外源化学物致突变用汇总课件.ppt

1、1第七章外源化学物致突变用2第一节 概 述3变异（variation）一、基本概念 在亲子之间或子代个体之间出现不同程度的差异，称为变异（variation）亲代个体杂交，基因重组；基因突变，新基因产生；染色体组成或细胞质发生变化 4突变（mutation）遗传结构本身的变化及其引起的变异 自发突变 (spontaneous mutation)诱发突变 (induced mutation)5致突变作用（mutagenesis）外来因素引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，且此种改变可随同细胞分裂过程而传递能够引起突变的物质致突变物（mutagen）6 DNA由脱氧核糖、磷酸及碱基组成，基本成分

2、为四种核苷酸，形成双螺旋结构 二、遗传学基础1DNA与基因7 基因（gene）：DNA分子中最小的完整功能单位，是生物遗传信息的携带者 基因组（genome）：细胞或生物体的一套完整单体的遗传物质General organization of the DNA sequence.Only the exons encode a functional peptide or RNA.The coding region accounts for about 3%of the total DNA in a human cell.8 在间期细胞的细胞核中，通过光镜可见一种能被碱性染料着色的物质，即染色质（c

3、hromatin）。它由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量的RNA组成，形似串珠状的复合体 2.染色质与染色体93体细胞和生殖细胞 体细胞（somatic cell）多是二倍体（diploid）细胞，含有两组完全相同的染色体，其遗传损伤不会遗传给下一代 生殖细胞（germ cell）往往是单倍体，其染色体改变可传给下一代10 细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂终了所经历的过程5细胞周期 G0：DNA合成前期；G1：DNA合成期；S：完成DNA复制；G2：为有丝分裂做准备；M：有丝分裂期 11 一个细胞生成两个子细胞，每个子细胞各具有与亲代细胞完全相同的染色体有丝分裂（mitosis）核的变

4、化 染色体和纺锤体的变化 细胞器的变化 染色体平均分配12 通过两个细胞周期使染色体数目减少一半的细胞分裂方式。细胞核分裂两次，而染色体只复制一次，经过分裂后染色体数目减少一半，变成单倍体（haploid）减数分裂（meiosis）13第二节化学毒物致突变的类型14 基因中DNA序列的变化。因基因突变限制在一特定的部位，故称为点突变(point mutation)一、基因突变 碱基置换 移码突变基因突变15 由错误配对（mispairing）导致原来的碱基对被错误碱基对所置换，称碱基置换 1碱基置换（base substitution）转换（transition）：嘌呤置换另一嘌呤，或者是嘧啶

5、置换另一嘧啶 颠换（transversion）：嘧啶换成嘌呤，或者嘌呤换成嘧啶161718 发生一对或几对(3对除外)的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸2移码突变(frameshift mutation)19二、染色体畸变 染色体的结构改变，可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现染色体畸变（chromosome aberration）染色单体型畸变(chromatid-type aberration)染色体型畸变（chromosome-type aberration）20 缺失(deletion)；重复(duplicati

6、on)；倒位(inversion)；易位(translocation)染色体结构异常的类型2122三、非整倍体和多倍体 非整倍体(aneuploidy)：增加或减少一条或几条染色体；多倍体(polyploidy)：染色体数目成倍增加23第三节化学毒物致突变作用的机制及后果24 烷化剂(alkylating agent)：对DNA和蛋白质都有强烈烷化作用的物质(一)碱基损伤1碱基错配一、引起突变的DNA变化 烷化作用：烷化剂提供甲基或乙基等烷基与DNA共价结合的过程2526 9-氨基吖啶（9-aminoacridine）分子较为扁平，能够结合到DNA分子上，插入邻近的碱基对，使它们分开，造成DN

7、A链歪斜，引起排列参差，产生两个重组子，一个碱基对增多，一个碱基对减少，即造成碱基对的缺失或者额外碱基对的插入2平面大分子嵌入DNA链27 有些化学物的结构与碱基非常相似，称为碱基类似物3碱基类似物取代 在细胞周期的DNA合成期(S期)中，碱基类似物能与正常的碱基竞争，取代其位置，造成错误配对，即发生碱基置换28 化学物氧化碱基，破坏或改变碱基的结构，或引起链断裂。它们主要改变核酸中核苷酸的化学组成，其作用与DNA复制无关 4碱基的化学结构改变或破坏2930 碱基置换：亚硝酸盐能使腺嘌呤和胞嘧啶发生氧化性脱氨，相应生成次黄嘌呤和尿嘧啶；羟胺使胞嘧啶C-6位的氨基变为羟氨基 破坏碱基结构：如甲醛

8、，可在机体内形成有机过氧化物或自由基来破坏嘌呤碱，最终导致DNA链的断裂 31 当细胞或机体受到紫外线刺激，会使DNA发生化学变化，主要产生环丁烷嘧啶二聚体和(4-6)光产物(4-6-photoproduct)。可阻止DNA的复制，并引起细胞死亡（二）DNA链受损1二聚体的形成3233辐射的致突变机制 使连接A-T、C-G之间的氢键断裂 DNA的一个或两个键中的糖-磷酸基之间断裂 DNA同一条链上，相邻的嘧啶形成二聚体 水电离产生自由基，引起突变 辐射使DNA双链断裂或单链断裂34 活性化学物与细胞大分子之间通过共价键形成的稳定复合物，很难用一般的化学或生物学方法使其解离 DNA加合物形成可活

9、化癌基因，影响调节基因和抑癌基因的表达 2DNA加合物形成35 是一种稳定的共价结合物 不同的化学物引起DNA-蛋白质交联物的交联有所不同 对DNA构象与功能产生严重影响 烷化剂、B(a)P、砷化物、醛、重金属3DNA-蛋白质交联物形成(DNA-protein crosslinks，DPC)3637 非整倍体和多倍体是由于染色体分离异常而产生二、引起突变的细胞分裂过程的改变 细胞分裂过程的改变：纺锤体，微管蛋白的合成与聚合，微管结合蛋白合成与功能发挥，细胞分裂纺锤纤维的功能发挥，着丝粒与之有关的蛋白质作用，极体复制与分离，减数分裂时同源染色体联合配对和重组38 非整倍体细胞由正常细胞未分裂而产

10、生，结果是纺锤体的一极接受了同源或两个染色单体，而另一极则没有 同源染色体减数分裂I期不能适当分离 姐妹染色体在减数分裂期，或有丝分裂期不能适当分离39 多倍体涉及整个染色体的情况 染色体分裂时，染色体单体不能分离，产生一个4倍体细胞 配子为2倍体，产生一个多倍体的受精卵 一个卵子被一个以上精子授精40 微管蛋白二聚体是构成纺锤体的基本成分。如其某一特定位置被占据，将妨碍微管的正确组装，导致细胞分裂被抑制 秋水仙碱即可与该结合部位结合，导致细胞染色体不分离 1与微管蛋白二聚体结合非整倍体与多倍体产生机制41 化学毒物与微管蛋白的巯基特异性结合，影响微管的作用。不同化学结构的物质，与微管蛋白不同

11、部位的巯基结合 2与微管上的巯基结合 苯基汞与着丝粒微管结合，甲基汞与极间微管结合，将造成多种后果。通常是使细胞分裂部分抑制，即造成非整倍体 42 秋水仙碱，灰黄霉素，长春花碱可与微管结合蛋白结合，结合点和作用方式不尽相同，都可使已组装好的微管解聚 非特异性作用微管，使其蛋白质变性，使微管失去定向能力化学毒物破坏微管的方式3.已组装好的微管的破坏43 秋水仙碱妨碍有丝分裂早期两对中心粒的分离和移向两极 N2O 使组装好的微管破坏，中心粒位置不正常等现象，机制不明 4中心粒移动受阻5其他作用441DNA的高保真复制过程中的任何一个环节损伤，将影响DNA复制的高保真性，有可能引起突变三、其他的改变

12、2DNA修复过程是清除受损伤的DNA片段，并合成新的片段来替换的过程。修复过程依赖多种酶45四、突变的后果46 致死性突变：影响后代的数量1生殖细胞突变 显性：使精子不能受精，或合子在着床前死亡或着床后早期胚胎死亡 隐性：需纯合子或半合子才能出现死亡。如果是杂合子则不出现死亡47 显性遗传：造成下一代遗传病发生率增加或新病种出现；隐性遗传：增加下一代基因库的遗传负荷 非致死性突变：影响后代的质量48 基因库（gene pool）遗传负荷（genetic load）某一物种在特定时期中能将遗传信息传至下一代的处于生育年龄的群体所含有的基因总和；一种物种的群体中每一个携带的可遗传给下一代的有害基因

13、的平均水平49 肿瘤 衰老 动脉粥样硬化 致畸2.体细胞突变50第四节机体对致突变作用的影响 51 针对紫外线损伤产生的胸腺嘧啶二聚体的修复机制一、DNA损伤的修复1光复活 依赖光，酶切嘧啶二聚体，将毗连的嘧啶接回原结构上 光裂合酶(photolyase)，广泛存在于原核生物和真核生物体内5253 鸟嘌呤O6位被烷化，易造成碱基错配 烷基转移酶将鸟嘌呤O6位甲基转给蛋白质，使其恢复正常的碱基配对特性 O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基化转移酶2“适应性”反应54 负责较大范围损伤的修复机制，多步骤修复过程，存在于真核生物3切除修复 切除核苷酸修复 切除碱基修复 误配修复55 填补损伤部位，使复制得以

14、继续进行，但DNA损伤部位仍然存在 是一种耐受过程，容忍损伤继续存在和在高突变率情况下，换取细胞继续生存 4复制后修复(post replication repair，PRR)56 诱导性修复，在各种诱导因素作用下，使SOS功能群表达；修复过程有明显误差，不同长度核苷酸链错误插入，因而表现为高频率的突变；SOS系统为多基因控制，其中任何一个发生突变，SOS修复功能就不能表达 5.呼救性修复（SOS repair）57 增强代谢活化 抑制代谢灭活(一)代谢酶遗传多态性二、遗传因素对致突变作用的影响不同个体间肿瘤易发差异的原因之一58 特异性修复酶1O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)

15、(二)修复功能的个体差异 将嘌呤与胸嘧啶上的烷基转移到自身胱氨酸的残基上 有明显的组织差异和个体差异59 DNA断裂修复酶，可能是氧化损伤的一种重要修复形式 通过其催化的反应产生多种生物学效应，如诱导细胞NAD消耗；抗重组和基因稳定的作用；核酶修饰作用；组蛋白结合及对染色体构型的影响；参与细胞凋亡2聚(二磷酸腺苷-核糖)多聚酶(PARP)60第五节观察化学毒物致突变作用的基本方法61一、观察项目的选择1观察效应终点的类型 通过试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点（genetic end point）62 国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)于1983年提出致突变试验的遗

16、传学终点分为5类 DNA完整性的改变 DNA重排或交换 DNA碱基序列改变 染色体完整性改变 染色体分离改变632成套的观察项目 化学毒物的种类、结构、致突变机制、靶细胞各异 致突变物中仅少数具有直接致突变作用，大多数为间接致突变作用 化学毒物的致突变性有强弱之分64 入选原则 应包括5类遗传学终点 应包括多种进化程度不同的物种 体内试验与体外试验配合 体细胞试验阳性，再进行生殖细胞试验 验证阳性结果在体内的真实性，必要时再选用生殖细胞致突变试验65 利用突变体的测试菌株，观察受试物能否纠正或补偿突变体所携带的突变改变，判断其致突变性。常用的菌株有鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typh

17、imurium)和大肠杆菌(E.Coli)二、常用的致突变试验1细菌回复突变试验(Ames试验)66 突变的菌株必需依赖外源性组氨酸才能生长，而在无组氨酸的选择性培养基上不能存活，致突变物可使其基因发生回复突变，使它在缺乏组氨酸的培养基上也能生长 原理6768 是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体2微核试验(micronucleus test，MNT)可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂 灵敏度与细胞遗传学试验基本相同 简易、省时 69微核试验结果703染色体畸变分析 观察染色体形态结构和数目改变称为染色体畸变分析(chromosome aberration anal

18、ysis)，又称细胞遗传学试验(cytogenetic assay)71 分裂中期相用显微镜检查染色体畸变和染色体分离异常 观察裂隙、断裂、断片、无着丝粒环、染色体环、双或多着丝粒染色体、射体和染色体粉碎 Chromosome Pairs in Human Cells72原理4姐妹染色单体交换试验(sister-chromatid exchange，SCE)对于分裂的细胞，如将5溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)加入合成DNA的原料中，经过两个分裂周期后，两条染色单体，其中一条DNA链的双股内的胸腺嘧啶核苷均被BrdU取代，另一条只有一股被取代 73 用染色剂如吉姆萨和光处理，使双股含BrdU的

19、染色单体着色浅淡，而单股含BrdU的染色单体着色深 计数SCE数，判断受试物对DNA是否有损伤作用74 利用隐性基因在伴性遗传中具有交叉遗传特征，给予雄蝇受试物，如雄蝇的X染色体有突变，传给F1代雌蝇，再通过F1代雌蝇传给F2代雄蝇，使位于X染色体上的隐性基因在半合型雄蝇表现出来 5.果蝇伴性隐性致死试验(sex-linked recessive lethal test，SLRL)75 与哺乳动物差异较大，结果外推应慎重 果蝇实验的阳性结果价值高 阴性结果需真核系统试验支持 能检出点突变、小缺失、重排76 检测整体哺乳动物生殖细胞遗传性损伤的体内试验，如染色体断裂所导致的大缺失或重复，或者同时

20、还有因染色体重排所形成的不平衡染色体分离或不分离6显性致死试验 显性致死突变：哺乳动物生殖细胞染色体发生结构和数目变化，出现受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡77 判断受试物有无对雄性生殖系统的损害、敏感阶段、是否具有致突变作用 评价化学毒物对雄性动物的生殖细胞遗传毒性较好的方法之一 确证体外试验或其他试验系统获得的阳性结果 78 正常细胞需经过细胞周期达到增殖的目的，细胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，在S期的DNA合成是按固定程序进行的，称为程序性DNA合成(scheduled DNA synthesis)7程序外DNA合成试验79 DNA损伤时会发生在S期半保留DNA程序合成之外的DN

21、A合成，称之为程序外DNA合成（unscheduled DNA synthesis），它是机体为保证其遗传特征的高度稳定而对DNA双链上出现的变异或损伤进行修复合成的过程 80 分离或培养的细胞，加入标记DNA合成原料，如3H-胸苷 以3H-胸苷掺入细胞量的增加，判断受试物是否造成DNA损伤 经济、快速、操作简便81 彗星试验（comet assay），在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤与修复8单细胞凝胶电泳（SCGE）试验 增加的DNA迁移和增加SSB（单链DNA断裂）的水平有关 可进行体外试验和体内试验 82 获得细胞悬液，制作含有细胞的琼脂糖的载玻片；裂解细胞以释放DNA；在碱性溶液中

22、（pH13）获得单链DNA，在碱性条件下电泳 中和碱，DNA染色 彗星显像，记数彗星方法83 敏感性高 对样品数要求少，适应性高 低花费 操作简便 耗时少 优点84(1)转基因小鼠致突变检测系统9观察方法的新进展 利用穿梭载体于原核和真核间往返转移，带可回收靶基因载体的转基因小鼠提供哺乳动物体内基因的检测系统，用以测定自发和诱发突变率，分析基因突变的组织专一性和顺序变化，阐明DNA修复、基因毒性、突变和癌变的分子机制85(2)微核自动化检测技术 主要使用流式细胞仪和图像分析系统两种仪器。流式细胞仪具有测定精确，定量参数多，检测速度快的特点 86(3)荧光原位杂交技术(fluorescence

23、in situ hybridization，FISH)将荧光标记或经特殊修饰的核酸探针与已固定的组织、细胞或染色体中DNA、RNA杂交，继而通过分析标记探针在被检对象中的显示状况而达到对特殊目标顺序进行检测、定位的目的87应用 对染色体精细结构的分析；对非整倍体的检测 体细胞或生殖细胞；分裂细胞或间期细胞，都能检出染色体断裂剂、非整倍体诱发剂，并可检出染色体精细结构改变88三、致突变试验中的一些问题1阴性、阳性对照的设立 目的是获得实验的基础数据(1)阴性对照(2)阳性对照 通过对阳性物质的试验证明实验方法的可靠；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验

24、的重复性89 许多化合物须经哺乳动物代谢才转变成致突变物，称为前致突变物(promutagen)2体外试验的活化系统 由于微生物和培养的哺乳动物细胞缺乏整体动物体内的许多代谢能力。在遗传毒理学试验中，必须加入代谢活化系统以检出前致突变物90 使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。它有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9，但不如体内活化系统(1)哺乳动物细胞介导91 经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子(2)S9 含有混合功能氧化酶(MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系

25、统 缺点：随实验动物种属或器官不同而有差异；含有大量亲核物质有可能影响试验的敏感性 92 应用纯化细胞色素P-450、谷胱甘肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因工程，将人的细胞色素P-450基因插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢活化系统(3)纯化酶和基因工程93 化学物质分类：遗传毒性致癌物，非遗传毒性致癌物，遗传毒性非致癌物和非遗传毒性非致癌物四类3致突变试验与致癌试验的关系 致突变试验仅可检出遗传毒性致癌物和非遗传毒性非致癌物，可能出现假阳性和假阴性944试验结果在毒理学安全性评价中的作用致突变试验的质量控制 设立对照 盲法观察 资料的统计学分析 试验结果的重现性 95 最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量（LD50或LD80）阴性结果判定条件 各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒物 在一组或多组的观察值：阴性对照比较有显著性差异 96谢谢 谢谢 ！