白蛋白测定与线性范围试验实用课件.ppt

1、血清总蛋白（血清总蛋白（TPTP）测定）测定与线性范围试验与线性范围试验邹佳峻邹佳峻一、双缩脲法测定血清总蛋白（一、双缩脲法测定血清总蛋白（TPTP）二、线性范围试验二、线性范围试验1.1.实验目的实验目的掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、方法方法熟悉熟悉722722分光光度计的使用分光光度计的使用了解了解TPTP测定的临床意义测定的临床意义一、一、双缩脲法测定血清总蛋白（双缩脲法测定血清总蛋白（TPTP）+CuCu2+2+OHOH-2.2.实验原理实验原理CO(NHCO(NH2 2)2 2 +CO(NH CO(NH2 2)2 2缩合缩合HH2 2N-OC-N

2、H-CO-NHN-OC-NH-CO-NH2 2紫红色化合物紫红色化合物（1）双缩脲反应：）双缩脲反应：OH OH蛋白质分子中的肽键蛋白质分子中的肽键 +铜离子铜离子 紫红色复合紫红色复合物物 （CONHCONH）Cu2+Cu2+紫色复合物在紫色复合物在540nm540nm波长有特定的吸收峰，波长有特定的吸收峰，其颜色的深浅（吸光度）与蛋白质的浓度在其颜色的深浅（吸光度）与蛋白质的浓度在一定范围内成正比。一定范围内成正比。此反应和此反应和2 2个尿素分子缩合后生成的双缩脲在个尿素分子缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与碱性溶液中与Cu2+Cu2+作用生成紫红色复合物作用生成紫红色复合物的反应相似，故

3、称双缩脲反应。的反应相似，故称双缩脲反应。（2 2）双缩脲法测定）双缩脲法测定TP的原理的原理 3.3.实验材料实验材料 试剂（试剂（1 1）商品双缩脲试剂）商品双缩脲试剂 （2 2）自配双缩脲试剂）自配双缩脲试剂 （3 3）血清样品）血清样品 （4 4）总蛋白标准液（）总蛋白标准液（70.0g/L70.0g/L）器材试管、加样枪、吸量管器材试管、加样枪、吸量管 、722722分光分光光度计、水浴箱光度计、水浴箱4.4.实验方法实验方法取取5 5支试管，按下表操作支试管，按下表操作另取另取5 5支试管，按下表操作支试管，按下表操作2、选择菜单Analyze Compare Means Pari

4、edSample T Test2、选择菜单Analyze Compare Means PariedSample T Test2、选择菜单Analyze Compare Means PariedSample T Test试剂自配双缩脲试剂、TP标准液、质控血清（用蒸馏水稀释，浓度为120g/L）。7、选择“分析”“回归分析”“线性”线性回归用直线方程表达X（自变量）和Y（因变量）之间的数量关系。一、双缩脲法测定血清总蛋白（TP）二、线性范围试验0，选择“输入数据”取5支试管，按下表操作器材试管、加样枪、吸量管、722分光光度计、水浴箱。（3）血清样品蛋白质分子中的肽键+铜离子 紫红色复合物（CO

5、NH）Cu2+血浆浓缩（如呕吐、严重腹泻、高烧）。蛋白质丢失增加（如严重烧伤、肾病综合征）；（4）同一浓度应采用三管平行操作，初步判断测出的吸光度值，若相差超过0.0软件对线性范围内的浓度C 与对应吸光度值A作直线回归分析，求出回归方程=a+bx，并求出相关系数（r）和决定系数（r2）。因此，新建立的分析方法，其线性范围尚未确定时，为较准确地测出该方法符合LambertBeer定律的浓度范围，我们需要进行线性范围的测定。要确定回归直线方程，只要确定截距a与回归系数b即可。5.5.实验结果实验结果 参考值：参考值：6082g/L6082g/L 结合实验数据分析结果进行讨论结合实验数据分析结果进行

6、讨论,用用SPSS13.0SPSS13.0分析两组数据间有无统计学意义（配对分析两组数据间有无统计学意义（配对t t检检验）。验）。6.6.总蛋白测定的临床意义总蛋白测定的临床意义（1 1）血清总蛋白浓度增高见于）血清总蛋白浓度增高见于 a.a.蛋白质合成增加（如多发性骨髓蛋白质合成增加（如多发性骨髓瘤）；瘤）；b.b.血浆浓缩（如呕吐、严重腹泻、高血浆浓缩（如呕吐、严重腹泻、高烧）。烧）。（2 2）血清总蛋白浓度降低见于）血清总蛋白浓度降低见于 a.a.蛋白质合成障碍（如肝严重受损）；蛋白质合成障碍（如肝严重受损）；b.b.蛋白质丢失增加（如严重烧伤、肾病蛋白质丢失增加（如严重烧伤、肾病综合

7、征）；综合征）；c.c.营养不良或消耗增加（如低蛋白饮食、营养不良或消耗增加（如低蛋白饮食、严重结核病、甲亢）；严重结核病、甲亢）；d.d.血液稀释。血液稀释。配对样本是指同一样本进行两次测试所获得配对样本是指同一样本进行两次测试所获得的两组数据，或对两个完全相同的样本在不的两组数据，或对两个完全相同的样本在不同条件下进行测试所得的两组数据。同条件下进行测试所得的两组数据。SPSS13.0SPSS13.0操作操作 1 1、录入数据；、录入数据；2 2、选择菜单、选择菜单Analyze Compare Analyze Compare Means PariedSample T TestMeans

8、PariedSample T Test 3 3、生成统计结果，查看、生成统计结果，查看P“sig.(2tailde)”P“sig.(2tailde)”（值（值（P P值值0.050.05，可以认为两种方法的结，可以认为两种方法的结果差别无显著性差异；果差别无显著性差异；P0.05P Compare Means PariedSample T Test最小二乘法 各实测点到直线的纵向距离的平方和最小。掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、方法掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、方法OH蛋白质合成增加（如多发性骨髓瘤）；在两个具有相关关系的变量的一组数据（X与Y）间，通过散点图我们可观察出所有数据点都分布

9、在一条直线附近，这样的直线可以画出许多条，而我们希望其中的一条能最好地反映X与Y之间的关系，即我们要找出一条直线，使这条直线“最贴近”已知的数据点。蛋白质丢失增加（如严重烧伤、肾病综合征）；（4）同一浓度应采用三管平行操作，初步判断测出的吸光度值，若相差超过0.器材试管、加样枪、吸量管、722分光光度计、水浴箱。熟悉线性范围试验的具体操作过程。8、选择自变量（X），因变量（Y）0软件对线性范围内的浓度C 与对应吸光度值A作直线回归分析，求出回归方程=a+bx，并求出相关系数（r）和决定系数（r2）。CO(NH2)2+CO(NH2)2试剂自配双缩脲试剂、TP标准液、质控血清（用蒸馏水稀释，浓度为

10、120g/L）。另取5支试管，按下表操作Analyze Regression Linear此反应和2个尿素分子缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与Cu2+作用生成紫红色复合物的反应相似，故称双缩脲反应。（1）标本、试剂的加量必须十分准确，应用加样枪进行加样。0分析两组数据间有无统计学意义（配对t检验）。二、线性范围试验二、线性范围试验1.1.实验目的实验目的通过线性范围的测定，选择线性段作通过线性范围的测定，选择线性段作为该测定方法的分析范围。为该测定方法的分析范围。掌握线性范围试验的评价及意义。掌握线性范围试验的评价及意义。熟悉线性范围试验的具体操作过程。熟悉线性范围试验的具体操作过程。在比色分

11、析中，在符合在比色分析中，在符合LambertBeerLambertBeer定律的条定律的条件下，有色溶液的吸光度与被测物质浓度成件下，有色溶液的吸光度与被测物质浓度成正比。正比。以标准物质浓度以标准物质浓度C C为横坐标，吸光度为横坐标，吸光度A A为纵坐为纵坐标，可在普通方格纸上绘出一条直线，即剂标，可在普通方格纸上绘出一条直线，即剂量反应曲线或校正曲线。量反应曲线或校正曲线。2.2.实验原理实验原理 在此情况下，待测物浓度与吸光度的比值为在此情况下，待测物浓度与吸光度的比值为一常数，直线上任何一点的斜率一常数，直线上任何一点的斜率tantan 都相等，都相等，即即tantan=A1/C1

12、=A2/C2=A3/C3=A=A1/C1=A2/C2=A3/C3=An n/C/Cn n=K=K此处此处KK即为校正常数。即为校正常数。在实际工作中并不存在理想的反应曲线，当在实际工作中并不存在理想的反应曲线，当被测物浓度过高、仪器处于非理想状态时，被测物浓度过高、仪器处于非理想状态时，都可导致对都可导致对LambertBeerLambertBeer定律的偏离，出定律的偏离，出现正偏离和负偏离现象。现正偏离和负偏离现象。因此，新建立的分析方法，其线性范围尚未因此，新建立的分析方法，其线性范围尚未确 定 时，为 较 准 确 地 测 出 该 方 法 符 合确 定 时，为 较 准 确 地 测 出 该

13、 方 法 符 合LambertBeerLambertBeer定律的浓度范围，我们需要定律的浓度范围，我们需要进行线性范围的测定。进行线性范围的测定。线性范围的确定线性范围的确定 要求能覆盖临床上的参考值和常见疾要求能覆盖临床上的参考值和常见疾病的医学决定水平，以减少标本稀释重测的病的医学决定水平，以减少标本稀释重测的机会。机会。3.3.实验材料实验材料 试剂自配双缩脲试剂、试剂自配双缩脲试剂、TPTP标准液、质控标准液、质控血清（用蒸馏水稀释，浓度为血清（用蒸馏水稀释，浓度为120g/L120g/L）。）。需用到的公式需用到的公式 C1C1*V1=C2V1=C2*V2V2 器材试管、加样枪、吸

14、量管、器材试管、加样枪、吸量管、722722分光分光光度计、水浴箱。光度计、水浴箱。取试管取试管3131支，除空白管外，支，除空白管外，110110号管各做号管各做3 3个平行管，个平行管，一共有一共有1010个浓度。按表三加样个浓度。按表三加样4.4.实验方法实验方法5.5.实验结果实验结果所得数据如实填入表四所得数据如实填入表四6.6.注意事项注意事项（1 1）标本、试剂的加量必须十分准确，应用）标本、试剂的加量必须十分准确，应用加样枪进行加样。加样枪进行加样。（2 2）稀释时，应使测定管系列成为精确的浓）稀释时，应使测定管系列成为精确的浓度等差系列。度等差系列。（3 3）质控血清稀释时，

15、要严格规范操作，准）质控血清稀释时，要严格规范操作，准确加样。确加样。（4 4）同一浓度应采用三管平行操作，初步判）同一浓度应采用三管平行操作，初步判断测出的吸光度值，若相差超过断测出的吸光度值，若相差超过0.1000.100，应，应去掉其中的异常数值后再算平均值。去掉其中的异常数值后再算平均值。（5 5）标准溶液和样品溶液的蛋白质浓度均应）标准溶液和样品溶液的蛋白质浓度均应超过超过10mg/mL10mg/mL。7.7.数据处理与分析数据处理与分析（1 1）用）用ExcelExcel软件制作出浓度软件制作出浓度C 对吸光度值对吸光度值A的标准曲线图，求出线性范围。的标准曲线图，求出线性范围。（

16、2 2）采用采用SPSS13.0SPSS13.0软件对线性范围内的浓软件对线性范围内的浓度度C 与对应吸光度值与对应吸光度值A作直线回归分析，求作直线回归分析，求出回归方程出回归方程=a+bx=a+bx，并求出并求出相关系数相关系数（r r）和和决定系数决定系数（r r2 2）。）。（一）线性回归掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、方法因此，新建立的分析方法，其线性范围尚未确定时，为较准确地测出该方法符合LambertBeer定律的浓度范围，我们需要进行线性范围的测定。掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、方法Analyze Regression Linear试剂自配双缩脲试剂、TP标准液、质控血清

17、（用蒸馏水稀释，浓度为120g/L）。以标准物质浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，可在普通方格纸上绘出一条直线，即剂量反应曲线或校正曲线。掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、方法另取5支试管，按下表操作将“因变量”选入“Dependent”下框内，（5）标准溶液和样品溶液的蛋白质浓度均应超过10mg/mL。（2）复制“Patch.0统计学软件回归分析步骤当两变量呈反向变化时，1r0，为负相关；0软件对线性范围内的浓度C 与对应吸光度值A作直线回归分析，求出回归方程=a+bx，并求出相关系数（r）和决定系数（r2）。a是回归直线在Y轴上的截距，即X=0时Y的预测值。（2）自配双缩脲试剂一、双缩脲法

18、测定血清总蛋白（TP）器材试管、加样枪、吸量管、722分光光度计、水浴箱。熟悉线性范围试验的具体操作过程。试剂（1）商品双缩脲试剂6、输入数据，注意“自变量”和“因变量”所对应的位置 在两个具有在两个具有相关关系相关关系的变量的一组数据的变量的一组数据（X X与与Y Y）间，通过散点图我们可观察出所有数间，通过散点图我们可观察出所有数据点都分布在一条直线附近，这样的直线可据点都分布在一条直线附近，这样的直线可以画出许多条，而我们希望其中的一条能最以画出许多条，而我们希望其中的一条能最好地反映好地反映X X与与Y Y之间的关系，即我们要找出之间的关系，即我们要找出一条直线，使这条直线一条直线，使

19、这条直线“最贴近最贴近”已知的数已知的数据点。据点。线性回归线性回归用直线方程表达用直线方程表达X X（自变量）（自变量）和和Y Y（因变量）之间的数量关系。（因变量）之间的数量关系。是是y y（实测值）的预测值，表示当（实测值）的预测值，表示当x x取值取值xi=xi=（1 1，2 2，n n）时，）时，y y相应的预测相应的预测值为值为yiyi。=a+bx=a+bx称为称为Y Y对对X X的回归直线方程，相应的的回归直线方程，相应的直线称为回归直线。直线称为回归直线。a a是回归直线在是回归直线在Y Y轴上的截距，即轴上的截距，即X=0X=0时时Y Y的预测值。的预测值。b b是回归直线的

20、斜率，又称为回归系数。表是回归直线的斜率，又称为回归系数。表示自变量示自变量X X对因变量对因变量Y Y影响大小的参数，即影响大小的参数，即当当X X改变一个单位时，改变一个单位时，Y Y的预测值平均改变的预测值平均改变|b|b|个单位。个单位。要确定回归直线方程，只要确定截距要确定回归直线方程，只要确定截距a a与回与回归系数归系数b b即可。即可。回归直线的求法回归直线的求法 最小二乘法最小二乘法 各实测点到直线的纵向距各实测点到直线的纵向距离的平方和最小。离的平方和最小。直线相关直线相关如果两个随机变量中，一个变如果两个随机变量中，一个变量由小到大变化时，另一个变量也相应地由量由小到大变

21、化时，另一个变量也相应地由小到大小到大(或由大到小或由大到小)地变化，并且测得两个地变化，并且测得两个变量组成的坐标点在直角坐标系中呈直线趋变量组成的坐标点在直角坐标系中呈直线趋势，就称这两个变量存在直线相关关系。势，就称这两个变量存在直线相关关系。可用相关系数可用相关系数r r表示。表示。（二）直线相关 相关系数相关系数rr是说明有直线关系的两个变是说明有直线关系的两个变量间相关关系的密切程度和相关方向的统计量间相关关系的密切程度和相关方向的统计指标。指标。相关系数没有单位，其值相关系数没有单位，其值1 r 11 r 1。|r|r|越大，两变量的关系越密切。越大，两变量的关系越密切。当两变量

22、呈同向变当两变量呈同向变化时，化时，0 0r r1 1，为为正相关；正相关；r=1r=1为完全正相关。为完全正相关。当两变量呈反向变当两变量呈反向变化时，化时，1 1r r0 0，为，为负相关；负相关；r=1r=1为完全负相关。为完全负相关。r=0r=0为零相关，为零相关，表示无直线相关表示无直线相关关系关系 。决定系数决定系数r r反映了回归平方和占总平方和的反映了回归平方和占总平方和的比例，其越接近于比例，其越接近于1 1，回归直线拟和的效果，回归直线拟和的效果越好。越好。拟合度越大，自变量拟合度越大，自变量X X对因变量对因变量Y Y的解释程度的解释程度越高，自变量引起的变动占总变动的百

23、分比越高，自变量引起的变动占总变动的百分比高，观察点在回归直线附近越密集。高，观察点在回归直线附近越密集。相关表达两个变量之间相互关系的密切程度和相关表达两个变量之间相互关系的密切程度和方向。方向。回归表达两个变量之间的数量关系，已知回归表达两个变量之间的数量关系，已知X X值值可以预测可以预测Y Y值。值。8、选择自变量（X），因变量（Y）2、选择菜单Analyze Compare Means PariedSample T Testa是回归直线在Y轴上的截距，即X=0时Y的预测值。拟合度越大，自变量X对因变量Y的解释程度越高，自变量引起的变动占总变动的百分比高，观察点在回归直线附近越密集。另

24、取5支试管，按下表操作另取5支试管，按下表操作器材试管、加样枪、吸量管、722分光光度计、水浴箱。b是回归直线的斜率，又称为回归系数。（2）采用SPSS13.一、双缩脲法测定血清总蛋白（TP）二、线性范围试验0，选择“输入数据”紫色复合物在540nm波长有特定的吸收峰，其颜色的深浅（吸光度）与蛋白质的浓度在一定范围内成正比。0统计学软件回归分析步骤血浆浓缩（如呕吐、严重腹泻、高烧）。（4）同一浓度应采用三管平行操作，初步判断测出的吸光度值，若相差超过0.需用到的公式 C1*V1=C2*V2掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、方法蛋白质合成障碍（如肝严重受损）；8.8.思考与讨论思考与讨论（1 1

25、）结合实验数据分析的结果进行讨论，最后）结合实验数据分析的结果进行讨论，最后得出本次实验的结论。得出本次实验的结论。（2 2）线性范围试验在方法学评价中有何作用？）线性范围试验在方法学评价中有何作用？SPSS13.0SPSS13.0统计学软件统计学软件回归分析步骤回归分析步骤1 1、SPSS13.0SPSS13.0软件的安装软件的安装（1 1）运行）运行“SPSS13EvalSPSS13Eval，点击，点击“下一步下一步”，直至安装完成；直至安装完成；（2 2）复制）复制“Patch.exe”Patch.exe”至至SPSSSPSS安装文件夹安装文件夹（默认为（默认为C C：Program P

26、rogram FilesSPSSEVALFilesSPSSEVAL），），“运行运行”“破解破解”。2 2、运行、运行SPSS13.0SPSS13.0，选择，选择“输入数据输入数据”4 4、修改小数点和输入标签名称、修改小数点和输入标签名称 5 5、选择选择“Data View”Data View”选项卡选项卡 ：3 3、选择选择“Variable View”Variable View”选项卡选项卡 ：6 6、输入数据，注意、输入数据，注意“自变量自变量”和和“因变量因变量”所对应的位置所对应的位置 7 7、选择、选择“分析分析”“回归分析回归分析”“线性线性”Analyze Regression Linear Analyze Regression Linear 8 8、选择自变量（、选择自变量（X X），因变量（），因变量（Y Y）将将“因变量因变量”选入选入“Dependent”Dependent”下框内，下框内，“自变量自变量”选入选入“Independent”Independent”下框，点下框，点击击“OK”OK”9 9、生成分析结果、生成分析结果“Regression”Regression”并标注并标注