢氧化钠(NaOH):称取):称取40g氢氧化钠溶于氢氧化钠溶于1000mL水中。水中。4.5 1 mol/L 盐酸(盐酸(HCl):移取浓盐酸):移取浓盐酸90mL,用蒸馏水稀释至,
17、用蒸馏水稀释至1000mL 4.6 PetrifilmTM菌落总数测试片(菌落总数测试片(aerobic count plate)和压板。)和压板。)4.7 75%乙醇。乙醇。区别:区别:pH值(值(08:pH 7.00.2;03:pH 7.27.4)细细 菌菌 学学 检检 验验 程程 序序-细菌总数细菌总数 5、第一法第一法 平板菌落计数法平板菌落计数法 固体和半固体食品:固体和半固体食品:以无菌操作称取以无菌操作称取25g样品,样品,放入于装有放入于装有225 mL磷酸盐缓冲稀释液或磷酸盐缓冲稀释液或0.85生生理盐水的无菌均质杯内,于理盐水的无菌均质杯内,于8000r/min10000
18、r/min均质均质1min2min,制成,制成1:10样品匀液;或放样品匀液;或放入于入于225 mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打质器拍打1min2min制成制成1:10的样品匀液。的样品匀液。液体样品:液体样品:以无菌吸管吸取样品以无菌吸管吸取样品25mL放入装放入装有有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分中,充分混匀,制成混匀,制成1:10的样品匀液(的样品匀液(表面取样的样品按表面取样的样品按一定的比例制成一定的比例制成1:1样
19、品匀液和样品匀液和/或或1:10样品匀样品匀液。液。)。)。用用1mL无菌吸管或微量移液器吸取无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液样品匀液1.0 mL,沿管壁缓慢注于装有,沿管壁缓慢注于装有9mL稀释液的无菌试管中稀释液的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100的样品的样品匀液。匀液。另取另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做顺序,做10倍递增样品匀液,如此每递增稀释一次,即倍递增样品匀液,如此
20、每递增稀释一次,即换用换用1次次1mL灭菌吸管或吸头。灭菌吸管或吸头。根据对样品污染情况的估计,选择根据对样品污染情况的估计,选择23个适宜稀释度个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),分别在做的样品匀液(液体样品可包括原液),分别在做10倍递倍递增稀释的同时,吸取增稀释的同时,吸取1.0 mL样品匀液于无菌平皿内,样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时分别取每个稀释度做两个平皿。同时分别取1mL稀释液加入稀释液加入两两个无菌平皿个无菌平皿作空白对照。作空白对照。样品匀液移入平皿后,应及时将凉至样品匀液移入平皿后,应及时将凉至46平板计数琼平板计数琼脂培养基脂培养基(可放置于可
21、放置于461恒温水浴箱中保温恒温水浴箱中保温)注入注入平皿约平皿约15mL20mL,并转动平皿使混合均匀。同时,并转动平皿使混合均匀。同时将平板计数琼脂培养基倾入将平板计数琼脂培养基倾入加有加有1.0 mL空白稀释液空白稀释液的的无菌平皿内作对照。无菌平皿内作对照。琼脂凝固后,将琼脂凝固后,将平板翻转平板翻转,361培养箱内培养箱内培养培养48h2h。水产品采用水产品采用301培养培养72h3h(08新增新增)。琼脂凝固后,如果怀疑样品中含有在琼脂培养基琼脂凝固后,如果怀疑样品中含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在表面覆盖一薄层琼表面弥漫生长的菌落时,可在表面覆盖一薄层琼脂培养基(约脂培
22、养基(约4mL),并在报告上记录该操作,),并在报告上记录该操作,待覆盖层凝固,翻转平板,按条件进行操作待覆盖层凝固,翻转平板,按条件进行操作 可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录相应的菌落数量和稀释倍数。菌落计数器,记录相应的菌落数量和稀释倍数。菌落计数以菌落形成单位(以菌落形成单位(colony forming units,CFU)表示。表示。平板菌落数的选择平板菌落数的选择 选取菌落数在选取菌落数在30CFU300CFU个之间、无个之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于低于30CFU个菌落的平板记录具体
23、菌落数,大于个菌落的平板记录具体菌落数,大于300的可记录为多不可计的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采。每个稀释度的菌落数应采用用两个两个平板平均数。平板平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后,即可计算半个平板后乘乘2,代表全平板菌落数。,代表全平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,当平板
24、上出现菌落间无明显界线的链状生长时,即将每条链作为一个菌落计数。如有链状菌落生即将每条链作为一个菌落计数。如有链状菌落生长时长时(菌落之间无明显界线菌落之间无明显界线),若仅有一条链,可,若仅有一条链,可视为一个菌落;如果有不同来源的几条链,则应视为一个菌落;如果有不同来源的几条链,则应将每条链作为一个菌落计。将每条链作为一个菌落计。1、平皿分、平皿分4部分点数(见图)部分点数(见图)2、求同一、求同一稀释度的平均菌落数稀释度的平均菌落数 如:如:A1数数 +A2数数 26.4、菌落计数方法、菌落计数方法 1.若若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计
25、数范围内,计算两,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克(毫升)中菌落总数结果。克(毫升)中菌落总数结果。(见表例(见表例1)。)。2.若若有两个连续稀释度在适宜计数范围内有两个连续稀释度在适宜计数范围内(30300个菌落)时,个菌落)时,按如下公式计算:按如下公式计算:N=C/(n1+0.1n2)d 式中:式中:N 样品中菌落数;样品中菌落数;C 平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2 适
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