兽医生物制品学第四章生物制品生产基本技术下载课件.ppt

1、1第四章第四章 生物制品生产基本技术生物制品生产基本技术第一节第一节 菌种与毒种选育技术菌种与毒种选育技术2n一、生物制品毒种的标准一、生物制品毒种的标准1.生物学性状明显，历史清楚生物学性状明显，历史清楚：形态、生理、生化典型、血清学、来源、代数等清楚。2.遗传学纯一稳定遗传学纯一稳定：稳定纯一的菌种，才能制造出高质量稳定的疫苗。3.免疫抗原、反应抗原好免疫抗原、反应抗原好：高质量疫苗的基础。4.毒力在适当范围内毒力在适当范围内：灭活疫苗应该是强毒，弱毒疫苗安全，中等毒力的如ND-I系，IBD中等毒力苗。测定毒力要用敏感动物进行。345n二、强毒种的选育二、强毒种的选育n1、强毒种的用途：灭

2、活疫苗、诊断试剂、抗血清、攻毒试验。n2、强毒种来源：典型传染病分离培养;保藏中心提供。n3、强毒种分离：67nB、致病力（动物、鸡胚、细胞试验）。nC、抗原性（免疫及反应抗原试验）nD、稳定性（传代不变异）8n(一)纯粹试验（分离培养、鉴定）。n(二)致病力测定n 菌(毒)种的致病力(或称毒力)常用易感实验动物、本动物(原宿主动物)、禽胚或细胞进行测定，用半数致死量(LD50)、半数感染量(ID50)、禽胚半数致死量(ELD50)、胚半数感染量(HD50)、组织细胞半数感染量(TCID50)等来表示。n(三)抗原性测定n 反应原性测定，一般采用血清学方法，以抗体滴度或效价表示。n 免疫原性测

3、定，通常采用的方法是将菌(毒)株制成疫苗，免疫动物，经13 周后用致死剂量的强毒攻击，以保护率表示。抗致死量强毒越多，保护率越高者，免疫原性越好。抗原性的测定，也需设阳性和阴性对照，否则无效。n(四)稳定性测定n 一般采用培养基或动物、禽胚、细胞对菌(毒)株进行传代培养，观察其生物学特性，测定其致病力和抗原性，以证明其遗传性状的稳定。9n达到：毒力强，纯粹，抗原好，稳定毒力强，纯粹，抗原好，稳定的菌种，最后冻干保藏。这就是强毒菌种的标准。强毒菌种的标准。n复壮：弱毒菌种在敏感动物或细胞上多次传代，达到毒力增强的目的（日本731部队用人试验，目的是增强细菌毒力，做细菌武器使用。）。10n三、弱毒

4、种的选育三、弱毒种的选育n1、用途：弱毒疫苗，诊断试剂，免疫血清。n2、来源：自然界筛选和人工诱变。n3、弱毒筛选途径：1112n自然界弱毒筛选：同源弱毒新城疫I系 异源弱毒火鸡疱疹病毒疫苗，它们都是在自然界寻找发现的。n人工诱变筛选：13n人工致弱强毒株n(1)物理途径：高温、干燥、射线等n1881年，巴斯德将炭疽强毒菌在42.5高温下长期传代培养，育成了炭疽弱毒菌株。n巴斯德又将含有狂犬病病毒的脑脊髓置干燥条件中处理，获得了狂犬病病毒弱毒株。n日本乙型脑炎病毒强毒株经紫外线照射后能引起基因突变，从而出现遗传性状分离，再进行蚀斑挑选，育成弱毒株用于制造弱毒疫苗。14n(2)化学途径：化学诱变

5、剂n如通过亚硝基胍处理支原体己育成了鸡支原体疫苗株和肺炎支原体突变株；n将猪副伤寒沙门氏菌强毒株在含有150011000 醋酸铊的肉汤培养基中培养传50 代后，育成了弱毒株。15n(3)生物学途径n 适应钝感动物(非自然宿主)：n我国的猪瘟兔化弱毒株，是将猪瘟病毒强毒株通过兔体传400 余代后育成的。n适应钝感禽胚：n鸭瘟鸡胚化弱毒株，是将鸭瘟病毒强毒株经鸭胚传9 代和鸡胚传23 代后育成的。n羊痘弱毒株-强毒株,鸡胚传代;鸡痘弱毒株强毒株,鹌鹑传代;n适应细胞：多采用同源或异源动物组织的原代细胞。我国的马传染性贫血病驴白细胞弱毒株，是将马传染性贫血病驴白细胞强毒株通过驴白细胞传代育成的。n猪

6、丹毒弱毒株(GC42)-强毒株-豚鼠370代,鸡2代.16n杂交减毒：n流行性感冒弱毒株的育成是将温度敏感株(毒力弱，抗原性弱)与流行株(毒力强，抗原性强)进行混合培养传代，两者毒力基因发生交换产生毒力低、抗原性强的毒株。n(4)基因工程途径n伪狂犬病病毒，去除决定其致病力的TK 基因获得伪狂犬病病毒TK 突变株，用该突变株制成的疫苗是第一个商品化的基因缺失疫苗，预防伪狂犬病效果十分理想。17n4、初选的依据：生物性状改变猪丹毒杆菌变长丝状，菌落光滑变粗糙。病毒蚀斑变异。温度敏感变异。药物敏感变异营养变异宿主变异18第三节第三节 细菌培养技术细菌培养技术n 细菌培养技术是生物制品制造的基础，一

7、些内容在微生物学已经学习过，这里主要讲一些重要的细菌培养技术。19一、细菌生长规律与条件一、细菌生长规律与条件n 大家一定要熟悉细菌的生长曲线，因为不同的生物制品，要用不同时期的细菌，如细菌疫苗，要对数期或稳定期细菌；芽孢疫苗，要衰老期细菌；外毒素要老龄细菌。20n其次，要根据不同细菌用不同的培养基进行培养，用不同的培养方法（需要氧气，微需氧，厌氧。另培养温度，pH，渗透压等。）。21二、细菌培养的基本技术二、细菌培养的基本技术n 步骤：先分离出单个菌落斜面培养基生化或血清鉴定菌种保存生产生物制品先接种到斜面菌种小三角瓶肉汤大三角瓶肉汤。22n（一）细菌分离培养（一）细菌分离培养（目的是稀释病

8、料，得到单个典型菌落）。n1、需氧菌分离培养：分段划线、倾注培养。n2、微需氧培养：鸭疫巴氏杆菌，牛布氏杆菌病，猪传染性胸膜肺炎菌等，用蜡烛缸方法。3、厌氧菌培养：用疱肉基，物理除氧气（加氮气，氢气），化学除氧：焦性没食子酸加烧碱。232425厌氧罐262728厌氧培养箱29n（二）细菌的规模培养n生物制品是产品，一般要大规模培养，才能满足基层需要。n1、菌种接种量：1-3%，过少生长慢，过度带入有害产物多，影响生长。n2、培养时间：菌苗，对数期和稳定期的细菌好；芽孢疫苗：衰老期细菌；外毒素：需要1周时间培养。在培养过程中，如果有少量污染，可以提前灭活终止培养。30n液体静止培养：一般细菌疫苗

9、多用，用大三角瓶（5000ml）或发酵罐，装入培养基1/2-2/3量，需氧培养，要5小时摇动一次，增加氧气浓度。培养厌氧细菌，可以装满培养基，上面加少量石蜡油，隔绝空气，下加肝块或肉渣（疱肉基），它们氧化，吸收氧气，达到除氧气目的。液体培养含菌量低，多需要浓缩。31n3、培养方法：根据不同制品的性质和要求，选育不同方法。n固体表面培养：多用于诊断剂，也有菌苗生产。可随意调节细菌浓度，但操作麻烦，劳动量大。n培养方法有克氏瓶，大平皿，到入菌液，L玻棒刮抹接种，培养后加生理盐水，再用L棒刮洗下细菌混悬液。323334n液体深层通气培养（发酵罐）：可自动调节温度、氧气、pH、营养、搅拌，注意消泡沫和

10、污染。n透析培养：半渗透膜作用，营养可以不断补充，可以提高细菌和毒素含量。n连续培养：营养不断加入，培养好的细菌不断流出。35KRH-PB-6L 玻璃发酵罐 36（三）细菌计数技术 细菌疫苗必须有一定含菌量，才有好的免疫效果。所以，应该对生产的疫苗计算含菌量。n1、直接显微镜检查计数n定量定面积染色计数：10ul菌液，涂抹1cm2面积的载玻片上，干燥固定染色，油镜下观察，油镜直径是0、16mm，视野面积是0、02mm2，1cm2面积有50万个油镜视野，多观察几个视野，算出一个视野细菌平均数X50万X100，即每ml含细菌量。37n比例法计数（也叫对照法）n如用已知人红细胞为500万/mm3（可

11、以把红细胞0、4%甲醛固定，长期使用），取一环红细胞放在载玻片上，另取一环菌液与红细胞混匀涂片，干燥固定染色，显微镜下检查，如果平均每个视野是一个红细胞，10个细菌，那么，被检查细胞为5000万/mm3，1ml是500000万个细菌。38n估计计数法n接种环直径在0.5cm，取一环细菌液，涂抹在载玻片上，大约0.51 cm2，干燥固定染色，显微镜检查，如果每个视野平均是19个细菌，菌液含量是105-6个/ml，1099为107-8个/ml，100以上为109-10个/ml，密不可计为1010个以上/ml。39n红细胞计数室法：n（细菌量）Y/80X400X稀释倍数X10=细菌数/mm3，变ml

12、乘1000。（Y是5个中方格细菌总数，乘10是计数室的高度为0、1mm，计数室1mm2，有400个小格，有25个中格，每个中格是16个小格）。该方法多用于计数大的细菌或酵母菌、细胞。4041422、比浊比色法比浊管法 含菌量与浑浊度正比，用已知菌含量的试管与标准比浊管相比，找出规律，如1亿细菌=1号比浊管颜色，10亿等10号，以后，用未知细菌液与标准管比色，得出大致细菌含量。43美蓝还原褪色法：含细菌多，使美蓝褪色快。10ml牛奶，加1ml美蓝液（1/3000），37度水浴，褪色少于20分钟，细菌多于2000万/ml，20-2小时，为4002000万；2-5、5小时为50400万；5、5小时以

13、上，为少于50万/ml，为一级牛奶；如果用于细菌苗，应先用已知细菌找出规律。443、活菌计数：n原理，一个菌落是一个细菌的后代，数菌落就知道含菌量，也叫菌落形成单位CFU：colony format unite。n倾注法（GB方法）：菌液10倍递减稀释，选2-3个稀释度，各取1ml于平皿，加45-50营养琼脂15-20ml，摇匀37度培养，计算菌落，乘稀释倍数，即每ml细菌数。45n平板表面涂布法：先做好营养琼脂平板，将不同稀释度菌液0、1ml加上，玻璃棒刮匀，37度24h培养，计算菌落乘稀释度乘10=菌数/mln微量滴板法：将不同稀释度菌液，各取0、02ml滴在营养琼脂板上，一板可以滴多点，

14、自然扩散，37度培养，计算每点菌落乘50乘稀释度=菌数/ml。46三、培养基三、培养基n微生物学已经学过，自己温习，重点熟悉：1.不同微生物用不同的培养基来培养2.注意各种营养物质浓度配比3.调节合适的pH范围47第三节第三节 病毒的增殖技术病毒的增殖技术n一、病毒的复制与培养一、病毒的复制与培养n病毒为专性细胞寄生物，必须在活细胞内生存，其复制过程是：吸附，进入，脱壳，生物合成，装配和释放。微生物已经讲，自己复习。n 二、病毒的动物接种增殖二、病毒的动物接种增殖n（一）、病毒材料的处理n 1、病毒的释放：剪碎研磨，1：5-10稀释，冰冻融及超声波处理。n 2、除杂菌：细菌过滤器过滤，高速离心

15、取上清液；其次是抗生素处理，加5001000u/ml青霉素和链霉素，4度过夜杀菌。48n（二）动物选择n健康动物、SPF动物；n未接种相应病毒疫苗动物n适宜年龄和体重n易感动物。n（三）接种方法：皮下，肌肉，静脉，腹腔，脑，胸腔等49三、鸡胚的接种三、鸡胚的接种n（一）鸡胚的选择n1、健康的SPF鸡胚n2、白壳，薄壳消毒蛋n3、没免疫相应病毒疫苗n4、5-7天照蛋，去无精、死胚鸡蛋n5、画出气室，接种24h照蛋，定时收病毒。50n（二）鸡胚的接种和收获n避开血管和心脏，确定接踵部位，先碘酒消毒，再酒精消毒，用三棱针或12号针头钻孔，然后可以接种。预先准备好病料，注射器，融化的石蜡。n1、卵黄囊

16、接种：用5-8天鸡胚，在气室中心，胚胎对侧刺入3cm（先用三棱针钻孔）。用于病毒，立克次氏体，衣原体接种。n2、尿囊腔接种，用9-11日鸡胚，在气室边缘下2cm，避开血管，40进针0.5-1.5cm。适应鸡新城疫，鸭肝炎，鸡传染支气管炎病毒接种。515253n方法：n(a)将蛋胚在检卵灯上照视，标出气室与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。(b)将蛋胚钝端向上竖放在蛋座木架上。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。n(c)用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0.1ml病毒液。(nd)用石蜡封孔后于37孵卵器孵育72小时。

17、54n收获尿囊液：(a)将蛋胚放在冰箱内冷冻半日或一夜，使血管收缩，以便得到无胎血的纯尿囊液。(b)用碘酒消毒气室处的卵壳，并用灭菌剪刀除去气室的卵壳。切开壳膜及其下面的绒毛尿囊膜，翻开到卵壳边上。(c)将鸡卵倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液。一个蛋胚约可收获6ml左右尿囊液。若操作时损伤了血管，则病毒会吸附在红细胞上，尿囊液成为无用。收获的尿囊液经无菌试验后可在4以下的温度中保存。观察鸡胚，看有无典型的症状。55n3、羊膜腔接种：用10-12日鸡胚，在胚胎对侧进针，有抵抗时注入病毒。n4、绒毛尿囊膜接种：选1113日鸡胚，先造人工气室，然后在人工气室内注射，适合痘病毒，疱疹病毒等。n另外，还有

18、脑，胚体，静脉接种，难度大，科研使用。n不同病毒用不同接种途径，培养时间不同，收获组织也不同。565758（三）影响禽胚增殖病毒的因素n 1、种蛋质量：要用SPF蛋，母源抗体存在，抗生素（对立克次氏体和衣原体）。n 2、孵化环境：温度是37.8-38，湿度53-57%，通风，定时翻蛋。n 3、接种技术：无菌操作和消毒，收获根据不同病毒，收获病毒时间不同，不要臭蛋和浑浊蛋。收获后测效价，加双抗-20保存。59四、细胞增殖病毒技术四、细胞增殖病毒技术 1、细胞培养概念：利用机械、酶、化学方法使组织或单层细胞分散成单个或2-4个细胞的悬液，进行培养。原代细胞：新鲜组织制备的单细胞进行培养，一般仅可以

19、传代3代。二倍体细胞：自继代细胞选出的也特殊生物学标志的细胞，染色体是二倍体，可传代50-100代，主要做疫苗生产。细胞株传代细胞：非二倍体，多为癌细胞，可无限生长，如Hela细胞，多用做病毒研究，不能做疫苗生产。细胞系60n2、细胞培养的方法细胞培养的方法静止培养：细胞悬液接入培养瓶中，密封置温箱培养，细胞沿瓶子壁长成单层，为最简单培养病毒方法。转瓶培养：细胞悬液在转瓶旋转培养，10-20转/h，细胞贴壁生长，需要营养液少。悬浮培养：通过震荡，转动使细胞悬浮于液体中培养。微载体培养：以固体小颗粒为载体，便于细胞附着，载体扩大了表面积。中空纤维培养：细胞在中空纤维内生长。微囊化培养：细胞在微囊

20、中生长。61n3、细胞的制备细胞的制备n1)细胞间有胶原蛋白，要破坏它们才变成分散单细胞。机械分散：将组织剪碎成1mm3小块，再挤压通过铜丝网孔，可得到单细胞。酶消化法：常用胰酶破坏细胞间质，活力1：250，浓度是0.25%，pH7.4-7.6。鳌合剂分散法：EDTA可除去维护细胞间结合的Ga+和Mg+，常用于单层细胞的分散。62n2)细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏n慢冻快融法。取对数生长期细胞消化后离心，将细胞沉淀用冻存液(10DMSO，20犊牛血清，70MEM)悬浮至细胞密度为200 万500 万/ml。分装于细胞冻存管后4放置lh，然后-20放置2h，再放入-70：冰箱46 h 后放入

21、液氮中保存。n 细胞复苏时，通常将从液氮中取出的细胞管置于3740水浴4060s 使细胞融化，离心后除去冻存液，然后将细胞悬浮于培养液中进行培养。必要时待细胞完全贴壁后换液1次，以防止残留的DMSO 对细胞有害。细胞在液氮中可贮存35 年，但为妥善起见，每冻存1年应复苏1 次。63q4、细胞培养的要素细胞培养的要素营养物资：培养液（含氨基酸，犊牛血清，维生素，盐，糖等成分）。现多用成品细胞培养基，engle液，RPMI-1640和DMEM等。接种量：与单细胞生长成正比，量过大，因细胞碎片产生毒性作用，过小，不易长成单层。不同细胞 有不同接种量，如鼠肾细胞50万/ml，鸡成纤维细胞2040万ml

22、，猪肾细胞80万/ml，血球计数室计数。64血清：使用前须经56灭活30min，国内多用犊牛血清。n 生长液一般血清含量为520，大部分细胞生长液中加入10血清已能满足细胞生长要求。维持液中血清量为05，尽可能不加入血清以维持细胞活力并避免血清对病毒增殖的抑制作用。pH、温度、气体环境：pH7.2-7.4，不低于6.8，不高于7.6；培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐、磷酸氢盐和氢离子缓冲剂HEPES。温度一般是37，过高容易死亡，过低生长慢，20-25，细胞缓慢长。气体环境，一是橡皮塞密封培养；二是CO2培养箱培养。65n 5 5、污染问题：、污染问题：细菌、真菌、支原体污染，加一定量抗生素可

23、杀菌，如加青链霉素100u，有霉菌污染加制霉菌素。病毒污染：有组织代毒和培养带毒，前者用SPF动物组织可以解决，后者注意灭菌和消毒。胶原虫：（存在犊牛血清），血清37培养1个月以上，高速离心，检查沉淀物。66q6、病毒增殖技术选敏感动物细胞。注意营养，温度和pH。接种量和方法：1-10%接种，V/V；分同步和异步接种。病毒接种方法有两种：异步接毒和同步接毒。异步接毒是细胞长成单层后倒去生长液，按维持液的110接种病毒，37吸附1h 后加入维持液。多数病毒采用这种接毒方式。同步接毒是在种植细胞同时或在种植细胞4 h 内接种病毒，主要用于病毒复制发生在细胞有丝分裂盛期的病毒，如细小病毒等。支原体污

24、染，加抗生素。67n细胞病变：细胞病变效应(CPE)是判定病毒增殖情况的重要指标。多数病毒在敏感细胞上增殖可引起CPE在显微镜下主要表现为：n细胞圆缩，如痘病毒、呼肠孤病毒、披盖病毒等；n细胞聚集，如腺病毒；n细胞融合形成合胞体，如副黏病毒、疱疹病毒；n轻微病变，如正黏病毒、冠状病毒、弹状病毒、反转录病毒等。n但有些病毒杠细胞上增殖不产生CPE，如猪瘟病毒。除CPE 外，包涵体和血凝性也可作为判定指标。病毒在敏感细胞内增殖一般在CPE 达80左右时收获，感染细胞经反复冻融使病毒充分释放，然后3000r/min 离心1520 min 去除细胞碎片，上清病毒液-20、冻存。对于细胞结合型病毒，如马

25、立克氏病病毒，收获的感染细胞直接于液氮中保存。68收获：CPE到80%收获，反复冻融，离心取上清夜，测效价，加双抗，-20保存。69疫苗生产工艺流程 菌（毒）种 培养物（培养基、动 物、禽胚或细胞等）收获抗原（培养液、含毒组织、胚液或细胞液等）配苗 分装 冻干成活疫苗或灭活后制成灭 活疫苗。第四节第四节 疫苗制造流程疫苗制造流程70n一、细菌灭活疫苗制造一、细菌灭活疫苗制造n1、种子种子：毒力强，免疫原性好，13个菌株，菌种逐级扩大培养。n2、培养培养：选适当培养基和方法，如固体或液体培养，要计数活菌和观察纯度。n3、灭活和无菌检查灭活和无菌检查：加适量甲醛37度灭活24h，接种斜面培养基无菌

26、检查，n4、浓缩提高含菌量浓缩提高含菌量：离心或沉淀方法。n5、配佐剂分装配佐剂分装：加20%铝胶，或油2：1水油乳化，无菌分装，加塞，封蜡，标签和装箱。n6、动物安全试验动物安全试验，接种小白鼠0、2ml观察3天，健活。71n二、细菌弱毒疫苗制造二、细菌弱毒疫苗制造n 1、菌种：中监所提供冻干种。n 2、培养：1-3%量接种，检查纯度和计数。n 3、浓缩：离心或吸附沉淀法（用0、2-0、25%羧甲基纤维素浓缩。n 4、配苗和冻干：加入合适浓度保护剂，分装，冻干，加塞，封口，标签和装箱。n 5、动物安全试验。72细菌疫苗的制造流程蛋白胨、肉浸液等原料培养基培养基配制、灭菌菌种生产用种子生产用种

27、子培养菌液菌液菌苗原液配苗分装冻干冻干、扎盖帖签活疫苗原料佐剂佐剂灭活菌液配苗乳化乳化分装、扎盖、帖签灭活疫苗灭活灭活检验配制、灭菌保护剂保护剂原料配制、灭菌73n三、病毒性动物组织苗制造三、病毒性动物组织苗制造n 病毒在易感动物体内增殖，用含毒量高的组织制造疫苗，叫灭活组织苗，如兔瘟，自家组织灭活苗；弱毒疫苗有猪瘟兔化弱毒疫苗。n（一）自家组织灭活苗n 1、选症状典型、含毒量高的组织。n 2、称重和打匀：切碎组织，捣碎机打匀，一般按组织和生理盐水按1：58打匀加生理盐水，加青链霉素各1000u/ml。n 3、冻融和过滤：冰柜反复冰冻和融化三次，释放病毒，8层纱布过滤。74 4、灭活：加0.4

28、%甲醛灭活，37度24h，n 5、无菌检查：接种斜面培养基，培养24h，无细菌生长。菌苗8层纱布再过滤一次。n 6、加佐剂分装：加20%铝胶，分装。n 7、动物安全检查:接种小白鼠0、2ml，观察3天，无反应，安全。n 8、场内实验：先注射两头猪，观察三天，无反应，全场使用。n9、使用方法：8、18日龄仔猪每次注射2-3ml；大猪发病前1个月、半月各注射5ml。n10、保存：2-15一年。75n（二）病毒弱毒疫苗1.选易感的SPF动物，年龄大小一致。2.毒种：选适宜毒力的病毒，减少传代次数，选适宜接种途径。3.观察、收获和测效价：观察食欲、体温、精神等，符合症状者剖杀，取含度高组织测效价，符合

29、效价可以做疫苗。4.研磨、稀释和杀菌：将组织剪碎研磨，按1：101：100加入稀释剂，过滤，加双抗500-1000u/ml，0-4度处理过夜。765.无菌检查，半成品疫苗接种适宜培养基培养，无细菌生长。6.加保护剂冻干分装。7.动物安全试验，接种适宜动物10倍量，3天安全。8.保存：-15一 年。（使用：弱毒疫苗一般3-5天产生免疫。）77病毒性组织疫苗的制造工艺流程感染动物或胚胎分装、扎盖、贴签健康动物或SPF鸡胚等健康动物或健康动物或SPFSPF鸡胚等鸡胚等动物或SPF鸡胚等基础种毒生产用种毒生产用种毒收获感染组织或胚液收获感染组织或胚液纯化配制成含毒悬液配苗分装冻干冻干活疫苗保护剂保护剂

30、原料配制检验灭活病毒液配苗、乳化乳化灭活疫苗原料佐剂配制灭活灭活检验78n四、病毒禽胚疫苗的制备四、病毒禽胚疫苗的制备n 除禽病可以用禽胚外，其它正粘病毒（流感）、副粘病毒等，都可以用禽胚培养，生产工艺简单，质量容易控制。791.鸡胚的选择：SPF、未免疫、未用抗生素，适宜的鸡胚龄。2.种毒和继代：冻干毒要鸡胚活化三代以上，效价合格方可使用。3.接种与收获:接种合适部位、合适时间，适宜浓度和量，如ND 系，为10-3、0.1ml接种。ND 系是用10-4、0.1ml接种.培育及收获：ND系，为38、5-39,60-70%湿度培育，收24-48h的鸡胚，0-4冷却，收尿囊液。804.检查无菌和效

31、价。ND ND系效价是1：80以上合格。5.配疫苗：湿疫苗：尿囊液加双抗，-20保存1-2年，0-8保存3-6个月。用时按10-4稀释，每鸡一滴。冻干疫苗：尿囊液适当稀释10-2，加等量保护剂，双抗，分装冻干，-15一年保存。油乳灭活疫苗：尿囊液适当稀释10-2，加0.1%甲醛灭活，加双抗，按油：水疫苗，3-1：1乳化即成，3-15度保存半年，小鸡0、1-0、2ml，大鸡0、51ml。81n五、病毒细胞疫苗的制备五、病毒细胞疫苗的制备n(一)种毒和继代：毒种要经过毒力、安全、无菌检查合格才可以做毒种。其次，毒种要细胞适应后可以大规模培养。n（二）营养液：多用专门商品培养基。n（三）细胞制备：多

32、用原代细胞和二倍体细胞，选择依据：病毒适应性高、毒价高，细胞来源方便、制备简单，生命力强。不能用癌细胞或其它含逆转录病毒的细胞。82n（四）接毒和收获：接毒分同步和异步，同步即细胞分装后不久接种，如细小病毒。异步是细胞形成单层后接种，如猪水泡病病毒。一般按12%量接种，70-85%细胞病变时收获。n（五）配疫苗：n1、灭活苗，加入灭火剂，阻滞剂，再加佐剂混合而成。n 2、冻干疫苗，加保护剂混合，分装冻干。83病毒性细胞疫苗的制造工艺流程健康动物（或胚胎）组织原料细胞悬液细胞悬液生长细胞病毒液病毒液配苗分装冻干冻干、扎盖帖签活疫苗基础种毒生产用种毒生产用种毒原料保护剂保护剂配制灭菌细胞培养液传代

33、细胞传代细胞灭活病毒液配苗（混匀、乳化乳化）分扎盖帖签装灭活疫苗检验原料佐剂佐剂配制灭菌灭活灭活检验配制培养收获84n六、寄生虫疫苗六、寄生虫疫苗n 是新发展的疫苗，临床主要用的有鸡球虫疫苗及原虫疫苗。大寄生虫因为抗原复杂，不可做疫苗。1.致弱疫苗虫体致弱，筛选天然弱毒虫株做疫苗。人工致弱：体内传代致弱，牛巴贝斯虫在犊牛传15代成弱毒。85 体外传代致弱，如艾美尔球虫通过鸡胚传代，牛泰勒虫是淋巴细胞传代致弱，还有放射线和药物致弱。2.抗原疫苗：大量提取寄生虫有效保护性抗原制成。寄生虫抗原苗：获取大量虫体-机械粉碎裂解-提取抗原浸出物-浓缩配苗。分子水平寄生虫疫苗；通过基因生物工程，获取大量纯化

34、的寄生虫功能抗原，制成疫苗。86第四节第四节 诊断用生物制品制造技术诊断用生物制品制造技术n 诊断剂；是利用微生物，寄生虫，及其代谢产物，及高免血清制成,用于鉴定微生物以及诊断动物传染病的试剂。分诊断抗原、诊断抗体和标记抗体三类，原理是根据抗原抗体特异反应。87n（一）诊断抗原：用已知抗原成分，来检测血清未知抗体的方法。n 1、凝集反应抗原：常见有鸡白痢、布氏、马流产，鸡支原体，猪萎鼻抗原。抗原是颗粒状，加被检查血清，如果反应，出现大颗粒或片状凝集。n 下面讲鸡白痢沙门氏菌全血平板抗原制备步骤；n鸡白痢沙门氏菌-固体平板培养2%甲醛生理盐水洗菌苔灭活离心沉淀比浊（100亿/ml-加结晶紫染色（

35、3/10000）-加10%甘油混匀即成。n 使用：取被检母鸡翅下静脉血一滴在玻璃板上，加一滴抗原搅和匀,310分钟出现凝集为阳性。88n 2、沉淀抗原：是可溶抗原（细菌浸出物，病毒），炭疽沉淀抗原、马立克氏抗原，法氏囊抗原等。n炭疽沉淀抗原：怀疑炭疽病料剪碎研磨1：10加入生理盐水煮半小时滤纸过滤-即成。n使用：将炭疽沉淀素加入直径0.5厘米试管-上面慢慢加入制备的沉淀抗原，3-10分钟，两液界面出现白色沉淀环沉淀。89n鸡法氏囊病抗原：取典型病变法氏囊数个称重剪碎研磨-加0.5%石炭酸生理盐水1：5量冻融三次高速离心取上清液即成。n使用：制备1%琼脂板（5%氯化钠液，加1%琼脂糖，煮3-5分

36、钟，倒平板）-在板上打梅花孔7个（孔间距离35mm，孔底火焰封底），中央孔加抗原，外周孔加不同稀释的抗体，30-371-3天观察，如果出现沉淀线，说明抗体的效价。特异线是内弯弧，非特异是外弯或直线。90n人医用非特异抗原，牛心肌浸出物，测定人血清梅毒抗体，是康氏反应。n 3、补体结合抗原（制备同凝集反应抗原）：因补体结合反应需57天时间，准备要5种材料，现很少使用。91n（二）变态反应抗原；兽医经常用测牛结核病，布氏病，马鼻疽。n 原理：是传染性变态反应，属迟发变态反应，多用于胞内细菌感染，寄生虫病测定；方法有滴眼、观察眼红肿流泪；皮内注射、观察皮肤增厚。n 布氏杆菌水解素：菌种固体表面培养0

37、.5%石炭酸生理盐水洗下离心洗涤浓缩高压灭菌水解蔡氏滤器过滤剀氏定氮0.40.5mg/ml。92n二、诊断抗体二、诊断抗体n有诊断血清和单克隆抗体血清，原理：已知血清+未知细菌-凝集为阳性。n诊断血清制备：用已知细菌疫苗-多次免疫兔子-取血清加0.5%石炭酸即成。n如沙门氏菌AF多价血清，可以检测97%范围的沙门氏菌，不可以定是什么群沙门氏菌，要用因子血清、H血清、VI血清才可以确定是什么血清的沙门氏菌。93n因子血清：是仅含某主要抗原的抗体血清。细菌有主要抗原和次要抗原，如沙门氏菌A群的甲型副伤寒菌，O抗原有1、2、12；B群的得尔俾沙门氏菌O抗原是1、4、12；它们两重复的抗原是1、12，

38、是次要抗原，单独有的O2，O4是主要抗原，可以区别它们。94n因子血清制备：用甲型副伤寒细菌免疫兔子多次取血清然后和B群得尔俾沙门氏菌混合凝集除去凝集颗粒和片（除去了O1、O12血清）剩下即只有O2的抗体血清。n一般血清为多克隆抗体，是多个不同B细胞产生的抗体，所以反应不准确。单克隆抗体是一个B细胞后代产生的纯一抗体。95n三、标记抗体三、标记抗体n 抗体经过标记后，增强了反应灵敏性和准确性；由于标记复杂，保质期短和使用少，多为买商品，一般单位不自己制备。n 常见有荧光抗体、酶标抗体和同位素抗体等。96n1)HRP（辣根过氧化物酶）标记抗体的方法：戊二醛二步法戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基

39、分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有24的酶与蛋白质结合。n2)荧光素标记抗体技术n荧光素主要有异硫氰酸荧光素(FITC)或罗达明（RB200)97n3)放射性同位素标记抗体技术n（一）氯胺T法：氯胺T法标记效率高、重复性好、试剂便宜易得，是目前使用最多的碘标记方法。n原理：氯胺T（Chloramine-T）是一种温和的氧化剂，在水溶液中产生次氯酸，可使碘阴离子氧化成碘分子。这活性碘可取代肽链上酪氨酸苯环上羟基位的一个或两个氢，使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。n（二）乳过氧化物酶法（LPO）n

40、本法反应温和，对抗原、抗体免疫活性影响小，已被广泛应用。缺点是标记率较低，一般为2040%。n原理此法是利用乳过氧化物酶（Lactoperoxidase）有促进微量过氧化氢对125I-的氧化作用，生成125I+，并标记在多肽、蛋白质酪氨酸分子上n（三）Iodogen碘化法：氯甘脲是70年代中期发展起来的蛋白质碘化试剂,在多肽激素标记中日益广泛采用。98免疫血清制造流程免疫血清制造流程一、动物的选择与管理一、动物的选择与管理二、免疫原二、免疫原三、免疫程序三、免疫程序四、血液的采集与血清提取四、血液的采集与血清提取五、几种重要畜禽用免疫血清、卵黄抗体的制备五、几种重要畜禽用免疫血清、卵黄抗体的制

41、备方法方法六、免疫血清及卵黄抗体使用注意事项六、免疫血清及卵黄抗体使用注意事项第六节第六节 治疗用生物制品的制造技术治疗用生物制品的制造技术991、免疫血清的概念、免疫血清的概念n又称又称高免血清、抗血清、免疫血清、被动免高免血清、抗血清、免疫血清、被动免疫制品疫制品。n利用病原微生物或其代谢产物等作为利用病原微生物或其代谢产物等作为免疫原免疫原，经过反复经过反复多次注射多次注射同一同一动物动物体，促使动物不断体，促使动物不断产生免疫应答，在产生免疫应答，在血清血清中含有大量对应的特异中含有大量对应的特异性抗体而制成。性抗体而制成。n分类（据免疫血清作用的对象不同）：分类（据免疫血清作用的对象

42、不同）：抗病抗病血清血清和和抗毒素抗毒素。1002、作用机理、作用机理n含有特异性的免疫球蛋白含有特异性的免疫球蛋白抗体抗体输入动物体后，输入动物体后，动物即可被动地获得抗体，从而形成免疫力，即所动物即可被动地获得抗体，从而形成免疫力，即所谓的谓的人工被动免疫人工被动免疫。当动物已感染某种病原微生物。当动物已感染某种病原微生物发生传染病时，注射大量抗病血清后，由于抗体的发生传染病时，注射大量抗病血清后，由于抗体的作用，可作用，可抑制动物体内的病原体继续繁殖抑制动物体内的病原体继续繁殖，并，并协助协助体内正常防御机能，消灭病原微生物体内正常防御机能，消灭病原微生物，使病畜逐渐，使病畜逐渐恢复健康

43、。恢复健康。n特点：具有很强的特异性，一种血清只对相应的特点：具有很强的特异性，一种血清只对相应的一种病原微生物或毒素起作用。一种病原微生物或毒素起作用。1013、应用、应用n用作紧急预防注射，通常是用作紧急预防注射，通常是在已经发生传染在已经发生传染病或受到传染病威胁的情况下使用病或受到传染病威胁的情况下使用。n优点：产生免疫力快，优点：产生免疫力快，n缺点：持续期短（一般仅缺点：持续期短（一般仅2323周）。周）。n目前生产较多的抗病血清有：目前生产较多的抗病血清有：破伤风抗毒素破伤风抗毒素、1024、免疫血清制造流程、免疫血清制造流程n动物的选择与管理动物的选择与管理免疫原的制备免疫原的

44、制备免疫程免疫程序序血液采集与血清提取血液采集与血清提取103一、动物的选择与管理一、动物的选择与管理（一）动物的选择（一）动物的选择1、动物的品种、动物的品种n用于制备免疫血清的动物有马、牛、山羊、绵用于制备免疫血清的动物有马、牛、山羊、绵羊、猪、兔、犬、鸡和鹅等。羊、猪、兔、犬、鸡和鹅等。用同种动物产生的称用同种动物产生的称同源血清同源血清，用异种动物生产的称用异种动物生产的称异源血清异源血清。104（1）制备抗菌和抗毒素血清多用异种动物制备抗菌和抗毒素血清多用异种动物，通，通常用马和牛等大动物制备。如破伤风抗毒素多常用马和牛等大动物制备。如破伤风抗毒素多用青年马制备，抗猪丹毒血清多用牛制

45、备。用青年马制备，抗猪丹毒血清多用牛制备。抗病毒血清的制备多用同种动物抗病毒血清的制备多用同种动物。如犬瘟。如犬瘟热血清用犬制备，抗猪瘟血清用猪制备。热血清用犬制备，抗猪瘟血清用猪制备。（2）制备免疫血清用马较多制备免疫血清用马较多，也可使用，也可使用多种动多种动物（如马、牛、羊三种动物）物（如马、牛、羊三种动物）制备一种抗毒素制备一种抗毒素血清。血清。（3）选定动物应）选定动物应有一定的数量有一定的数量，一个批次应用，一个批次应用多头动物。多头动物。1052、动物的年龄及健康情况、动物的年龄及健康情况（1 1）通常选择）通常选择体型较大、性情温驯、体制强健的体型较大、性情温驯、体制强健的青壮

46、年动物青壮年动物为宜。为宜。n马以年龄马以年龄3838岁、体重岁、体重350kg350kg以上者为宜；牛以以上者为宜；牛以310310岁、体重岁、体重300400kg300400kg以上为宜；猪以以上为宜；猪以50kg50kg以上，以上，年龄年龄612612月龄为宜；家兔体重需达月龄为宜；家兔体重需达2kg2kg以上为好。以上为好。（2 2）供制造免疫血清的动物，必须从）供制造免疫血清的动物，必须从非疫区非疫区选购，选购，经过严格检疫，并经隔离观察，每日测温两次，观经过严格检疫，并经隔离观察，每日测温两次，观察察2 2周以上，确认周以上，确认健康健康者方可应用。者方可应用。106（二）动物的管

47、理（二）动物的管理1 1、动物应在、动物应在隔离隔离条件下条件下饲养饲养，杜绝高免时强毒及发病，杜绝高免时强毒及发病时时散毒散毒。2 2、应、应详细登记详细登记每头动物的来源、品种、性别、年龄、每头动物的来源、品种、性别、年龄、体重、特征及营养状况、体温记录和检疫结果等，体重、特征及营养状况、体温记录和检疫结果等，建建立制造血清动物的档案立制造血清动物的档案，只有符合要求的动物才能投，只有符合要求的动物才能投入生产。入生产。3 3、加强日常饲养管理加强日常饲养管理，给适量的食盐和含钙的补充饲，给适量的食盐和含钙的补充饲料。料。1074 4、在高度免疫和采血期间，每日要检测体温两次，、在高度免疫

48、和采血期间，每日要检测体温两次，随时随时观察其健康情况观察其健康情况。每日至少运动每日至少运动4h4h。动物。动物采采血前血前1d1d禁食喂水禁食喂水，避免血中出现乳糜。，避免血中出现乳糜。5 5、在生产过程中，若发现健康状况异常或有患病、在生产过程中，若发现健康状况异常或有患病可疑时，应停止注射抗原和采血，并进行隔离治可疑时，应停止注射抗原和采血，并进行隔离治疗。疗。108二、免疫原二、免疫原（一）免疫原的基本要求（一）免疫原的基本要求n一般来说，一般来说，颗粒性抗原颗粒性抗原较可溶性抗原的抗原性较可溶性抗原的抗原性强，聚合状态的蛋白质较单体状态的蛋白质免疫强，聚合状态的蛋白质较单体状态的蛋

49、白质免疫原性强。相对分子质量较小和抗原性较低的蛋白原性强。相对分子质量较小和抗原性较低的蛋白质应吸附于载体上，才可获得较高的免疫原性。质应吸附于载体上，才可获得较高的免疫原性。n异物性、结构的复杂性、分子量大、一定的物异物性、结构的复杂性、分子量大、一定的物理性状。理性状。109（二）免疫原的制备（二）免疫原的制备1 1、抗细菌免疫血清制备、抗细菌免疫血清制备n基础免疫基础免疫用抗原多为用抗原多为疫苗疫苗或或死菌死菌，而，而高度免疫高度免疫的的抗原，一般选用抗原，一般选用毒力较强的毒株毒力较强的毒株。多价抗病血清多价抗病血清用的抗原用的抗原，要求用，要求用多血清型多血清型菌株菌株。细菌抗原：培

50、养细菌抗原：培养洗菌苔洗菌苔离心离心计数计数稀释为稀释为含菌含菌100100亿亿/毫升毫升灭活（水浴灭活（水浴802h802h或加或加0.4%0.4%甲甲醛醛372448h372448h）。）。1102 2、抗病毒免疫血清制备、抗病毒免疫血清制备n以病毒为免疫原，须通过以病毒为免疫原，须通过反复冻融或超声裂解反复冻融或超声裂解方法，将方法，将病毒从细胞中释放出来，并尽可能地提高病毒滴度和免疫病毒从细胞中释放出来，并尽可能地提高病毒滴度和免疫原性。原性。n如抗猪瘟血清，基础免疫的抗原，可用猪瘟兔化如抗猪瘟血清，基础免疫的抗原，可用猪瘟兔化弱毒弱毒疫疫苗；高度免疫抗原，则用猪瘟血毒或脏淋毒乳剂等苗