骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭的实验研究课件.ppt
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- 关 键 词:
- 骨髓 间充质 干细胞 移植 治疗 心力衰竭 实验 研究 课件
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1、骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭的实验研究研究生:导 师:一、研究背景一、研究背景 心肌病、难治性心力衰竭等心血管疾病仍严重威胁着人类的生命。各种心肌疾病心肌缺血、坏死有功能的心肌细胞、心肌组织 纤维组织增生、取代形成瘢痕组织进行性的心收缩功能不良、心腔扩张和心力衰竭。内科治疗:不能替代坏死心肌;心脏移植:供体少、费用高难以推广细胞移植:带来了新的曙光移植细胞异体细胞自体细胞骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞(MSC)分化:(1)心肌细胞(2)内皮细胞(3)平滑肌细胞 优点:(1)自体移植,不存在免疫 排斥问题。(2)MSCs定向分化的能力 较强(3)来源广,容易获取。(4)不存在伦理道德上的争
2、 议。现有的研究已证实,MSCs移植减少梗死面积改善心功能增加新生血管形成 二、研究目的 分离纯化骨髓间充质干细胞,探讨骨髓间充质干细胞移植对阿霉素诱导的心力衰竭大鼠心功能的影响。三、材料与方法动物:具有同基因背景的近交系F344大鼠药品及试剂:注射用盐酸阿霉素、淋巴细胞分离液、胎牛血清、低糖DMEM培养基、胰蛋白酶、5-溴-2脱氧尿苷(BrdU)、小鼠抗大鼠Brdu单克隆抗体、SP法试剂盒、浓缩型DAB试剂盒、小鼠抗大鼠单抗CD11b/c-FITC、CD34-FITC、CD44-PE和CD90-PE,以及相应同型对照单抗小鼠IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG2a PE和IgG2a F
3、ITC等设备及器械:BCM-1000型生物洁净工作台、37恒温CO2培养箱、倒置相差显微镜、70超低温冰箱、LXJ离心机、RM6240型生物信号采集分析系统、YP100型压力换能器、流式细胞仪等实验路线1:细胞部分MSCs分离纯化接种传代鉴定BrdU标记标记率检测细胞移植实验路线2:动物实验F344大鼠ADR注射细胞移植组心功测定组化分析细胞移植DMEM注射移植对照组NS注射F344大鼠正常对照组(一)实验动物分组及心力衰竭模型建立 1.随机选取10只大鼠作为正常对照组(NS腹 腔注射)2.其余36只大鼠,采用腹腔注射阿霉素(2 mg/kg,每周一次,共六次)建立心力衰竭 模型3.存活大鼠再随
4、机分为2组:移植对照组、细 胞移植组 (二)MSCs的分离及培养:1.将F344大鼠处,无菌条件下获取股骨和胫骨,用 培养液冲洗骨髓腔,获取全部骨髓细胞 2.采用淋巴细胞分离液进行分离纯化3.细胞以1104/cm2的密度接种于培养瓶,置培养 箱内培养 4.48h后首次换液,以后约34天换液一次5.待细胞生长至铺满瓶壁的2/3以上时,进行消化、传代(三)、MSCs的鉴定:1.倒置显微镜下观察MSCs的形态。2.MSCs的流式细胞仪鉴定:检测MSCs细胞表面抗原CD11b/c、CD34、CD44和 CD90的表达 第3代MSCs 消化 离心洗涤 滤过 一抗孵育 离心洗涤 上机检测(四)、MSCs的
5、标记:1.BrdU储存液的配制:将10 mgBrdU、0.8 mL二甲基亚砜和1.2 mL蒸馏水充分混匀,4避光保存。2.移植前,待细胞达到50融合时,在细胞 培养瓶内加入上述BrdU液,终浓度调至 50mg/L,于37、含5的CO2的饱和湿度 培养箱内继续培养48h。(五)、MSCs的BrdU标记率检测:第3代MSCs细胞爬片BrdU孵育48hPBS甲醛固定3%H2O2灭活内源性酶 酸变性胰酶修复非免疫血清封闭液PBS(阴性对照)一抗1:200生物素化二抗SABCDAB显色蒸馏水蒸馏水蒸馏水、PBSPBSPBSPBS苏木素复染(阴性对照)PBS蒸馏水(六)、MSCs移植:u1.细胞移植组:大
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