药敏试验方法简介教程文件课件.ppt
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1、 药敏试验方法简介药敏试验方法简介 耐药菌问题日益严重耐药菌问题日益严重“目前药物失去作用的速度与科学家发目前药物失去作用的速度与科学家发现新药物的速度差不多。现新药物的速度差不多。”摘自摘自WHOWHO报告报告一、一、抗菌药物敏感试验抗菌药物敏感试验(AST)n预测抗菌治疗的效果;预测抗菌治疗的效果;n指导抗菌药物的临床应用;指导抗菌药物的临床应用;n发现或提示细菌耐药机制的存在,指导合发现或提示细菌耐药机制的存在,指导合理用药,避免产生或加重细菌的耐药;理用药,避免产生或加重细菌的耐药;n监测细菌耐药性,分析耐药菌的变迁,掌监测细菌耐药性,分析耐药菌的变迁,掌握耐药菌感染的流行病学,以控制
2、和预防握耐药菌感染的流行病学,以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。耐药菌感染的发生和流行。(1)抗菌药物的选择)抗菌药物的选择n在我国主要遵循临床实验室标准化委员会在我国主要遵循临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)制定的抗菌药物选择原则)制定的抗菌药物选择原则A组:对特定菌群常规测试并报告的药物组:对特定菌群常规测试并报告的药物 B组:可常规测试、选择性报告的药物组:可常规测试、选择性报告的药物C组:替代性或补充性药物组:替代性或补充性药物U组:仅用于泌尿道感染的抗菌药物组:仅用于泌尿道感染的抗菌药物葡萄球菌
3、属抗菌药物药敏试验推荐分组葡萄球菌属抗菌药物药敏试验推荐分组肠杆菌科抗菌药物敏感试验推荐分组肠杆菌科抗菌药物敏感试验推荐分组假单胞菌属的抗菌药物药物敏感推荐分组假单胞菌属的抗菌药物药物敏感推荐分组不动杆菌属的抗菌药物药敏试验推荐分组不动杆菌属的抗菌药物药敏试验推荐分组肠球菌属抗菌药物药敏试验推荐分组肠球菌属抗菌药物药敏试验推荐分组 肺炎链球菌抗菌药物药敏试验推荐分组肺炎链球菌抗菌药物药敏试验推荐分组n药敏试验的折点亦遵照每年最新公布的药敏试验的折点亦遵照每年最新公布的CLSI标准进行,分为敏感(标准进行,分为敏感(S)、耐药()、耐药(R)和中介(和中介(I)。)。n敏感:分离菌株能被测试药物
4、使用敏感:分离菌株能被测试药物使用推荐剂推荐剂量量时在感染部位通常可达到的抗菌药物浓时在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑制度所抑制n耐药:分离菌株不能被测试药物耐药:分离菌株不能被测试药物常规剂量常规剂量可达到的药物浓度所抑制;分离菌株可能可达到的药物浓度所抑制;分离菌株可能存在某些特定的耐药机制;治疗研究显示存在某些特定的耐药机制;治疗研究显示药物对分离菌株的临床疗效不可靠药物对分离菌株的临床疗效不可靠耐药治疗无效;敏感耐药治疗无效;敏感治疗有效治疗有效二、抗菌药物的种类及作用机制二、抗菌药物的种类及作用机制三、药敏试验方法学三、药敏试验方法学 纸片扩散法(纸片扩散法(K-B法)法)稀释
5、法(稀释法(MIC法)法)肉汤稀释法肉汤稀释法 常量稀释法常量稀释法 微量稀释法微量稀释法 琼脂稀释法琼脂稀释法 E-test法法1.手工试验手工试验2.2.自动仪器药敏系统自动仪器药敏系统 纸片扩散法(纸片扩散法(K-B法)法)n原理:抑菌圈的大小反映受试菌对测定药原理:抑菌圈的大小反映受试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的物的敏感程度,并与该药对测试菌的MIC呈呈负相关。负相关。耐药耐药 中介中介 敏感敏感RISLog2.MIC d1 d2 抑菌圈直径(抑菌圈直径(mm)MIC与抑菌圈直径的线性关系与抑菌圈直径的线性关系准备抗菌药物纸片和水解酪蛋白(准备抗菌药物纸片和水解酪蛋白(M
6、-H)培养基;)培养基;挑取孵育挑取孵育16 24小时已分纯菌落,置于生理盐小时已分纯菌落,置于生理盐水管中,振荡混匀后校正浓度至水管中,振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准;麦氏标准;用无菌棉拭子蘸取菌液,在试管内壁旋转挤去多余用无菌棉拭子蘸取菌液,在试管内壁旋转挤去多余菌液菌液,然,然后在后在MH琼脂表面均匀涂布接种琼脂表面均匀涂布接种3次,每次次,每次旋转平板旋转平板60度度,最后沿平板内缘涂抹最后沿平板内缘涂抹1周周;平板在室温下干燥平板在室温下干燥35min,用无菌镊子或商品化,用无菌镊子或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面;的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面;35孵育孵育1
7、624小时,量小时,量取抑菌圈直径;取抑菌圈直径;根据抑菌环的直径,按照根据抑菌环的直径,按照CLSI标准判读,报告敏感、标准判读,报告敏感、中介、耐药。中介、耐药。2023-1-2423CLSI对对K-B法的标准化规定法的标准化规定n纸片药物含量、细菌接种浓度、培养基、纸片药物含量、细菌接种浓度、培养基、平皿厚度、孵育时间、环境、判定标准、平皿厚度、孵育时间、环境、判定标准、质控方法等;常规测试、报告的抗生素。质控方法等;常规测试、报告的抗生素。n不同的药判定标准不同;不同的菌判定标不同的药判定标准不同;不同的菌判定标准也不同准也不同。2023-1-24扩散法药敏影响因素扩散法药敏影响因素n
8、培养基pH值7.2-7.4营养程度(肠球菌能生长)厚度抗生素拮抗剂含量(用29212监控)钙镁离子含量、锌离子含量(用27853氨基糖苷类和亚胺配能结果监控)n菌悬液浓度高抑菌环缩小(假耐药)浓度低则扩大(假敏感)细菌纯度 气体环境 普通细菌放CO2时由于碳酸的影响,药物活性受到影响,形成假敏感或假耐药 苛养菌放普通环境生长不良,导致假敏感 培养时间 粘液性铜绿需48小时 测量方法稀释法稀释法n以一定浓度的抗菌药物与含有受试菌的培养以一定浓度的抗菌药物与含有受试菌的培养基进行一系列不同倍数稀释(通常为双倍稀基进行一系列不同倍数稀释(通常为双倍稀释),培养释),培养1624h后,通过观察细菌生长
9、后,通过观察细菌生长现象来测得药物对受试菌的最低抑菌浓度现象来测得药物对受试菌的最低抑菌浓度(MIC)。)。2023-1-24稀释法(稀释法(MIC法)法)nMIC法:分为常量法和微量法常量法:肉汤稀释法、琼脂稀释法微量法:微量肉汤稀释法p简化双浓度折点法 ATB药敏p简化常规浓度分布MIC法 BD、德灵药敏p动力学计算MIC法 VITEK32、VITEK2药敏l不生长不生长=抗生素抑制细菌生长抗生素抑制细菌生长 l生长生长=抗生素无法抑制细菌生长抗生素无法抑制细菌生长MIC(最小抑菌浓度最小抑菌浓度)=抗生素可抑制细菌生长抗生素可抑制细菌生长的最小浓度。的最小浓度。.250.51248163
10、2MIC=8Increasing Antibiotic Conc.常量稀释法常量稀释法n药敏试验的参考方法:将标准接种物加入含対倍稀释抗生素的MH肉汤管中.过夜培养.MIC 即是能抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一管所标示的浓度值(琼脂稀释法是将対倍稀释后的抗生素加入融化后平衡到50的MHA中再倾制平皿,接种物为一定大小的斑点,浓度也为104CFU/ml).解释标准(S or R)是建立在体内可达到的抗生素浓度水平上104 cfu/ml4210.5 0.25 0.120m mg/ml微量肉汤稀释法微量肉汤稀释法n接种后应充分混匀,但不能有气泡产生n静置培养n培养温度;35n气体环境:所有细
11、菌(包括苛养菌)均置大气环境;厌氧菌置厌氧环境;微需氧菌置微需氧环境;淋菌琼脂稀释法置CO2n培养时间:18小时n药敏结果报告可用药敏结果报告可用MIC(g/ml)或对照)或对照CLSI标准用标准用S、R和和I报告。报告。n对于稀释法的批量试验,有时需要报告对于稀释法的批量试验,有时需要报告MIC50、MIC90。2023-1-24稀释法药敏影响因素稀释法药敏影响因素n培养基pH值 7.2-7.4营养程度抗生素拮抗剂含量钙镁离子含量(钙10-25;镁10-12.5g/ml)n菌悬液(5104CFU/ml)接种效应n浓度高MIC抬高n浓度低MIC压低 细菌纯度 气体环境 所有需氧细菌均放普通大气
12、环境。如果放CO2,由于碳酸的影响,药物活性受到影响,形成假敏感或假耐药 培养时间 真菌需48小时 奴卡菌需5天E-test法法n将稀释法和扩散法的原理结合起来,直接将稀释法和扩散法的原理结合起来,直接测定药物对受试菌的测定药物对受试菌的MIC。2023-1-24按照扩散法标准操作涂布接种贴上试条并培养15-18小时读取抑菌浓度并按标准解释 细菌生长区细菌生长区E试条试条细菌生长抑制区细菌生长抑制区 256 128 80.16判读判读MIC2023-1-24最大的标本容量:对最大的标本容量:对100个标本同时进行个标本同时进行鉴定与药敏测试!鉴定与药敏测试!鉴定部分:鉴定部分:l51孔鉴定实验
13、孔鉴定实验l改良经典实验改良经典实验l显色显色荧光检测荧光检测l无需附加实验与试无需附加实验与试剂剂药敏部分:药敏部分:l85孔药敏实验孔药敏实验l比浊比浊氧化还原氧化还原(专利)(专利)l实测倍比稀释实测倍比稀释MIC值值l药物种类与浓度梯度最药物种类与浓度梯度最多多l耐药机制检测同步进行耐药机制检测同步进行封闭式设计,安全无泄漏封闭式设计,安全无泄漏先进的鉴定先进的鉴定/药敏复合板设计药敏复合板设计PhoenixTM100鉴定板革兰氏阳性板、革兰氏阴性板生化反应组合革兰氏阳性板、革兰氏阴性板生化反应组合LOC SUB-CODE LOC SUB-CODE LOC SUB-CODEA1BGEN
14、B1MTTC1DTAGA2DSUCB2NGUC2MALA3DGUAB3DTREC3DEXA43MGAB4BDCELC4ARARRA5DFRUB5LALTC5GLPRBA6IMNB6BDGLUC6BDGLCA7CLSTB7LPROBC7LLEUHA8PXBB8LPYRC8NAGA9KGAB9FLR_CTLC9FLR_CTLA10DMNTB10LPHETC10LARGHA11MAAB11LTRYC11PHOTA12THYB12PHOSC12LHISTA13PAGLUB13METAC13LISOA14PHOLB14ADGLUC14BDGALA15VAALAB15ALALHC15UREA16LPROT
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