2020届高考生物一轮复习专题25基因工程(包括PCR技术)课件.pptx

1、第十一单元现代生物科技专题专题25基因工程（包括PCR技术）生物生物(天津市选考专用)A A组自主命题组自主命题天津卷题组天津卷题组五年高考考点考点1 1基因工程的工具与操作程序基因工程的工具与操作程序1.(2018天津理综,10,14分)甲型流感病毒为RNA病毒,易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法,主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板,逆转录成对应DNA后,利用技术扩增,并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比,改造后的基因表

2、达时不能合成完整长度的,因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒,并保存。(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因,其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的进行分子杂交鉴定,筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞,并在补加的培养基中进行培养,则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA,翻译出改造病毒基因的完整蛋白,产生大量子代病毒,用于制备疫苗。特殊tRNA基因

3、转录时,识别其启动子的酶是(单选)。A.病毒的DNA聚合酶B.宿主的DNA聚合酶C.病毒的RNA聚合酶D.宿主的RNA聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖,没有致病性,因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比,该病毒活疫苗的优势之一是可引起免疫,增强免疫保护效果。答案答案(共14分)(1)PCR多肽(或蛋白质)(2)载体总RNA(3)非天然氨基酸(Uaa)D(4)细胞解析解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)利用PCR技术体外扩增DNA。若将基因中个别编码氨基酸的序列替换为编码终止密码子的序列,则改造后的基因转录合成的mRNA中,终止密码子提前出现,将

4、不能控制合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)目的基因只有与载体连接后才能导入宿主细胞。可提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定,以筛选获得成功表达题述tRNA的转基因宿主细胞。(3)由(2)知,转基因宿主细胞含有的特殊tRNA基因转录的tRNA,该tRNA的反密码子可与终止密码子配对,并可携带非天然氨基酸(Uaa),所以培养基中需补加非天然氨基酸(Uaa)。病毒中的基因进行转录时,识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合酶。(4)因该病毒疫苗具有侵染性,故可引起细胞免疫。疑难突破疑难突破由(1)中“个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列”可知,改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽。由(

5、2)中特殊tRNA能与终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)可知,转基因宿主细胞可利用非天然氨基酸Uaa,所以培养基中需加入非天然氨基酸Uaa。灭活了的病毒已不具有侵染性,因此,只能引起体液免疫;而具侵染性的病毒可引起细胞免疫。2.(2017天津理综,9,20分)玉米自交系(遗传稳定的育种材料)B具有高产、抗病等优良性状,但难以直接培育成转基因植株,为使其获得抗除草剂性状,需依次进行步骤、试验。.获得抗除草剂转基因玉米自交系A,技术路线如下图。(1)为防止酶切产物自身环化,构建表达载体需用2种限制酶,选择的原则是(单选)。Ti质粒内,每种限制酶只有一个切割位点G基因编码蛋白质的

6、序列中,每种限制酶只有一个切割位点酶切后,G基因形成的两个黏性末端序列不相同酶切后,Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同A.B.C.D.(2)下表是4种玉米自交系幼胚组织培养不同阶段的结果。据表可知,细胞脱分化时使用的激素是,自交系的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。(3)农杆菌转化愈伤组织时,T-DNA携带插入其内的片段转移到受体细胞。筛选转化的愈伤组织,需使用含的选择培养基。(4)转化过程中,愈伤组织表面常残留农杆菌,导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生长。含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达,其产物能催化无色物质K呈现蓝色。用K分别处理以下愈伤组织,出现蓝色的是(多选)。A

7、.无农杆菌附着的未转化愈伤组织激素结果自交系2,4-D(2.0mg/L)6-BA(0.5mg/L)IBA(2.0mg/L)愈伤组织形成率(%)芽的分化率(%)根的诱导率(%)甲991390乙858087丙888312丁168583B.无农杆菌附着的转化愈伤组织C.农杆菌附着的未转化愈伤组织D.农杆菌附着的转化愈伤组织(5)组织培养获得的转基因植株(核DNA中仅插入一个G基因)进行自交,在子代含G基因的植株中,纯合子占。继续筛选,最终选育出抗除草剂纯合自交系A。答案答案(1)A(2)2,4-D乙(3)除草剂(4)BD(5)13解析解析(1)利用双酶切可有效防止出现限制酶切割后的产物(目的基因、载

8、体)发生自身环化及目的基因与载体的任意连接现象。这要求每种限制酶在Ti质粒内只有一个切割位点,含目的基因的DNA片段被两种限制酶切割形成的黏性末端碱基序列不同。(2)细胞脱分化形成愈伤组织。表格信息显示,使用了2,4-D促使细胞脱分化。作为转化受体的幼胚,不仅要易脱分化,而且还要易再分化生芽、生根,故乙的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。(3)构建的基因表达载体中有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因(除草剂抗性基因位于T-DNA片段上),因利用农杆菌转化法转基因时,只有T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上,故需使用含除草剂的培养基筛选转化的愈伤组织。(4)因“含有内含子的报告基因只能在真核生

9、物中正确表达”,只有细胞内含有报告基因(成功转化)的愈伤组织,用K处理后出现蓝色,故选BD。(5)转基因植株相当于携带G基因的杂合子,转基因植株自交,后代有3/4植株携带G基因,其中纯合子占1/3。素养解读素养解读本题通过对转基因作物及杂交育种相关知识的考查,让学生形成认识事物、解决时间问题的思维习惯和能力(体现了生命观念、科学思维、社会责任素养的考查)易错警示易错警示转基因植物培育过程中,筛选成功转化的植物受体细胞的标准利用农杆菌转化法完成植物细胞转基因时,因只有Ti质粒的T-DNA整合到受体细胞的染色体DNA上,故筛选转化的植物受体细胞只能借助T-DNA片段上的特殊基因作为筛选标准,而Ti

10、质粒上的非T-DNA片段未导入植物受体细胞,在对转化后的受体细胞筛选时不能以此作为选择标准。3.(2015天津理综,8,16分)纤维素分子不能进入酵母细胞。为了使酵母菌能够利用环境中的纤维素为原料生产酒精,构建了含3种不同基因片段的重组质粒。下面是酵母菌转化及纤维素酶在工程菌内合成与运输的示意图。据图回答:(1)本研究构建重组质粒时可选用四种限制酶,其识别序列如下图。为防止酶切片段的自身连接,可选用的限制酶组合是或。A.B.C.D.(2)设置菌株为对照,是为了验证不携带纤维素酶基因。(3)纤维素酶基因的表达包括和过程。与菌株相比,在菌株、中参与纤维素酶合成和分泌的细胞器还有。答案答案(16分)

11、(1)B(或C)C(或B)(2)质粒DNA和酵母菌基因组(3)转录翻译内质网、高尔基体(4)缺少信号肽编码序列,合成的纤维素酶不能分泌到胞外,细胞无可利用的碳源(5)细胞质基质无氧呼吸A基因片段(4)在以纤维素为唯一碳源的培养基上分别培养菌株、,菌株不能存活,原因是。(5)酵母菌生成酒精的细胞部位是,产生酒精时细胞的呼吸方式是。在利用纤维素生产酒精时,菌株更具优势,因为导入的重组质粒含有,使分泌的纤维素酶固定于细胞壁,减少因培养液更新而造成的酶的流失,提高酶的利用率。解析解析本题借助新情境材料考查对照实验结果分析、基因工程、分泌蛋白表达、呼吸等相关知识,考查学生获取信息能力、实验能力、理解能力

12、。(1)为防止酶切片段的自身连接,必须用不同限制酶切割,且酶切片段两端的黏性末端不相同(不存在碱基互补片段)。从图示看,符合要求的限制酶有以下组合:、,B、C正确。(2)分析对照实验首先要确定自变量,本题中自变量是导入含不同基因片段的重组质粒。菌株为空白对照,与其他三个组别比较,不难发现设置菌株的目的是验证质粒自身及酵母菌原基因组不携带纤维素酶基因。(3)基因表达包括转录和翻译两个过程。通过图示来看菌株中,纤维素酶只分布在细胞质基质中,而菌株和菌株的纤维素酶分布在内质网、高尔基体、囊泡、细胞外,所以菌株、中参与纤维素酶合成和分泌的细胞器还有内质网、高尔基体。(4)菌株、进行对比,不难发现信号肽

13、的作用是引导多肽(纤维素酶)进入内质网加工,再经高尔基体分泌到胞外,这样纤维素酶可在胞外将纤维素水解为葡萄糖,供酵母菌吸收利用。而菌株纤维素酶在胞内无法水解纤维素,故在以纤维素为唯一碳源的培养基上,菌株不能存活。(5)酵母菌无氧呼吸生成酒精,场所为细胞质基质。菌株和均能水解纤维素产生酒精,两组进行对比,菌株的纤维素酶流失多,菌株因导入A基因片段使得纤维素酶固定于细胞壁,减少因培养液更新而造成的酶的流失,酶的利用率更高。考点考点2 2基因工程的应用与蛋白质工程基因工程的应用与蛋白质工程1.(2019天津理综,9,12分)B基因存在于水稻基因组中,其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达,但在卵细胞中

14、不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响,设计了如下实验。据图回答:(1)B基因在水稻卵细胞中不转录,推测其可能的原因是卵细胞中(单选)。A.含B基因的染色体缺失B.DNA聚合酶失活C.B基因发生基因突变D.B基因的启动子无法启动转录(2)从水稻体细胞或中提取总RNA,构建文库,进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能),然后构建重组表达载体。(3)在过程、转化筛选时,过程中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上,过程在培养基中应加入卡那霉素。(4)获得转基因植株过程中,以下鉴定筛选方式正确的是

15、(多选)。A.将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交B.以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交C.以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交D.检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚,观察到细胞内仅含一个染色体组,判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的,而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育,由此表明。答案答案(共12分)(1)D(2)精子cDNA(3)(4)BCD(5)B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚解析解析(1)B基因的启动子无法启动转录,会导致B基因在水稻卵细胞中不转录。(2)利用水稻体细胞或精子中提取

16、的总RNA,经逆转录法构建的基因文库为cDNA文库。(3)过程需将基因表达载体导入农杆菌,所以可在培养基中加入卡那霉素以筛选成功导入了基因表达载体的农杆菌。过程农杆菌感染水稻愈伤组织,农杆菌Ti质粒的T-DNA可整合到受体细胞染色体DNA上。(4)水稻细胞中本来就有B基因,正常植株也会出现杂交带,故A错误;B、D选项是检测Luc基因及其产物,B、D正确;C选项检测对象是卵细胞中mRNA,正常水稻植株卵细胞中无B基因的mRNA,C正确。(5)一般情况下,水稻卵细胞在未受精时不能发育成胚,而转基因植株未受精的卵细胞能发育成胚,说明B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚。素养解读素养解读本题借助基

17、因工程相关知识,考查考生运用所学知识对某些生物学问题进行推理、解释,并作出合理判断或得出正确结论的能力;试题通过B基因表达对卵细胞的影响考查了科学思维素养中的演绎与推理要素。2.(2016天津理综,7,12分)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值,只能从人血浆中制备。如图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。(1)为获取HSA基因,首先需采集人的血液,提取合成总cDNA,然后以cDNA为模板,使用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向,请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。(2)启动子通常具有物种及组织特异性,构建在水稻胚乳细胞内

18、特异表达rHSA的载体,需要选择的启动子是(填写字母,单选)。A.人血细胞启动子B.水稻胚乳细胞启动子C.大肠杆菌启动子D.农杆菌启动子(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中,需添加酚类物质,其目的是。(4)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径相比,选择途径获取rHSA的优势是。(5)为证明rHSA具有医用价值,须确认rHSA与的生物学功能一致。答案答案(1)总RNA(或mRNA)(2)B(3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞,有利于目的基因成功转化(4)水稻是真核生物,具有膜系统,能对初始rHSA多肽进行高效加工(5)HSA解析解析本题主要考查基因工程的相

19、关知识。(1)总cDNA是以mRNA为模板反转录合成的,所以需要提取人的总RNA或mRNA;PCR扩增的原理是DNA双链复制,DNA双链复制时,两条子链的延伸方向相反,所以引物的位置及方向如答案所示。(2)要使rHSA基因在水稻胚乳细胞内特异性表达,需要选择水稻胚乳细胞的启动子。(3)酚类物质可吸引农杆菌移向水稻受体细胞,使农杆菌Ti质粒上的T-DNA转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上,有利于目的基因成功转化。(4)大肠杆菌为原核生物,无内质网和高尔基体,不能对多肽进行高效加工,而水稻是真核生物,具有内质网和高尔基体,可对多肽链进行高效加工。(5)要证明rHSA具有医用价值,须确认

20、rHSA与HSA的生物学功能一致。素养解读素养解读本题主要考查基因工程的相关知识,培养学生形成利用生物学概念解决问题的能力(体现了对生命观念、科学思维、社会责任素养的考查)易错警示易错警示注意PCR技术的原理是DNA双链复制,DNA双链复制时,两条母链分别作为模板,新合成的两条子链延伸的方向相反,由此确定引物的位置及扩增方向。3.(2014天津理综,8,12分)嗜热土壤芽孢杆菌产生的-葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶,为使其在工业生产中更好地应用,开展了以下实验:.利用大肠杆菌表达BglB酶(1)PCR扩增bglB基因时,选用基因组DNA作模板。(2)上图为质粒限制酶酶切图谱。bglB

21、基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒,扩增的bglB基因两端需分别引入和不同限制酶的识别序列。(3)大肠杆菌不能降解纤维素,但转入上述构建好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力,这是因为。.温度对BglB酶活性的影响(4)据图1、2可知,80保温30分钟后,BglB酶会;为高效利用BglB酶降解纤维素,反应温度最好控制在(单选)。A.50B.60C.70D.80注:酶的热稳定性是酶在一定温度下,保温一段时间后通过其活性的保持程度来反映的.利用分子育种技术提高BglB酶的热稳定性在PCR扩增bglB基因的过程中,加入诱变剂可提高bglB基因的突变率。经过筛选,可获

22、得能表达出热稳定性高的BglB酶的基因。(5)与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽孢杆菌相比,上述育种技术获取热稳定性高的BglB酶基因的效率更高,其原因是在PCR过程中(多选)。A.仅针对bglB基因进行诱变B.bglB基因产生了定向突变C.bglB基因可快速累积突变D.bglB基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变答案答案(1)嗜热土壤芽孢杆菌(2)NdeBamH(3)转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶(4)失活B(5)A、C解析解析(1)BglB由嗜热土壤芽孢杆菌产生,故PCR扩增bglB基因时,应选用嗜热土壤芽孢杆菌基因组DNA作模板。(2)目的基因在与质粒连接时,需连接在启动子和终止子之间

23、,且所用限制酶不能破坏启动子、终止子和标记基因,所以切割质粒应选用Nde和BamH两种酶,则扩增的bglB基因两端需分别引入Nde和BamH两种酶的识别序列。(3)转基因大肠杆菌含有的bglB基因表达,合成了耐热的纤维素酶,所以其获得了降解纤维素的能力。(4)由图2可知,80保温30分钟后,BglB酶的相对活性为0,所以此时该酶失活;由图1可知:6070时BglB酶的相对活性最高。70时,该酶活性易降低,所以为高效利用BglB酶降解纤维素应最好将温度控制在60。(5)在PCR扩增bglB基因时加入诱变剂仅对该基因进行诱变,可快速累积突变,但诱发基因突变时,突变仍是不定向的,且突变的结果可以改变

24、酶中氨基酸的数目。故A、C正确,B、D错误。B B组统一命题、省组统一命题、省(区、市区、市)卷题组卷题组考点考点1 1基因工程的工具与操作程序基因工程的工具与操作程序1.(2019江苏单科,16,2分)下列生物技术操作对遗传物质的改造,不会遗传给子代的是()A.将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌,筛选获得基因工程菌B.将花青素代谢基因导入植物体细胞,经组培获得花色变异植株C.将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵,培育出产低乳糖牛乳的奶牛D.将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者,进行基因治疗答案答案D本题以基因工程为信息载体,考查考生运用所学知识,对某些生物学问题进行解释、推理得出正确结论的能力;试

25、题通过基因工程技术遗传性分析,体现了对科学思维素养中的分析与判断要素的考查。胰岛素基因表达质粒导入大肠杆菌,获得的工程菌可将胰岛素基因遗传给子代,A不符合题意;B、C培育的转基因植物和转基因动物的每个细胞均含有目有基因,后代可表现转基因性状,B、C不符合题意;将转入目的基因的淋巴细胞回输患者体内后,患者的生殖细胞不含目的基因,故子代不表现转基因性状,D符合题意。2.(2018北京理综,5,6分)用Xho和Sal两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是()图1酶切位点图图2电泳结果示意图A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B.图2中酶切产物可

26、用于构建重组DNAC.泳道中是用Sal处理得到的酶切产物D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA答案答案D图1中,两种限制性核酸内切酶的酶切位点不同,说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同,A正确。图2中,两种酶的酶切产物都为DNA片段,都可用于构建重组DNA,B正确。结合图1的酶切位点图,判断两种酶切DNA后得到的DNA片段数;再结合泳道电泳结果知,泳道是用Sal处理得到的酶切产物,C正确。能被限制性核酸内切酶酶切的DNA片段仍为双链DNA,D错误。3.(2017北京理综,5,6分)为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导

27、入菊花中。下列操作与实验目的不符的是()A.用限制性核酸内切酶EcoR和连接酶构建重组质粒B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上答案答案C本题主要考查基因工程的相关知识。由于C基因两端及质粒上均存在限制酶EcoR的酶切位点,因此,可采用限制酶EcoR和DNA连接酶构建重组质粒;用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织(即农杆菌转化法),可以将C基因导入细胞;由于质粒上存在潮霉素抗性基因(标记基因),因此,可以在培养基中添加潮霉素,筛选被转化的菊花细胞,C符合题意;可用分子杂交方法检测C

28、基因是否整合到菊花染色体上。4.(2019江苏单科,33,8分)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题:图1(1)EcoR酶切位点为,EcoR酶切出来的线性载体P1为末端。(2)用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在酶作用下,形成重组质粒P3。(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如下表(“+”代

29、表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是、。GATATCCTATAG(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段,原因是。菌落类型平板类型ABC无抗生素+氨苄青霉素+-四环素+-氨苄青霉素+四环素+-图2答案答案(8分)(1)平(2)胸腺嘧啶(T)DNA连接(3)BA类菌落含有P0C类菌落未转入质粒(4)乙丙目的基因反向连接解析解

30、析本题借助基因工程相关知识,考查考生从表格、图形等提取信息并运用这些信息解决相关问题的能力;通过构建重组质粒的过程图示和菌落生长情况分析等体现了科学思维素养中的演绎与推理要素。(1)EcoR从识别序列的中心轴线处切割,所以产生的末端为平末端。(2)由于载体和目的基因要连接成DNA分子,所以目的基因片段的两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸时,载体P1的两端应各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸。在DNA连接酶的作用下,可将P2和目的基因连接,形成重组质粒P3。(3)重组质粒P3上有完整的氨苄青霉素基因,所以含有重组质粒P3的菌落在无抗生素和添加氨苄青霉素的培养基上能生长,而在添加四环素的培养基上不能生长,

31、所以应选择的是B类菌落。A类菌落在添加氨苄青霉素、四环素、氨苄青霉素+四环素的培养基上均能生长,说明A类菌落导入了P0。C类菌落在添加氨苄青霉素、四环素、氨苄青霉素+四环素的培养基上均不能生长,说明C类菌落未导入质粒。(4)选择的一对引物组合、目的基因与重组质粒的连接方向及扩增片段长度的可能情况如表:引物组合扩增片段(bp)连接方向甲乙乙丙甲丙正向0350450反向4000450由表可知,PCR鉴定时应选择的一对引物是乙丙。若扩增出了400bp片段,则原因是目的基因反向连接。知能拓展知能拓展PCR过程中,目的基因扩增n次,共产生2n个DNA,其中1个DNA上含引物,1个DNA上含引物,2n-2

32、个DNA既含引物,也含引物。该过程共需要2n-1个引物和2n-1个引物。5.(2018课标全国,38,15分)回答下列问题:(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌体DNA通常需与组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能

33、会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加的抑制剂。答案答案(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶解析解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞,且重组质粒在不同细胞中能正常表达,说明目的基因在不同细胞中的表达机制相同,生物界共用一套遗传密码。(2)基因工程中,受体细胞为大肠杆菌细胞时,常用Ca2+处理大肠杆菌,使之处于感受态,即Ca2+参与的转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体的宿主是细菌,故只有细

34、菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏,可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。知识归纳知识归纳目的基因导入受体细胞的方法(1)若受体细胞为植物细胞:基因枪法、花粉管通道法、农杆菌转化法。(2)若受体细胞为动物细胞:显微注射法。(3)若受体细胞为大肠杆菌:感受态细胞法。6.(2016课标全国,40,15分)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。图(a)图(

35、b)根据基因工程的有关知识,回答下列问题:(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接,理由是。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有,不能表达的原因是。图(c)(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有和,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是。答案答案(1)Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(每空2分,共4分)(2)甲和丙(2分)甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录(3

36、分,其他合理答案可酌情给分)(3)EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶(每空2分,共6分,其他合理答案可酌情给分)解析解析(1)分析图(a)可知,限制酶Sau3A与BamH切割DNA后形成的黏性末端相同,故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表达载体时,为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达,目的基因应插入在启动子和终止子之间,据此可判断甲、丙均不符合要求,目的基因均不能被转录。(3)常见的DNA连接酶有EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶,其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。7.(2016江苏单科,33,9分)下表是几种限制酶

37、识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点,其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题:限制酶BamHBclSau3AHind识别序列及切割位点ATCCCCTAATCAACTAGTGATCCTAGGCTTTTCGGGGGTGAAAA图1图2(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒,应选用两种限制酶切割,酶切后的载体和目的基因片段,通过酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒,需将其转入处于态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌,应在筛选平板培养基中添加,平板上长出的菌落,常用PCR鉴定,所用的引物组成为图2中。(3)若BamH酶切的DNA末端与Bcl酶切的DN

38、A末端连接,连接部位的6个碱基对序列为,对于该部位,这两种酶(填“都能”、“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用Sau3A切图1质粒最多可能获得种大小不同的DNA片段。答案答案(9分)(1)Bcl和Hind连接感受(2)四环素引物甲和引物丙(3)TGATCCACTAGG都不能(4)7GGATCACCTAGT解析解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)分析4种限制酶识别的序列可知:BamH和Bcl识别序列中含有Sau3A的识别序列,这三种酶切割DNA后可以产生相同的黏性末端。为保证质粒上含有标记基因,切割质粒时不能选用BamH和Sau3A,应选用Bcl和Hind两种限制酶切割;酶切后的载

39、体和目的基因片段,需用DNA连接酶连接形成重组质粒,为了扩增重组质粒,需将其转入处于感受态的大肠杆菌中。(2)重组质粒中四环素抗性基因结构完整,氨苄青霉素抗性基因结构被破坏,在筛选平板培养基中添加四环素可以筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌。PCR扩增目的基因时,需用引物甲和引物丙两种引物。(3)BamH酶切产生的黏性末端为,Bcl酶切产生的黏性末端为,经DNA连接酶连接后,连接部位的6个碱基对序列为,此序列不能被BamH和Bcl识别,因此不能被两种酶切开。(4)图1质粒中含有Sau3A酶的3个识别序列,如图:(A、B、C分别表示相邻切点间的DNA片段)用Sau3A酶切,若在一个切点处切割可得到:

40、B+C+A、C+A+B、A+B+C三种DNA片段(但其大小相同),若在两个切点处切割可得到:A、B+C、A+C、B、A+B、C六种DNA片段(其大小均不同);若在三个切点处均切割,可得到A、B、C三种大小不同的DNA片段,综上所述,用Sau3A酶切质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。疑难突破疑难突破准确识别BamH酶和Bcl酶识别序列中含有Sau3A酶的识别序列是准确解答本题的关键。注意第(4)小题,Sau3A酶可能打开1个切点、2个切点和3个切点三种情况。8.(2015福建理综,33,10分)GDNF是一种神经营养因子,对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的

41、表达载体(如图1所示),并导入到大鼠神经干细胞中,用于干细胞基因治疗的研究。请回答:图1图2(1)在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中,使用胰蛋白酶的目的是。(2)构建含GDNF基因的表达载体时,需选择图1中的限制酶进行酶切。(3)经酶切后的载体和GDNF基因进行连接,连接产物经筛选得到的载体主要有3种:单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。为鉴定这3种连接方式,选择Hpa酶和BamH酶对筛选得到的载体进行双酶切,并对酶切后的DNA片段进行电泳分析,结果如图2所示。图中第泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。(4)将正向连接的表达载体导入神经干细胞后,为

42、了检测GDNF基因是否成功表达,可用相应的与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定密度时,需进行培养以得到更多数量的细胞,用于神经干细胞移植治疗实验。答案答案(1)使细胞分散开(2)Xho(3)(4)抗体传代解析解析(1)因动物细胞体外培养时有接触抑制现象,故需用胰蛋白酶处理动物组织,使细胞分散开。(2)目的基因两端及载体DNA分子中均有Xho酶识别的核苷酸序列,故构建基因表达载体时,应用Xho酶切割DNA分子。(3)图示可知载体中酶Hpa与Xho切割点距离为100bp,GDNF基因切割成600bp和100bp两种DNA片段,由正向连接的重组载体中GDNF基因方向与Hpa、Xho酶切割结

43、果可知,正向连接的重组载体被酶Hpa和酶Xho切割后,将得到6000bp和700bp两种DNA片段,即为。(4)可用抗原抗体杂交技术,对目的基因是否表达进行检测。当培养液中的细胞达到一定密度后,可分瓶进行传代培养,以获得更多数量的细胞。考点考点2 2基因工程的应用与蛋白质工程基因工程的应用与蛋白质工程1.(2018江苏单科,32,8分)为生产具有特定性能的-淀粉酶,研究人员从某种海洋细菌中克隆了-淀粉酶基因(1656个碱基对),利用基因工程大量制备-淀粉酶,实验流程见图。请回答下列问题:(1)利用PCR技术扩增-淀粉酶基因前,需先获得细菌的。(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引

44、物的端加上限制性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是。(3)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中的设定与引物有关,的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)变性温度退火温度延伸温度变性时间退火时间延伸时间(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列:5-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU-3图中虚线框内mRNA片段包含个密码子,如虚线框后的序列未知,预测虚线框后的第一个密码子最多有种。(5)获得工程菌表达的-淀粉酶后,为探究影响酶活性的因素,以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性,结果如下:缓冲液50

45、mmol/LNa2HPO4-KH2PO450mmol/LTris-HCl50mmol/LGly-NaOHpH6.06.57.07.57.58.08.59.09.09.510.010.5酶相对活性%25.440.249.863.270.195.599.585.368.163.741.520.8根据上述实验结果,初步判断该-淀粉酶活性最高的条件为。答案答案(1)基因组DNA(2)5使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连(3)(4)813(5)pH为8.5,缓冲液为50mmol/LTirs-HCl解析解析(1)由题干信息可知某种海洋细菌含有-淀粉酶基因,因此在扩增-淀粉酶基因前需先从细菌中提取细菌

46、的基因组DNA。(2)由于引物的作用是引导子链的延伸,将脱氧核苷酸连接到引物上时,是与引物的3端相连的,由此确定需在引物的5端加上限制性酶切位点。常在两条引物上加入不同的限制酶切位点的主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体,防止自身相连。(3)进行PCR扩增时,退火的温度与引物长短和碱基种类有关。延伸时间长短的设定与扩增片段的长度有关。(4)密码子是指mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基,该mRNA上5端为AUG(起始密码子),因此可依据三个碱基是一个密码子来分析图中虚线框中的碱基,可得出共有8个密码子。由于虚线框后的第一个密码子的第一个碱基已经固定为U,因此还有2个碱基未知,共可能有的

47、种数为44=16,又因为UAG、UGA、UAA为终止密码子,因此决定氨基酸的密码子最多有13种。(5)据表格数据可知:-淀粉酶在pH为8.5、缓冲液为50mmol/LTris-HCl的条件下相对活性为99.5%,初步判断此条件下酶活性最高。2.(2018海南单科,31,15分)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质,科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞,得到了转基因植株。回答下列问题:(1)用农杆菌感染时,应优先选用黄瓜(填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共培养,选用这种叶片的理由是。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白,则表明该重组质粒中已转移

48、到植物细胞中且能够表达;用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交,发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1 1,则说明甜蛋白基因已经整合到(填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产,若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗,应选用作为外植体进行组织培养。(4)通常,基因工程操作主要有4个步骤,即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此,基因工程的含义可概括为。答案答案(15分)(1)受伤的叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质,可吸引农杆菌移向这些细胞(2)甜蛋白基因核基因组(3)茎尖

49、(4)按照人们的愿望进行设计,并通过体外重组和转基因等技术,赋予生物新的遗传特性,创造出符合人们需要的新生物类型解析解析(1)用农杆菌感染时,应优先选用黄瓜受伤的叶片与含重组质粒的农杆菌共培养,理由是叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质,可吸引农杆菌移向这些细胞。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白,则表明该重组质粒中甜蛋白基因已转移到植物细胞中且能够表达;用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交,发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1 1,则说明甜蛋白基因已经整合到核基因组中。(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产,若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗,应选用茎尖作为

50、外植体进行组织培养。(4)通常,基因工程操作主要有4个步骤,即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此,基因工程的含义可概括为按照人们的愿望进行设计,并通过体外重组和转基因等技术,赋予生物新的遗传特性,创造出符合人们需要的新生物类型。3.(2017江苏单科,33,8分)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下,请回答下列问题:(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过获得用于PCR扩增。(2)设计一对与MT