液相色谱条件的分析和建立课件.ppt
- 【下载声明】
1. 本站全部试题类文档,若标题没写含答案,则无答案;标题注明含答案的文档,主观题也可能无答案。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
2. 本站全部PPT文档均不含视频和音频,PPT中出现的音频或视频标识(或文字)仅表示流程,实际无音频或视频文件。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
3. 本页资料《液相色谱条件的分析和建立课件.ppt》由用户(晟晟文业)主动上传,其收益全归该用户。163文库仅提供信息存储空间,仅对该用户上传内容的表现方式做保护处理,对上传内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知163文库(点击联系客服),我们立即给予删除!
4. 请根据预览情况,自愿下载本文。本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
5. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007及以上版本和PDF阅读器,压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 色谱 条件 分析 建立 课件
- 资源描述:
-
1、整理版课件1液相色谱条件的分析和建立主讲人 :李效宽日期 :2010年11月地点:武汉整理版课件2合适的流动相合适的流动相合适的色谱柱合适的色谱柱合适的分离度合适的分离度较好的色谱峰型较好的色谱峰型重现的色谱图重现的色谱图整理版课件3 HPLC分分离原理离原理 样品组分在流动相和固定相之间进行分配,由于不同组分与固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同,使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样,从而产生色谱分离。(必要条件)整理版课件4不同类型样品的方法选择样品首选方法弱极性反相色谱极性正相色谱,未修饰硅胶高分子量凝胶色谱,尺寸排阻,离子交换光学异构手性柱无机盐混合物离子
2、色谱碳水化合物氨基柱(反相),离子交换树脂整理版课件5色谱柱的选择 根据分离方式分类根据分离方式分类(1)正相色谱:正相色谱:SiO2;CN;NH2(2)反相色谱:反相色谱:C18;C4;C8;CN;NH2;苯基苯基(3)离子交换色谱:离子交换色谱:阳离子官能团:阳离子官能团:SO3H磺酸基、磺酸基、COOH羧基等羧基等 阴离子官能团:阴离子官能团:R4N季铵基、季铵基、-氨基等氨基等(4)凝胶色谱:水溶性凝胶过滤(凝胶色谱:水溶性凝胶过滤(GFC););油溶性凝胶渗透(油溶性凝胶渗透(GPC)(5)其它类型:手性柱等其它类型:手性柱等整理版课件61.填料基质:硅胶、氧化铝、聚苯乙烯等 2.键
3、合相:C4、C8、C18、苯基、氨基、氰基等 3.孔径:60-100A 分子量2000 4.粒径:2um-10um 5.内径:10mm以下(分析),10mm以上(制备)6.长度:100、150、250、300mm色谱柱选择整理版课件7色谱柱填料选择 粒度均匀(3,3.5,5 um),粒径小,柱压高,理论塔板数高,容易堵柱。低酸度表面(硅醇基团被屏蔽),可以减少拖尾 宽的pH 范围,可以有较大的调节自由度整理版课件8色谱柱选择 长度:75mm,150mm,250mm,压力和理论塔板正比与柱长 内径:2mm,4.6mm,10mm 粒径:3um,3.5um,5um 孔径:100A,300A整理版课件
4、9 流动相选择 溶 剂 截止波长(nm)水 190 乙腈 190 甲醇 210 乙醇 210 异丙醇 210 正己烷 210 四氢呋喃 210 二氯甲烷 240 氯仿 240 整理版课件10甲醇和乙腈的紫外吸收图线性范围和检出限度都有影响整理版课件11不同混合溶剂的粘度比较整理版课件12分离度(R1.5)和峰型(1.05T0.95)整理版课件13可接受的分离条件K 可以接受的分离应该是1k20,or 2k10 better。K=(tr-t0)/t0 T0指 死时间,一般相当于溶剂峰出峰时间 K 与流速变化关系不大,K小受干扰大,k大则分析时间太长。整理版课件14理论塔板数整理版课件15分离度
5、w1,w2是峰1峰2的基线宽度 W0.5,1,w0.5,2是峰1和峰2 的半高峰宽整理版课件16分离度与k(容量因子)的关系 所以分离的第一步就是控制1k20,或者最好是2k10 方法:有机相100%,90%,80%,70 每减少10%,k值变化为2.53倍整理版课件17分离度80%-70%-60%整理版课件18分离度(48%-47%-46%)整理版课件19更换有机相 a:甲醇-水 b:THF-水 c:甲醇:THF:水整理版课件20总结 1调节有机溶剂比例(10%)使k值可以接受 2 微调有机溶剂比例(1%),使分离完全 3 更换有机溶剂MeOH,THF,CAN 4 混合使用有机溶剂 记录每一
6、次条件变化对谱峰的影响整理版课件21其他控制选择性的因素 流动相pH值 柱温 不同品牌色谱柱 离子对试剂整理版课件22流动相pH值 1,2 酸性化合物 4,5碱性化合物 3中性化合物 图中曲线的拐点为该化合物的pKa pH57之间会有较好的分离,5附近比较稳定整理版课件23流动相pH值整理版课件24流动相pH值整理版课件25pH值的影响(pka)一组苯甲酸(pka=4.2)同系物的分离情况 A:pH 2.5 B:pH 3.0 C:pH 3.5 D:pH 4.0整理版课件26pH值的影响 pH值必须在该缓冲盐的pKa1以内才有较好作用,超过此范围,会使得色谱条件不稳定,重复性较差 由此得出磷酸盐
7、缓冲液可用于pH 2.0-3.1,6.2.-8.2 醋酸盐缓冲液可用于pH 3.8-5.8整理版课件27方式不同柱效不同色谱条件色谱柱:Kromasil C18 4.6250mm 5um,柱温:室温,波长:203nm流速:1.0ml/min 2.梯度:乙腈:水为流动相1.流动相:乙腈:水(22:78)为流动相 0min 20 :80柱效:11500 20min 40 :60人参皂苷Rg1 (样品)柱效:60000min0510152025Norm.050100150200250 DAD1 A,Sig=203,4 Ref=360,100(BUXINQIKF000001.D)14.538min05
8、10152025Norm.050100150200250 DAD1 A,Sig=203,4 Ref=360,100(BUXINQIKF000009.D)10.838整理版课件28柱温的影响 温度变化1度,Rt变化13%A:30 B:35 C:40 D:45 温度控制对定量分析很重要整理版课件29更换色谱柱的影响 A C8柱 B 苯基柱 C 氰基柱整理版课件30更换色谱柱的影响 A C8柱 B 苯基柱 C 氰基柱 由于更换色谱柱会影响峰的次序,所以这是最后的选择整理版课件31流速的影响 A 3um dp B 5um dp C 10um dp 从左到右 1,2,4ml/min 改变流速对分离影响不
9、大,但可以缩短分析时间整理版课件32填料及外型影响 Dp :2.5um,3.5um,5um,10um(柱压,理论塔板数)长度:20,30,50,100,150,250mm(柱压,理论塔板数)内径:2.1,3.0,3.9,4.6 mm(线速度)整理版课件33 a 150mm P=1800psi b 250mm P=3000psi柱长与柱压和RT成比例整理版课件34改变粒度,长度,流速 150-mm l,3-m,1-mL/min,1250psi 100-mm,3-m,1-mL/min,825psi 100-mm,3-m 2-mL/min,1650psi整理版课件35缓冲盐(离子强度调节)的影响01
10、02015525300040 mM NH4OAc)30 mM NH4OAc20 mM NH4OAc色谱柱:Dionex acclaim C18,5um,250*4.6mm流动相:CH3CN:(NH4OAc溶液,pH5.2)20:80检测波长:280nm 流速:1.0ml/min1050mM浓度整理版课件36检测器的影响0816412UV 220 nmELS detector12341235整理版课件37检测波长的影响051017210 nm246 nm265 nm285 nm151234567整理版课件381.1.等度条件等度条件二二.色谱条件的开发色谱条件的开发2.梯度条件梯度条件整理版课件
11、39色谱条件开发的目标 二高一低:专属性高、准确度高、成本低是一个色谱工作者追求的目标。在尽量短的保留时间内得到最佳的峰型、合适的分离度。整理版课件40等度洗脱的特点 优点优点 操作简单、方便操作简单、方便 重现性好重现性好 缺点缺点 不适合某些复杂物质不适合某些复杂物质整理版课件41梯度洗脱的特点 优点优点 分离能力增加分离能力增加 检测灵敏度提高检测灵敏度提高 缺点缺点 仪器设备要求高仪器设备要求高 不适合某些检测方式不适合某些检测方式整理版课件42等度和梯度获得柱效不同等度和梯度获得柱效不同色谱柱:Dionex acclaim C18,250*4.6mm,柱温:25,波长:203nm流速
12、:1.0ml/min 样品:人参皂苷Rg1 1.等度:乙腈:水(22:78)为流动相2.梯度:乙腈:水为流动相 0min 20 :80 20min 40 :60整理版课件43等度和梯度获得柱效不同等度和梯度获得柱效不同min0510152025Norm.050100150200250 DAD1 A,Sig=203,4 Ref=360,100(BUXINQIKF000001.D)14.538min0510152025Norm.050100150200250 DAD1 A,Sig=203,4 Ref=360,100(BUXINQIKF000009.D)10.838柱效2.1万柱效6万整理版课件44
13、艰难的选择 分离度 分析时间 系统压力 在三者之间作出最符合实际情况的选择整理版课件45快速寻找方法的起点 传统的建立方法模式需要较长的时间,100%,90%现代仪器多为三元或两元泵系统,可以方便的在整个流程中自由的变化比例,因此可以通过探索性梯度运行来寻找最佳方法入口。整理版课件46确定梯度运行的方法 设计一个30分钟的运行,推荐条件:250*4.6mm 5um 1.0ml/min 甲醇 0 min 5%30 100%35 100%整理版课件47一个实例 tg 第一个谱峰和最后一个谱峰的时间差 Tg 整个梯度运行时间 tg/tg0.4 梯度 tg/tg=(28.6-18.3)/30=0.34
14、,因此可以分别尝试整理版课件48由梯度变换为等度 平均保留时间t=(18.3+28.6)/2=23.5t=(18.3+28.6)/2=23.5 陡度陡度=(100-5)/30=3.17=(100-5)/30=3.17 等度比例等度比例=5+3.17=5+3.17*23.5=79%23.5=79%整理版课件49等度(79%)运行结果(考虑K?)整理版课件50由梯度变换梯度(K?)第一个谱峰第一个谱峰18.3对应对应5+3.17*18.3=63%(18.3-2.5)/2.5=6.32,6.32/3=2.1 (K=1)最后一个谱峰最后一个谱峰28.6对应对应5+3.17*28.6=95%梯度时间为梯
15、度时间为 100-5 =95-42 30 X X=16 min 陡度不变整理版课件51第二次梯度运行结果 Time B%0 42 16 95 20 95 整理版课件52液相色谱的方法开发(二)梯度方法整理版课件53梯度的洗脱方式 高压梯度及低压梯度溶剂 A溶剂 B泵 A泵 B混合器A 高压梯度溶剂 A泵溶剂 B比例阀(溶剂混合点)混合器B 低压梯度(溶剂混合点)整理版课件54梯度一般方法整理版课件55梯度洗脱的可变参数 梯度的陡度 梯度的变化形状124356789 10 11整理版课件56如不用梯度:分离不理想整理版课件57梯度条件的优化梯度曲线压力曲线整理版课件58梯度曲线的变化 凹线整理版
展开阅读全文