灭菌与除菌优选课件.pptx

1、现代发酵技术现代发酵技术v完整发酵生产工艺流程完整发酵生产工艺流程:（1 1）原料的选择和预处理）原料的选择和预处理（2 2）微生物菌种的选育和种子扩大培养）微生物菌种的选育和种子扩大培养（3 3）培养基的配制和灭菌）培养基的配制和灭菌（4 4）无菌空气的制备）无菌空气的制备（5 5）发酵）发酵（6 6）产物的分离提取）产物的分离提取（7 7）产物的精制干燥）产物的精制干燥（8 8）废物的回收利用。）废物的回收利用。现代发酵技术现代发酵技术一、经济上巨大损失；一、经济上巨大损失；消耗营养；消耗营养；分解产物；分解产物；抑制产生菌生长；抑制产生菌生长；产物合成下降；产物合成下降；影响提取；影响提

2、取；影响产品外观及内在质量；影响产品外观及内在质量；扰乱生产秩序，破坏生产计划扰乱生产秩序，破坏生产计划,影响工人的情绪和生产影响工人的情绪和生产积极性。积极性。现代发酵技术现代发酵技术二、生产危害；二、生产危害；v 杂菌使生产菌菌体自溶杂菌使生产菌菌体自溶 产生大量泡沫，影响发酵过程的通气搅拌，造成逃液；产生大量泡沫，影响发酵过程的通气搅拌，造成逃液；发酵液发粘，过滤时不能或很难形成滤饼，过滤困难。发酵液发粘，过滤时不能或很难形成滤饼，过滤困难。v 染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。杂质。采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极

3、易发生乳化，很难采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。现代发酵技术现代发酵技术v 谷氨酸发酵过程中混入放线菌，则放线菌分泌的抗生素谷氨酸发酵过程中混入放线菌，则放线菌分泌的抗生素就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡；就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡；v 染芽孢杆菌，芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会染芽孢杆菌，芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。反复染菌。v 青霉素发酵染菌青霉素发酵染菌 绝大多数杂菌都能被青霉素诱导而产生绝大多数杂菌都能被青霉素诱导而产生青霉素酶青霉素酶；不论在发酵前期、中期或后期，染有能产

4、生青霉素酶不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。现代发酵技术现代发酵技术v消除杂菌要求：消除杂菌要求：培养基灭菌培养基灭菌 发酵罐及附属设备灭菌发酵罐及附属设备灭菌 空气灭菌空气灭菌现代发酵技术现代发酵技术v定义：定义：灭菌灭菌：指用化学或物理方法杀灭或除掉物料及设备中：指用化学或物理方法杀灭或除掉物料及设备中所有生命体的工艺过程，包括微生物的营养体和芽孢。所有生命体的工艺过程，包括微生物的营养体和芽孢。消毒消毒：用物理化学方法杀死环境中的病源微生物。：用物理化学方法杀死环境中的病源微生物。现代发酵技术现代发酵技术v分类分类

5、加热灭菌加热灭菌 化学药品灭菌化学药品灭菌 辐射灭菌辐射灭菌 过滤除菌过滤除菌培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，在加热下氨基酸及维生素等受破坏。（二）连续灭菌(连消）影响产品外观及内在质量；各种机理各自所作贡献的大小：一般认为惯性冲击截留、拦截滞留截留和布朗运动截留的作用较大，而重力和静电引力的作用则很小。营养成分的破坏灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程，保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。设计合理的空气预处理设备，选择合适的空气净化流程，以达到除油、水和杂质的目的。培养基的物理状态：液体培养基中除热的传道传递外，还有对流，所以比较容易灭菌，

6、而固体则比较难于灭菌。培养基的物理状态：液体培养基中除热的传道传递外，还有对流，所以比较容易灭菌，而固体则比较难于灭菌。1、设立吸气口：510米，宜在郊区或农村建场；而细菌的芽孢最耐热，一般要在120下处理15min才能杀死。t总=t1+t2+t3氧气、氮气、二氧化碳、（1）连消塔加热灭菌的连续灭菌流程干热与湿热穿透力及灭菌效果比较6、加热：3035（相对湿度60）；四、臭氧灭菌无污染消毒剂2、压缩前过滤：粗过滤器（油浸铁丝网），减少空气压缩机的磨损，减轻介质负荷；在恒定灭菌温度下，对某一种微生物而言k可为常数，对两边积分，得对数残留定律公式：dN/dT=kN1、分批灭菌（实罐灭菌)现代发酵技

7、术现代发酵技术原理原理：干燥高温条件加快使蛋白变性，：干燥高温条件加快使蛋白变性，致死率增高；致死率增高；适用：适用：耐高温、需保持干燥的器皿、器械耐高温、需保持干燥的器皿、器械分类：分类：火焰灭菌；干热灭菌。火焰灭菌；干热灭菌。干热灭菌干热灭菌 原理原理：蒸汽的穿透力；潜热；使蛋白变性。：蒸汽的穿透力；潜热；使蛋白变性。适用：适用：培养基、发酵罐体、附属设备等培养基、发酵罐体、附属设备等分类分类：煮沸灭菌法；巴氏灭菌；间歇灭：煮沸灭菌法；巴氏灭菌；间歇灭 菌；高压蒸汽灭菌等。菌；高压蒸汽灭菌等。湿热灭菌湿热灭菌现代发酵技术现代发酵技术火 焰 灼 烧 法烘 箱 热 空 气 灭 菌 法干 热 灭

8、 菌 法巴 氏 消 毒 法煮 沸 消 毒 法间 歇 灭 菌 法高 压 蒸 汽 灭 菌 法湿 热 灭 菌（消 毒）法高 温 灭 菌（消 毒）法现代发酵技术现代发酵技术干热灭菌干热灭菌v 1.1.干热灭菌法干热灭菌法:将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在内，在150150170170下维持下维持1 12 2小时后，即可达到彻底灭菌的小时后，即可达到彻底灭菌的目的。目的。v 在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。燥，以及各种细胞成分发生氧化。v 灼烧，是一种最彻底的干

9、热灭菌方法，但它只能用于接种灼烧，是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。环、接种针等少数对象的灭菌。湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。dN/dT=kN适用：洁净室及净化设备在接近纤维时，气流碰到纤维而受阻，空气就改变运动方向绕过纤维继续前进。2）以微孔滤纸、滤板、滤棒构成的过滤器。在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。保证进口空气清洁度，减少进口空气的含菌数。在气流速度在临界速度以下，由于速度很低时，在纤维周边形成一层边界滞留区，在滞留区内气流速度更慢，在滞留区内的颗粒缓慢接近纤维，并与之接触，由于摩擦、粘着作用而被滞留，

10、这种作用称为阻截作用。高空采风无油润滑空气压缩贮罐冷却一次过滤二次过滤进入发酵罐而细菌的芽孢最耐热，一般要在120下处理15min才能杀死。不同微生物的耐热性不同，细菌芽孢最强，营养体最弱，放线菌、霉菌比细菌营养体要强。高空采风无油润滑空气压缩贮罐冷却一次过滤二次过滤进入发酵罐1、分批灭菌（实罐灭菌)例如，大肠杆菌在水中加热6065便死亡，在10%糖液中，需7046min，在30%糖液中7030min。适用：培养基、发酵罐体、附属设备等因此对数穿透定律是指在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残留活菌数的减少而递减，也就是说微生物的死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成正比。而细菌的芽孢最耐热，一

11、般要在120下处理15min才能杀死。适用：洁净室及净化设备发酵液发粘，过滤时不能或很难形成滤饼，过滤困难。以lgk对1T标绘得一直而细菌的芽孢最耐热，一般要在120下处理15min才能杀死。培养基中的颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。现代发酵技术现代发酵技术v湿热灭菌法比干热灭菌法更有效湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。v多数细菌和真菌的营养细胞在多数细菌和真菌的营养细胞在6060左右处理左右处理5 510 10minmin后即可杀死；后即可杀死；v酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用8080以上的以上的温度处理才能杀死；温度处理才能杀死；v而细菌的芽孢最耐热，一般要

12、在而细菌的芽孢最耐热，一般要在120120下处理下处理15 15minmin才能杀死。才能杀死。现代发酵技术现代发酵技术温度温度()时间时间(小时小时)透过布层的温度透过布层的温度()灭菌灭菌20层层40层层100层层干热干热130-1404867270.5不完全不完全湿热湿热105.3310l10l10l完全完全现代发酵技术现代发酵技术蛋白含水量蛋白含水量(%)30min内凝固所需温度内凝固所需温度()50562574-801880-9061450160-170现代发酵技术现代发酵技术蒸汽压力蒸汽压力 (大气压大气压)压压 力力 表表 读读 数数 (kg/cm(kg/cm2 2)蒸汽温度蒸汽

13、温度()()1.001.001.251.251.501.501.751.752.002.002.502.503.00 3.00 0.000.000.250.250.500.500.750.751.001.001.501.502.00 2.00 100.0100.0107.0107.0112.0112.0115.0115.0121.0121.0128.0128.0134.5 134.5 现代发酵技术现代发酵技术 煮沸灭菌法煮沸灭菌法 巴氏灭菌巴氏灭菌 间歇灭菌间歇灭菌 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌现代发酵技术现代发酵技术v 煮沸灭菌法煮沸灭菌法：100100下保持下保持15-2015-20分钟，一般

14、不能杀死芽分钟，一般不能杀死芽孢孢。v 巴氏消毒法巴氏消毒法是一种低温消毒法是一种低温消毒法v 低温：低温：60-6260-62下保持下保持3030分钟可进行牛奶消毒；分钟可进行牛奶消毒；v 高温：高温：7272下保持下保持15 15分钟即可。分钟即可。现代发酵技术现代发酵技术v 间歇灭菌法间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。耐热培养基的灭菌。v 方法是：方法是：将待灭菌的培养基在将待灭菌的培养基在8080100100下蒸煮下蒸煮15 156060分钟，分钟，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或以杀死其中所有微生物

15、的营养细胞，然后置室温或3737下下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复保温过夜，如此连续重复3 3天，即可在较低温度下达到彻天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。底灭菌的效果。现代发酵技术现代发酵技术v盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽后将锅密闭，再继续加热至尽后将锅密闭，再继续加热至121121维持维持15 152020分分钟，也可采用在较低的温度钟，也可采用在较低的温度115115下维持下维持3030分钟的分钟的方法。方法。v此法适合于一切微生物学实

16、验室、医疗保健机构此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。现代发酵技术现代发酵技术注意事项：注意事项：排净冷空气；排净冷空气；灭菌终了，缓灭菌终了，缓慢降压；慢降压；灭菌结束，趁灭菌结束，趁热取出物品。热取出物品。现代发酵技术现代发酵技术v在发酵行业里也称在发酵行业里也称“连消法连消法”。此法只在大规模。此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。的发酵工厂中作培养基灭菌用。v主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基加热、

17、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在一般在135135140140下处理下处理5 515 15秒钟。秒钟。现代发酵技术现代发酵技术v高温短时间灭菌高温短时间灭菌 高压蒸汽灭菌能有效地杀灭杂菌，也能破坏营养成分；高压蒸汽灭菌能有效地杀灭杂菌，也能破坏营养成分；热的作用下，某些营养还相互发生反应，甚至生成毒物：热的作用下，某些营养还相互发生反应，甚至生成毒物：灭菌中，温度升高，菌体死亡速率的增加远大于营养成灭菌中，温度升高，菌体死亡速率的增加远大于营养成分破坏的增加。分破坏的增加。例如，大肠杆菌在水中加热6065便死亡，在10%糖液中，需7046min，在30%糖液中7030min。（2）灭

18、菌程度即残留菌数，如果要求完全灭菌，即Ns0，则t接近于无穷大，这在事实上是不可能的。1、分批灭菌（实罐灭菌)设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。当温度低于35时即可接种发酵。提高过滤除菌效率的措施影响产品外观及内在质量；2、典型的空气除菌流程很多微生物都带电荷（譬如枯草芽孢杆菌孢子中20带正电荷，15带负电荷）；培养基成分受热破坏是化学分解反应，符合一级动力学反应，可用下式表示：t打开温度控制器的电源开关。巴氏消毒法是一种低温消毒法2、典型的空气除菌流程营养成分的破坏灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程，保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。适用：培养基

19、、发酵罐体、附属设备等12%的NaCl溶液对微生物有保护作用。4、冷却：一级空气冷却：4050，此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。6、加热：3035（相对湿度60）；实际生产中取N2为0.扰乱生产秩序，破坏生产计划,影响工人的情绪和生产积极性。提高过滤除菌效率的措施现代发酵技术现代发酵技术v紫外线、紫外线、X X射线等。射线等。原理：高能量的电磁辐射和微粒辐射使核酸、蛋白质原理：高能量的电磁辐射和微粒辐射使核酸、蛋白质和酶变性；和酶变性；适用：表面、局部空间适用：表面、局部空间现代发酵技术现代发酵技术v甲醛、苯酚、高锰酸钾、洁尔灭等。甲醛、苯酚、高锰酸钾、洁尔灭等。原理：蛋白质变性；酶

20、失活；破坏细胞膜透性。原理：蛋白质变性；酶失活；破坏细胞膜透性。适用：厂房、无菌室、器具等的消毒。适用：厂房、无菌室、器具等的消毒。现代发酵技术现代发酵技术v原理：利用臭氧的氧化作用灭菌；原理：利用臭氧的氧化作用灭菌；v适用：洁净室及净化设备适用：洁净室及净化设备现代发酵技术现代发酵技术v醋酸纤维、尼龙、聚丙烯等。醋酸纤维、尼龙、聚丙烯等。原理：微孔滤膜；原理：微孔滤膜；适用：热敏性物质、空气。适用：热敏性物质、空气。现代发酵技术现代发酵技术灭菌方法灭菌方法湿热灭菌湿热灭菌v一一 培养基灭菌条件培养基灭菌条件 1.1.灭菌温度和时间的选择灭菌温度和时间的选择 2 2 影响培养基灭菌效果的因素影

21、响培养基灭菌效果的因素v二、发酵培养基的灭菌二、发酵培养基的灭菌（一）分批灭菌（一）分批灭菌（二）连续灭菌（二）连续灭菌现代发酵技术现代发酵技术现代发酵技术现代发酵技术va.a.微生物的热致死温度微生物的热致死温度应高于该温度应高于该温度,通常以芽孢为准。通常以芽孢为准。vb.b.营养成分的破坏营养成分的破坏灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程，保证灭菌灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程，保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。v应采用应采用高温短时高温短时 灭菌灭菌现代发酵技术现代发酵技术v1 1、灭菌时间的确定、灭菌时间

22、的确定 在一定温度下，微生物热死遵循分子在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论。因此对数穿透定律是指反应速度理论。因此对数穿透定律是指在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残留活菌数的减少而递减，也就少量随残留活菌数的减少而递减，也就是说微生物的死亡速率与任一瞬间残存是说微生物的死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成正比。的活菌数成正比。dN/dT=kNdN/dT=kN现代发酵技术现代发酵技术v一级反应动力学一级反应动力学v dN/dT=kNdN/dT=kNv N N残留的活菌数残留的活菌数v K-K-灭菌死亡速率常数灭菌死亡速率常数,S,S-1-1或或mi

23、nmin-1-1v T-T-灭菌时间，灭菌时间，s s或或minmin现代发酵技术现代发酵技术v 在恒定灭菌温度下，对某一种微生物而言在恒定灭菌温度下，对某一种微生物而言k k可为常数，可为常数，对两边积分，得对数残留定律公式：对两边积分，得对数残留定律公式：dN/dT=kNdN/dT=kN现代发酵技术现代发酵技术例例1：有一发酵罐内装：有一发酵罐内装40m3培养基，在培养基，在121温度下进行实罐灭菌。温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每原污染程度为每1ml有有2105个耐热细菌芽孢，个耐热细菌芽孢，121时灭菌速度常时灭菌速度常数为数为1.8min-1。求灭菌失败机率为。求灭菌失败机率为0.

24、001时所需要的灭菌时间时所需要的灭菌时间t。解解:N0=4010106 62 210105 5=8=810101212(个个)Nt=0.001(个个)k=1.8min-1则则:灭菌时间灭菌时间现代发酵技术现代发酵技术v 应注意的问题：应注意的问题：（1 1）灭菌时间取决于污染程度）灭菌时间取决于污染程度(N(N0 0)灭菌灭菌程度程度(N(Ns s)；（；（2 2）灭菌程度即残留菌数，如果要求完全灭）灭菌程度即残留菌数，如果要求完全灭菌，即菌，即N Ns s0 0，则，则t t接近于无穷大，这在事实上是不可能接近于无穷大，这在事实上是不可能的。故在工程上进行灭菌设计时常以的。故在工程上进行灭

25、菌设计时常以N Ns s10 103 3。也就是。也就是每处理每处理10001000批培养基只允许一次失败作为计算的依据。批培养基只允许一次失败作为计算的依据。（3 3）灭菌速率常数）灭菌速率常数K K是判断微生物受热死亡难易程度的是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据，随物种和灭菌温度而异。在相同温度下，基本依据，随物种和灭菌温度而异。在相同温度下，k k值值越小，微生物越耐热。（越小，微生物越耐热。（4 4）同一种微生物在不同灭菌）同一种微生物在不同灭菌温度下，温度下，k k值不同，灭菌温度越低，值不同，灭菌温度越低，K K值越小，灭菌温度值越小，灭菌温度越高，越高，K K值越大。值越大。

26、0时微生物最不易死亡,pH6.在发酵行业里也称“连消法”。空气第一次冷却到3035，第二级冷却至2025，经分水后加热到3035，因为温度升高，相对湿度下降。高压蒸汽灭菌能有效地杀灭杂菌，也能破坏营养成分；（4）同一种微生物在不同灭菌温度下，k值不同，灭菌温度越低，K值越小，灭菌温度越高，K值越大。培养基中的颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。001时所需要的灭菌时间t。培养基的物理状态：液体培养基中除热的传道传递外，还有对流，所以比较容易灭菌，而固体则比较难于灭菌。每立方米大气中约有103104个微生物：2）以微孔滤纸、滤板、滤棒构成的过滤器。巴氏消毒法是一种低温消毒法例如，大肠杆菌在水中加热

27、6065便死亡，在10%糖液中，需7046min，在30%糖液中7030min。冷热空气直接混合式空气除菌流程例如，大肠杆菌在水中加热6065便死亡，在10%糖液中，需7046min，在30%糖液中7030min。灼烧，是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。t为反应时间（min）保证进口空气清洁度，减少进口空气的含菌数。高浓度有机物会在细胞周围形成一层薄膜，影响热的传入，所以灭菌温度高些。打开搅拌器的电源开关，使搅拌器转速控制在300350rpm；培养基一般在135140下处理515秒钟。t为反应时间（min）（2）深层介质过滤除菌介质现代发酵技术现代发酵技术

28、v 培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，在加热下氨基酸及维生素等受破坏。在生产中必需选择既能达坏，在加热下氨基酸及维生素等受破坏。在生产中必需选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。v 灭菌过程微生物死亡是属于一级反应动力学类型，在其它条件不变灭菌过程微生物死亡是属于一级反应动力学类型，在其它条件不变时，反应速度常数时，反应速度常数与温度的关系可用阿累尼乌斯方程式表示与温度的关系可用阿累尼乌斯方程式表示A A为比例常数为比例常数E E为杀死细菌所

29、需活化能为杀死细菌所需活化能R R为气体常数为气体常数T T为绝对温度（为绝对温度（K K）现代发酵技术现代发酵技术以以lgk对对1T标绘得一直标绘得一直线，其斜率为线，其斜率为 截距为截距为lgA，从斜率和截距，从斜率和截距可求得可求得A和和E现代发酵技术现代发酵技术c c为反应物浓度（为反应物浓度（mol/Lmol/L）t为反应时间（为反应时间（minmin）k k为化学反应速度常数（为化学反应速度常数（minmin）T T为绝对温度（为绝对温度（K K）现代发酵技术现代发酵技术 在灭菌时，当温度变化，菌体死亡速度常数在灭菌时，当温度变化，菌体死亡速度常数k和培养基成分破和培养基成分破坏速

30、度常数坏速度常数k都发生了改变。温度由都发生了改变。温度由T1升高到升高到T2，k值分别为：值分别为：现代发酵技术现代发酵技术同样，灭菌时，培养基成分的破坏也可得类似关系：同样，灭菌时，培养基成分的破坏也可得类似关系：所以：所以：现代发酵技术现代发酵技术 达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可以明显缩短灭达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可以明显缩短灭菌时间，并可减少培养基因受热时间长使营养成分遭到破菌时间，并可减少培养基因受热时间长使营养成分遭到破坏的损失。坏的损失。不同温度的灭菌时间及培养基营养成分的破坏不同温度的灭菌时间及培养基营养成分的破坏情况，见表。情况，见表。现代发酵技术现代发酵技术在实

31、际生产中以在实际生产中以芽胞芽胞的死亡作为灭菌的依据；的死亡作为灭菌的依据；不可能绝对杀灭微生物（无活菌残留），一般要求微不可能绝对杀灭微生物（无活菌残留），一般要求微生物污染降低到生物污染降低到处理处理10001000罐中只残留罐中只残留1 1个活菌个活菌，此数已，此数已能满足生产的要求。能满足生产的要求。吸附于电极上的颗粒、油滴和水滴等要定期清洗；以lgk对1T标绘得一直扰乱生产秩序，破坏生产计划,影响工人的情绪和生产积极性。2、典型的空气除菌流程（8）废物的回收利用。适用：洁净室及净化设备培养基一般在135140下处理515秒钟。过滤介质失效（活性炭灰化、棉花粉末化）造成漏风适用：培养基

32、、发酵罐体、附属设备等优点：不需要其他附属设备，操作简便，是国内外生产中常用方法：热能利用合理，自动化控制不同微生物的耐热性不同，细菌芽孢最强，营养体最弱，放线菌、霉菌比细菌营养体要强。蛋白质含水量与凝固所需温度培养基预热：配制罐或预热罐，6075C，避免料液与蒸汽温差过大而产生水汽撞击；12%的NaCl溶液对微生物有保护作用。实际生产中取N2为0.培养基成分受热破坏是化学分解反应，符合一级动力学反应，可用下式表示：不适合粘度大或固型物含量高的培养基，因此对数穿透定律是指在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残留活菌数的减少而递减，也就是说微生物的死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成正比。培养基

33、成分受热破坏是化学分解反应，符合一级动力学反应，可用下式表示：t（2）深层介质过滤除菌介质（4）同一种微生物在不同灭菌温度下，k值不同，灭菌温度越低，K值越小，灭菌温度越高，K值越大。现代发酵技术现代发酵技术v 1.1.培养基成份培养基成份:油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会提高微生物的耐油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会提高微生物的耐热性。高浓度有机物会在细胞周围形成一层薄膜，影热性。高浓度有机物会在细胞周围形成一层薄膜，影响热的传入，所以灭菌温度高些。响热的传入，所以灭菌温度高些。例如，例如，大肠杆菌在水中加热大肠杆菌在水中加热60656065便死亡，在便死亡，在10%10%糖液中，糖液中，需需7

34、046min7046min，在，在30%30%糖液中糖液中7030min7030min。12%12%的的NaClNaCl溶液对微生物有保护作用。随着浓度的溶液对微生物有保护作用。随着浓度的增加，保护作用减弱，如浓度超过增加，保护作用减弱，如浓度超过810810，则微生物，则微生物的耐热性降低。的耐热性降低。现代发酵技术现代发酵技术现代发酵技术现代发酵技术v3.pH3.pH值的影响值的影响 pHpH值对微生物的耐热性影响很大，值对微生物的耐热性影响很大，pHpH为为6.0-6.0-8.08.0时微生物最不易死亡时微生物最不易死亡,pH6.0,pH6.0时氢离子易渗入时氢离子易渗入微生物的细胞内。

35、微生物的细胞内。现代发酵技术现代发酵技术v4.4.培养基中微生物数量培养基中微生物数量 微生物数量越多，灭菌需要的时间越长，灭菌难度越微生物数量越多，灭菌需要的时间越长，灭菌难度越大。大。v 5.5.微生物细胞中含水量微生物细胞中含水量 微生物含水量越高，细胞内的蛋白质凝固温度越低，微生物含水量越高，细胞内的蛋白质凝固温度越低，越容易受热而丧失生命力。越容易受热而丧失生命力。v 6.6.微生物细胞的菌龄微生物细胞的菌龄 年轻细胞含水量高，年老细胞含水量低，所以年老细年轻细胞含水量高，年老细胞含水量低，所以年老细胞不容易被杀死。胞不容易被杀死。现代发酵技术现代发酵技术v7.7.微生物的耐热性微生

36、物的耐热性 不同微生物的耐热性不同，细菌芽孢最强，营养体最不同微生物的耐热性不同，细菌芽孢最强，营养体最弱，放线菌、霉菌比细菌营养体要强。弱，放线菌、霉菌比细菌营养体要强。v8.8.空气排除情况空气排除情况现代发酵技术现代发酵技术v分批灭菌分批灭菌v连续灭菌连续灭菌现代发酵技术现代发酵技术v 定义：定义：将配置好的培养基加入发将配置好的培养基加入发酵罐内，直接用蒸汽酵罐内，直接用蒸汽加热加热，达，达到灭菌要求的温度和压力后到灭菌要求的温度和压力后维维持持一定的时间，再一定的时间，再冷却冷却至发酵至发酵所需温度所需温度。v 优点：优点：不需要其他附属设备，操作简不需要其他附属设备，操作简便，是国

37、内外生产中常用方法：便，是国内外生产中常用方法：v 缺点：缺点：加热和冷却时间长，营养成分加热和冷却时间长，营养成分有一定损失，罐利用率低，不有一定损失，罐利用率低，不能采用高温快速工艺。能采用高温快速工艺。现代发酵技术现代发酵技术v过程过程 分批灭菌三个过程：分批灭菌三个过程：发酵罐容积越大，加热和冷却发酵罐容积越大，加热和冷却时间越长，这两段时间也在灭时间越长，这两段时间也在灭菌，灭菌主要在菌，灭菌主要在保温保温过程；过程；（t t1 1、t t2 2 和和t t3 3分别表示加热、维分别表示加热、维持和冷却所需要的时间）持和冷却所需要的时间）现代发酵技术现代发酵技术v3 3灭菌的主要步骤

38、：灭菌的主要步骤：v（1 1）培养基的输送：）培养基的输送：通过专用管道输入通过专用管道输入发酵罐中。发酵罐中。v（2 2）灭菌前的准备工作：）灭菌前的准备工作：检查水、电、检查水、电、气以及发酵罐的密封性是否正常，将空气气以及发酵罐的密封性是否正常，将空气过滤器灭菌，灭菌后将过滤器装上发酵罐。过滤器灭菌，灭菌后将过滤器装上发酵罐。现代发酵技术现代发酵技术v（3 3）加热：）加热：控制进水阀和出水阀，调控制进水阀和出水阀，调节水压使水压表指针指示在节水压使水压表指针指示在0.250.30.250.3之间，之间，使水充满加热器，防止烧坏加热器；打开使水充满加热器，防止烧坏加热器；打开发酵罐的总电

39、源；打开搅拌器的电源开关，发酵罐的总电源；打开搅拌器的电源开关，使搅拌器转速控制在使搅拌器转速控制在300350rpm300350rpm；打开温；打开温度控制器的电源开关。度控制器的电源开关。现代发酵技术现代发酵技术v（4 4）保温：）保温：121121，灭菌，灭菌30min 30min v（5 5）冷却：）冷却：灭菌结束后，发酵罐会自动降温，当温度灭菌结束后，发酵罐会自动降温，当温度低于低于9090时，通过无菌操作，安装好已灭菌的空气过滤器，时，通过无菌操作，安装好已灭菌的空气过滤器，然后，通入无菌空气，使培养基快速降温，并使发酵罐保然后，通入无菌空气，使培养基快速降温，并使发酵罐保持一定的

40、正压，以减少污染；当温度低于持一定的正压，以减少污染；当温度低于3535时即可接种时即可接种发酵发酵。现代发酵技术现代发酵技术v定义：定义：培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。v主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在一般在135135140140下处理下处理5 515 15秒钟。秒钟。当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微

41、粒就沉降。在恒定灭菌温度下，对某一种微生物而言k可为常数，对两边积分，得对数残留定律公式：dN/dT=kN当温度低于35时即可接种发酵。（2）深层介质过滤除菌介质灼烧，是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。（2）深层介质过滤除菌介质利用热空气加热冷空气的流程适用范围：空气湿含量中等地区2、典型的空气除菌流程例如，大肠杆菌在水中加热6065便死亡，在10%糖液中，需7046min，在30%糖液中7030min。随着浓度的增加，保护作用减弱，如浓度超过810，则微生物的耐热性降低。滤材要求：耐高温高压、不易被油水污染、除菌效率高、阻力小、成本低、易更换等；高浓度有

42、机物会在细胞周围形成一层薄膜，影响热的传入，所以灭菌温度高些。灭菌过程微生物死亡是属于一级反应动力学类型，在其它条件不变时，反应速度常数与温度的关系可用阿累尼乌斯方程式表示001时所需要的灭菌时间t。而细菌的芽孢最耐热，一般要在120下处理15min才能杀死。年轻细胞含水量高，年老细胞含水量低，所以年老细胞不容易被杀死。因此对数穿透定律是指在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残留活菌数的减少而递减，也就是说微生物的死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成正比。在相同温度下，k值越小，微生物越耐热。过滤介质失效（活性炭灰化、棉花粉末化）造成漏风适用：厂房、无菌室、器具等的消毒。在气流速度在临界速度以

43、下，由于速度很低时，在纤维周边形成一层边界滞留区，在滞留区内气流速度更慢，在滞留区内的颗粒缓慢接近纤维，并与之接触，由于摩擦、粘着作用而被滞留，这种作用称为阻截作用。dN/dT=kN现代发酵技术现代发酵技术v优点：优点：可用高温快速灭菌可用高温快速灭菌 发酵罐利用率高发酵罐利用率高 热能利用合理，自动化控制热能利用合理，自动化控制v缺点：缺点：不适合粘度大或固型物含量高的培养基，不适合粘度大或固型物含量高的培养基，增加操作环节，增加染菌机会。增加操作环节，增加染菌机会。现代发酵技术现代发酵技术培养基预热：培养基预热：配制罐或预热罐，配制罐或预热罐，60607575 C C，避免料液与蒸汽，避免

44、料液与蒸汽温差过大而产生水汽撞击；温差过大而产生水汽撞击；连续灭菌：连续灭菌：连消塔，连消塔，126132 126132 C C，202030S30S；保温：保温：维持罐，维持罐，5 57min7min；冷却：冷却：冷水喷淋冷却至冷水喷淋冷却至40405050 C C。现代发酵技术现代发酵技术现代发酵技术现代发酵技术v套管式连消塔套管式连消塔现代发酵技术现代发酵技术现代发酵技术现代发酵技术连消连消实消实消现代发酵技术现代发酵技术v发酵中的通气发酵中的通气 每立方米发酵液每分钟通气每立方米发酵液每分钟通气0.8m0.8m3 3，培养周期，培养周期170h170h，每个周期需通气每个周期需通气2.

45、862.8610105 5m m3 3；v空气成分空气成分 氧气、氮气、二氧化碳、氧气、氮气、二氧化碳、惰性气体、水蒸气及灰尘（细菌等）惰性气体、水蒸气及灰尘（细菌等）v空气中的微生物空气中的微生物 每立方米大气中约有每立方米大气中约有10103 310104 4个微生物：个微生物：城市多于农村，夏季多于冬季；城市多于农村，夏季多于冬季；通常细菌芽孢、霉菌孢子居多；通常细菌芽孢、霉菌孢子居多；空气中的微生物一般附着在尘埃、雾滴上。空气中的微生物一般附着在尘埃、雾滴上。现代发酵技术现代发酵技术v1.1.加热灭菌：加热灭菌：采用加热手段（电、蒸汽、空压机）将空气加热到灭采用加热手段（电、蒸汽、空压

46、机）将空气加热到灭菌温度进行灭菌。菌温度进行灭菌。v2.2.静电电除菌：静电电除菌：被电离的空气离子在向电极快速移动过程中撞击上空被电离的空气离子在向电极快速移动过程中撞击上空气中的尘埃、菌体后，使菌体、尘埃移向电极，最终气中的尘埃、菌体后，使菌体、尘埃移向电极，最终沉降吸附在电极上，以达到除尘除菌的目的。沉降吸附在电极上，以达到除尘除菌的目的。v3.3.介质过滤除尘、除菌介质过滤除尘、除菌 把空气中的各种微粒和极少量的游离微生物用过滤介把空气中的各种微粒和极少量的游离微生物用过滤介质捕集起来予以清除方法质捕集起来予以清除方法现代发酵技术现代发酵技术v蒸汽、电蒸汽、电既不经济，又不安全；既不经

47、济，又不安全；v空气压缩机空气压缩机可行！对于无菌程度要求不高可行！对于无菌程度要求不高利用空气压缩产热灭菌利用空气压缩产热灭菌PV=nRT 4、冷却：一级空气冷却：4050，应注意的问题：（1）灭菌时间取决于污染程度(N0)灭菌程度(Ns)；在气流速度在临界速度以下，由于速度很低时，在纤维周边形成一层边界滞留区，在滞留区内气流速度更慢，在滞留区内的颗粒缓慢接近纤维，并与之接触，由于摩擦、粘着作用而被滞留，这种作用称为阻截作用。（4）同一种微生物在不同灭菌温度下，k值不同，灭菌温度越低，K值越小，灭菌温度越高，K值越大。（2）灭菌程度即残留菌数，如果要求完全灭菌，即Ns0，则t接近于无穷大，这

48、在事实上是不可能的。在相同温度下，k值越小，微生物越耐热。在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。t总=t1+t2+t3在相同温度下，k值越小，微生物越耐热。提高过滤除菌效率的措施湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。（1）连消塔加热灭菌的连续灭菌流程一般含有小于1mm的颗粒对培养基灭菌影响不大，但颗粒大时，影响灭菌效果，应过滤除去。完整发酵生产工艺流程:培养基一般在135140下处理515秒钟。设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。每立方米大气中约有103104个微生物：冷热空气直接混合式空气除菌流程培养基一般在135140下处理515秒钟。达

49、到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可以明显缩短灭菌时间，并可减少培养基因受热时间长使营养成分遭到破坏的损失。蒸汽压力热能利用合理，自动化控制现代发酵技术现代发酵技术v原理：原理：含灰尘和微生物的空气通过高压直流电场，气体电离，含灰尘和微生物的空气通过高压直流电场，气体电离，产生的离子使灰尘和微生物等成为载电体，捕集于电产生的离子使灰尘和微生物等成为载电体，捕集于电极上；极上；v特点特点 吸附于电极上的颗粒、油滴和水滴等要定期清洗；吸附于电极上的颗粒、油滴和水滴等要定期清洗；特点：能耗低、捕集效率高、设备庞大特点：能耗低、捕集效率高、设备庞大现代发酵技术现代发酵技术v绝对介质过滤绝对介质过滤v深层介

50、质过滤深层介质过滤现代发酵技术现代发酵技术定义定义v 介质之间的空隙小于被滤除的微生物，当空气流过介质介质之间的空隙小于被滤除的微生物，当空气流过介质层后，空气中的微生物被滤除。层后，空气中的微生物被滤除。介质的空隙小于介质的空隙小于0.50.5m m，从可靠性、经济性、可操控性上不如深层介质过滤。从可靠性、经济性、可操控性上不如深层介质过滤。现代发酵技术现代发酵技术v除菌原理除菌原理 惯性冲击作用惯性冲击作用 阻截作用阻截作用 布朗扩散布朗扩散 重力沉降重力沉降 静电吸附静电吸附现代发酵技术现代发酵技术v 当微生物等颗粒随空气以一定的当微生物等颗粒随空气以一定的速度流动速度流动v 在接近纤维