医学课件-Promega-双萤光素酶报告基因教学课件.ppt

1、Report Smartly萤光素酶报告基因技术自然界的萤光自然界的萤光发光海星发光甲壳虫发光真菌发光真菌发光节虫发光节虫自然界的萤光自然界的萤光发光鱼发光甲虫自然界的萤光自然界的萤光萤火虫报告基因的作用报告基因的作用 细胞信号转导途径 启动子/增强子 受体结合 病毒/细胞相互作用 转录因子 药物诱导作用或”效果”荧光 -Fluorescence萤光 -LuminescenceFireWormLuminescence vs.Fluorescence萤光（Bioluminescence）荧光（Fluorescence）q是化学发光（Chemilumi-nescence）的一种，激发能量来自化学反

2、应q 吸收来自光源的光，再发射 另一光子q萤光发光计（Luminometer）q 荧光计（Fluorometer）液闪仪（Scintilation Counter）电荷耦合装置光学成像系统（CCD opitical imaging system）荧光显微镜各种报告基因的优点和缺点各种报告基因的优点和缺点报告基因优点缺点萤光素酶优越的灵敏度高信号值无内源活性需要底物-gal灵敏度好细菌，血清等内源活性高需要底物GUS（葡糖醛酸糖苷酶）灵敏度好植物中内源活性低 90%的 E.coli,人动物细胞中有内源活性酶的扩散可引起“过度报告”需要底物SEAP（分泌性碱性磷酸酶）分泌性报告基因(不需裂解)在

3、HeLa,癌 和其它细胞类型中有高的内源活性需要底物CAT（氯霉素转乙酰基酶）-真核细胞没有背景表达-易于使用-设备现成(液闪仪,层析)放射性的灵敏度底50半衰期GFP（绿色荧光蛋白）显微镜:亚细胞定位不需底物背景可能高折叠“情形”可导致信号差别萤光素酶报告基因的主要优点萤光素酶报告基因的主要优点 非放射性非放射性 检测快检测快（比（比CAT等）等）灵敏度高灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍）半衰期短半衰期短（在理想条件下，可检测到（在理想条件下，可检测到10-20 摩尔的萤光素酶分摩尔的萤光素酶分子。在哺乳动物细胞中半衰期子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰期小时，在植物

4、细胞中半衰期3.5小时。而小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时）小时）线形范围广线形范围广（在（在10-16 M(10pg/L)至至10-8 M(1mg/L)范围内范围内,光光强度与萤光素酶浓度成正比）强度与萤光素酶浓度成正比）一般比显微镜检测的荧光更灵敏一般比显微镜检测的荧光更灵敏(对多孔板而言对多孔板而言)生物萤光比荧光更稳定生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发射因为自然界进化的酶能保护光子发射器器 通过基因工程可以延伸生物萤光的性能通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力萤光素酶报告基因的使用萤光素酶报告基因的使用 原理:制备含有 l

5、uc/Rluc 的DNA 转染 提供刺激 测量萤光调节序列Luc在活细胞中做报告基因检测在活细胞中做报告基因检测外界刺激(导引物)萤光素酶基因蛋白质折叠调节序列加工转录转录因子信号转导翻译反义 RNA受体蛋白-蛋白相互作用RNA 酶病毒感染和增殖RNAi 抑制启动子启动子/增强子分析增强子分析“碰撞启动子碰撞启动子”:1)全序列全序列:2)逐步缺失逐步缺失:Promoterluc+LightPromoterluc+LightPromoterluc+Firefly and Renilla萤火虫生物萤光的化学萤火虫生物萤光的化学萤光素萤光素 +ATP +O2萤光素酶萤光素酶Oxyluciferin

6、 +AMP+PPi +CO2 +Light萤光素酶萤光素酶:单体单体,61,000 Daltons辅辅-底物底物:ATP.Mg 2+萤光素萤光素:Mg2+海肾萤光素酶反应海肾萤光素酶反应Coelenterazine +O2萤光素酶萤光素酶Coelenteramide+CO2 +Light萤光素酶萤光素酶:单体单体,36,000 Daltons萤光素萤光素:(Coelenterazine)Enzyme structuresFireflyRenilla为什么要使用双报告基因为什么要使用双报告基因报告基因 A(首要信号)报告基因 B(第二信号)特异生物学反馈+非特异生物学反馈非特异生物学反馈检测结果

7、比较首要与第二信号确定 特异生物学反馈细胞可能有内源脱乙酰基酶-Gal 或 GUS 活性.CAT,-Gal 和 GUS 检测是终点检测.不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或-Gal,的两个报告基因的检测都灵敏而快速传统的双报告基因的缺点传统的双报告基因的缺点双萤光素酶报告基因系统比用双萤光素酶报告基因系统比用CAT和和-Gal做内对照做内对照的优点的优点 速度 样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内完成 灵敏 两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内源萤光素酶背景极低 方便 一管完成检测，样品不必分份实验质粒对照质粒用海肾萤光素酶作对照归一实验变化归一反应=对照的（海肾萤

8、光素酶)实验的(萤火虫萤光素酶)萤火虫萤光素酶海肾萤光素酶用两个萤光素酶做报告基因用两个萤光素酶做报告基因（萤火虫（萤火虫+海肾）海肾）数据处理举例数据处理举例第一天萤光素酶活性(RLU)比率 归一的活性样品处理重复（F:R)变化倍数对照 5,128 2,511 7,553 3,815 10,555 5,413 7,745 3,913 1.981.00处理 5,1376 4,467 40,712 3,574 88,787 7,654 6,0292 5,232 11.525.82处理B1 587,635 5,1442 988,347 8,8323 409,881 3,564 661,954 5,

9、847 113.2157.18第二天对照15,529 20,433 0.76 21,897 30,841 0.71 10,760 13,620 0.79 16,062 21,631 0.741.00处理 850,239 20,843 578,951 14,830 943,873 21,788 791,021 19,154 41,3055,81处理D 1 14,865 19,3-052 8,967 12,2843 13,767 20,246 12,533 17,278 0.730.99 活性倍数(F/R)样品 =F/R)对照第二天处理计算如下：活性倍数 (791,021/19,154)=（16,

10、062/21,631)=55.81GloMax 20/20Single tube luminometerGloMax 96 luminometerWhite microplates for luminescencePromega公司出品的双报告基因实验公司出品的双报告基因实验产品产品 质粒 萤火虫萤光素酶质粒 海肾萤光素酶质粒 叩头虫萤光素酶质粒 检测系统 非均质双报告基因检测系统（通量较低）均质的双报告基因检测系统（适合高通量，自动化）载体-萤火虫萤光素酶载体pGL3 家族家族pGL3-BasicpGL3-ControlpGL3-EnhancerpGL3-PromoterpGL3-Basic

11、 MappGL3-Control MappGL3-Enhancer MappGL3-Promoter Map辅助报告基因的相对萤光单位辅助报告基因的相对萤光单位(RLU)启动子交叉交谈或互相干扰启动子交叉交谈或互相干扰 实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节 内对照载体可能存在的问题内对照载体可能存在的问题 载体载体-海肾萤光素酶报告基因载体海肾萤光素酶报告基因载体第二代第二代第一代第一代phRL-null pRL-nullphRL-TK pRL-TK phRL-TK(int-)phRL-SV40 pRL-SV40phRL-CMV pRL-CMVphRG-Bp

12、hRG-TKRenillaRenilla 萤光素酶载体系列萤光素酶载体系列内含子T7 启动子CMV即时早期增强子/启动子phRL-CMV HSV TK 启动子phRL-TKSV40 晚poly(A)SV40 早期 增强子/启动子phRL-SV40MCSphRL-nullhRL 基因 TK 启动子phRL-TK(Int-)MCSphRG-B合成 poly(A)信号转录停止位点三个读码框的终止密码子phRG-TK合成 poly(A)信号转录停止位点三个读码框的终止密码子TK 启动子hRL 基因SV40 晚 poly(A)RenillaRenilla 萤光素酶载体系列萤光素酶载体系列用萤火虫和海肾两

13、个萤光素酶做报告用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因基因 Dual-Luciferase 双萤光素酶报告基因系统（非均质检测）E1910，100次 E1960，E1980，1000次 Dual-GloTM 萤光素酶检测系统（均质检测）E2920，10ml E2940，100ml EE2980，10X100ml均质检测与非均质检测均质检测与非均质检测发光细胞+培养基添加试剂细胞+培养基除去培养基发光清洗细胞裂解细胞添加试剂均质检测非均质检测Dual-Luciferase报告基因检测系统报告基因检测系统组分组分 检测缓冲液II 底物（冻干粉）Stop&Glo缓冲液 Stop&Glo底物,50X 被

14、动裂解液,5XDual-Luciferase报告基因检测步骤报告基因检测步骤 裂解细胞 被动裂解 除去培养基.PBS洗.加1XPLB,振荡15分钟.检测 主动裂解 除去培养基.PBS洗.在1XPLB中刮下细胞.细胞转移到试管或小瓶中.1-2次冻融.检测 检测双萤光素酶检测方案双萤光素酶检测方案 1 支试管 2 步检测30 秒钟LuciferaseAssay Reagent IIPassive lysis bufferStop&Glo ReagentDLRTM For HTSDLR双报告基因检测系统应用双报告基因检测系统应用举例举例黑色素刺激激素黑色素刺激激素(-MSH)对由人酪氨酸酶启动子增对

15、由人酪氨酸酶启动子增强子控制的萤光素酶的表达的诱导强子控制的萤光素酶的表达的诱导(Promega eNotes)目的：目的：监测细胞对-MSH诱导的应答 材料：材料：实验载体：pGL3-Try14A:人酪氨酸酶启动子增强子Luc(+)阳性对照：pGL3-Control阴性对照：pGL3-Basic内对照：pRL-SV40B16-F1细胞（鼠黑素瘤细胞系CRL-6323)DLR 双萤光素酶检测试剂盒 步骤步骤前一天：接种细胞，六孔板X3第二天：共转染：pGL3-Try14A和pRL-SV40（分成两组）pGL3-Control和 pRL-SV40pGL3-Basic和 pRL-SV40裂解细胞，

16、测量萤光Dual-Glo萤光素酶检测系统萤光素酶检测系统检测特点检测特点均质检测，为高通量检测而设计均质检测，为高通量检测而设计萤光信号稳定，萤光信号稳定，2hrs内检测内检测自发萤光低于检测水平自发萤光低于检测水平Dual-Glo Assay:同一样品中检测两种萤光信号同一样品中检测两种萤光信号Stable luminescence signals for both reporters(t1/2 3.5 hrs.)10,000-fold signal separation between the firefly and Renilla bioluminescencePrimary repor

17、ter:Firefly bioluminescenceSecondary reporter:Renilla bioluminescenceCells in culture mediumAdd fireflyassay reagentAdd combination firefly quench reagent&Renilla assay reagentDual-Glo assay-选择性淬灭萤火虫萤光Selective quench of firefly luminescenceDual-Glo萤光素酶检测系统萤光素酶检测系统试剂盒组成 Dual-Glo萤光素酶缓冲液 Dual-Glo萤光素酶底

18、物（冻干粉）Dual-GloStop-Glo缓冲液 Dual-GloStop-Glo底物操作步骤操作步骤 试剂制备简单试剂制备简单 将Dual-Glo 萤光素酶缓冲液倒入 Dual-Glo 萤光素酶底物中 用Dual-Glo Stop&Glo 缓冲液按1:100 稀释 Dual-Glo Stop&Glo 底物 所有的缓冲液存于室温,所有的底物存于 20C 两步加入试剂两步加入试剂:加加,读读,加加,读读 10,000 倍信号分离倍信号分离(淬灭淬灭)用两个萤光素酶做报告基因用两个萤光素酶做报告基因Chroma-LucTM载体Chroma-Glo检测试剂E.Coli 表达的表达的Chroma-L

19、ucTM 基因基因Chroma-LucTM 基因和载体基因和载体三个基因三个基因:1.CBRluc 发红光的萤光素酶发红光的萤光素酶2.CBG99luc 发绿光的萤光素酶发绿光的萤光素酶99.0%DNA 相同于相同于 CBRluc 3.CBG68luc-发绿光的萤光素酶发绿光的萤光素酶68.9%DNA相同于相同于 CBRluc两种载体骨架两种载体骨架:1.对照对照 置换了置换了 pGL3-Control 的的luc+(pCBR-Control,pCBG68-Control,and pCBG99-Control)2.Basic 置换了置换了 pGL3-Basic 的的luc+(pCBR-Basi

20、c,pCBG68-Basic,and pCBG99-Basic)合成的合成的 Chroma-LucTM 萤光素酶载体萤光素酶载体骨架骨架ControlBasicEnhancerChroma-LucTM 基因SV40 启动子启动子SV40 增强子增强子SV40 增强子增强子(合成的或天然的基因)Chroma-LucTM 基因Chroma-LucTM 基因Chroma-Glo 检测的化学检测的化学Luciferin +ATP +O2LuciferaseOxyluciferin +AMP+PPi +CO2 +LightLuciferase:Monomeric,61,000 DaltonsCo-sub

21、strates:ATP.Mg 2+Luciferin:不同颜色，同样试剂？不同颜色，同样试剂？C2 C2旋转，较少能量，红光不旋转，较多能量,黄绿光 Chroma-LucTM 萤光素酶滤光片选择萤光素酶滤光片选择020406080100120450500550600650700Wavelength(in nm)Percent of maximum luminescenceCBG68lucCBG99lucCBRluc510/60nm610nm Long passChroma-Glo 检测的特点检测的特点 为高通量检测设计，检测为高通量检测设计，检测96-、384-孔板孔板 均质检测均质检测 需要

22、带滤光片的萤光发光计需要带滤光片的萤光发光计pGL4:A New Family of Reporter VectorsNext generation reporter vectors(pGL4)Improved Reporter PerformanceImproved Expression of luc2Provides 5-10 x higher expression than luc+in mammalian cellsLarge reduction of consensus sites where inappropriate interactions with host may occu

23、rSites removed from vector,reporter genes,and selectable markers:Restriction sitesVertebrate TF binding sitesPromoter modulesEukaryotic splice acceptor and donor sitesEukaryotic poly A sitesKozak sequencesReduction in Consensus Binding SitesIncreased Response Using Rapid Response LuciferasesCompared

24、 to regular luciferase,Rapid Response luciferases gave higher induction in shorter time.Induction at 3h19279150为什么需要快速反应萤光素酶基因？（现存报告基因的缺点）研究者想要报告基因应答与细胞事件在时间上更快地耦联在时间上更快地耦联需要需要更强的应答更强的应答较长的敷育时间可能导致检测到次级效应次级效应(假阳性假阳性)Rapid ResponseTM 报告基因技术报告基因技术(不稳定的萤光素酶基因)细胞内报告基因池信号信号新表达的新表达的报告基因报告基因为什么快速应答的报告基因应答性

25、更强为什么快速应答的报告基因应答性更强?快速应答快速应答非非-快速应答快速应答新表达的新表达的报告基因报告基因信号信号基于报告基因稳定性的动力学模型基于报告基因稳定性的动力学模型pGL4 Rapid Response Reporters Gene DesignVectorGeneDesignpGL4.10 luc2luc2pGL4.11 luc2Pluc2PpGL4.12 luc2CPluc2CPpGL4.70 hRluchRlucpGL4.71 hRlucPhRlucPpGL4.72 hRlucCPhRlucCPluc2hRlucluc2hPESTluc2hCL1hPESThRluchPES

26、ThRluchCL1hPEST快速应答报告基因的设计快速应答报告基因的设计 蛋白降解序列蛋白降解序列 来自PEST鼠鸟氨酸脱羧酶的序列(40 aa)来自酵母CL1 序列(18 aa)RNA 降解序列降解序列 根据saimiri疱疹病毒小核 RNA合成的富 AU 因子(ARE)萤光素酶基因萤光素酶基因 为哺乳动物细胞表达优化了密码子 优化了翻译起始序列(如,Kozak 序列)缺失了多数已知的转录因子保守结合位点序列New Multiple Cloning RegionpGL4 载体载体系列的优势系列的优势 Codon optimized for more efficient expression

27、 in mammalian cells Better signal-to-background ratios Greater response dynamics by reducing intracellular stability of the reporter(two versions)Removal of consensus binding sites to reduced likelihood of unintended interactions with host transcription factors Inclusion of selectable markers and ab

28、ility to readily transfer DNA inserts between vectorsNSSNCOOH+ATPLuciferaseLightHO驾御生物萤光的化学驾御生物萤光的化学鞘翅目昆虫生物萤光(萤火虫,叩头虫,)LuciferaseLightNNHONHOOH珊瑚虫生物萤光(海肾)报告基因报告基因Steady-GloBright-GloDual-GloChroma-GloEnduRenATP 检测检测CellTiter-GloBacTiter-GloKinase-Glo偶联萤光素偶联萤光素Caspase-GloP450-GloBeta-Glo联系我们联系我们 ,全部产品信息,操作手册,技术资料,网上工具 ,大部分产品介绍和价格,少量中文说明书,中文资料 E-mail: 免费电话:800 810 8133Precision Designfor Life Thanks !