基因工程的基本操作程序新人教版选修课件.ppt

1、基因工程的基本操作程基因工程的基本操作程序序ppt新人教版选修新人教版选修第一页，共45页。原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构(补充内容）补充内容）非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达,上上 游有启动子，下游有终止子游有启动子，下游有终止子第二页，共45页。真核细胞的基因结构（补充内容）真核细胞的基因结

2、构（补充内容）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核细真核细胞的胞的 基因结基因结构构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用,上游有启动子，下游有上游有启动子，下游有终止子终止子非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子第三页，共45页。原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连

3、续不连续不连续编码区编码区非编码非编码第四页，共45页。第五页，共45页。一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成第六页，共45页。(1)(1)从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因什么是基因文库？基因组文库？部分基因什么是基因文库？基因组文库？部分基因文库？文库？如何构建基因文库？如何构建基因

4、文库？怎样从基因文库中得到我们所需的目怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？的基因？第七页，共45页。概念：概念：基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cDNAcDNA文库）文库）将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片片段段,导入受体菌的群体中储存导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库称为基因文库(gene library)(gene library)第八页，共45页。基因组文库基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因文库中包含了一种生物所有的基因

5、基因,这种基因文库叫做基因组文库这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一基因文库中包含了一种生物的一部分基因部分基因,这种基因文库叫做部分基这种基因文库叫做部分基因文库因文库.第九页，共45页。提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库基因文库的构建方法之基因文库的构建方法之（1 1）直接分离法）直接分离法第十页，共45页。某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互

6、补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录法：反转录法：cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解基因文库的构建方法之基因文库的构建方法之第十一页，共45页。（3 3）如何从基因文库中得到所需要的基因？）如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：如：基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质基因翻译产物蛋白质第十

7、二页，共45页。（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应 是一项生物是一项生物体外复制体外复制特定特定DNADNA片段片段的核酸合成的核酸合成技术技术。通过此技术，可获取。通过此技术，可获取大量的目的基因。大量的目的基因。第十三页，共45页。四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP)一对引物：一对引物：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA(DNA(需含有目的基因需含有目的基因 )两段寡核苷酸序列：与目的基因的两段寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以

8、便根据一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物这一序列合成引物第十四页，共45页。过程：过程：高温变性（高温变性（解旋为单链解旋为单链）低温退火（低温退火（引物与单链互补结合引物与单链互补结合）适温延伸（适温延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 与模板互补的与模板互补的DNADNA双链双链）重复循环重复循环第十五页，共45页。2 2、具体过程、具体过程第十六页，共45页。第十七页，共45页。PCRPCR技术扩增与技术扩增与DNADNA复制的比较复制的比较碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNADNA在高温下变性解旋在高温

9、下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNADNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子第十八页，共45页。（3）人工合成人工合成根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA DNA 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成第十九页，共45页。1 1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法

10、是便方法是A A、化学合成法、化学合成法 B B、基因组文库法、基因组文库法C C、cDNAcDNA文库法文库法 D D、聚合酶链反应、聚合酶链反应2 2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 利用利用PCRPCR技技术扩增目的基因术扩增目的基因 反转录法反转录法 通过通过DNADNA合成仪合成仪利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成A A B B C C D DA AD D第二十页，共45页。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心（1 1）用一定的）用一定的_切切割质粒，使其出现一个切口

11、，割质粒，使其出现一个切口，露出露出_。（2 2）用）用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。（3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再处，再加入适量加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1.1.过程过程:第二十一页，共45页。质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表

12、表达达载载体体同种同种1.1.过程过程:第二十二页，共45页。2、基因表达载体的作用、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？任务吗？为什么？第二十三页，共45页。不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元

13、件其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因受体生物自身基因的启动的启动子才能比较有利于基因的表达；子才能比较有利于基因的表达；（2）通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些

14、其他调控元件，如增强子等；控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。第二十四页，共45页。3.3.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因位于基因的首端位于基因的首端,是是mRNA结合位点结合位点位于基因的末端位

15、于基因的末端,终终止转录止转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞第二十五页，共45页。1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括、（多选）一个基因表达载体的构建应包括A目的基因目的基因B启动子启动子C终止子终止子D标记基因标记基因ABCD2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A启动子是与启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始聚合酶识别和结合的部位，是起始密码密码B启动子和终止子都是特殊结构的启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对短片段，对mRNA的转录起调控作用的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因

16、从而标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别而有所差别A3、目前转基因工程可以、目前转基因工程可以A.打破地理隔离但不能突破生殖隔离打破地理隔离但不能突破生殖隔离B.打破生殖隔离但不能突破地理隔离打破生殖隔离但不能突破地理隔离C.完全突破地理隔离和生殖隔离完全突破地理隔离和生殖隔离D.部分突破地理隔离和生殖隔离部分突破地理隔离和生殖隔离C第二十六页，共45页。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞第二十七页，共45页。1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细

17、胞（1）农杆菌转）农杆菌转化法化法特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对单对单子叶植物无感染能力子叶植物无感染能力Ti质粒质粒的的TDNA可转移至受体细胞并整可转移至受体细胞并整合到其染色体上合到其染色体上转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌第二十八页，共45页。（2）基因枪法）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体裹在金属颗粒

18、表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。与其整合并表达的方法。第二十九页，共45页。（3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。粉管通道进入受体细胞。第三十页，共45页。2、将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动

19、物细胞方法方法:显微注射技术显微注射技术操作程序操作程序:提纯含目的基提纯含目的基因表达载体因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物第三十一页，共45页。3、将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：Ca2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：Ca2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态细感受态细胞胞表达载体与表达载体与感受态细胞感受态细胞混合混合感受态细胞感受态细胞吸收吸收DNA第三十二页，

20、共45页。1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是细胞，原因是A结构简单、操作方便结构简单、操作方便B繁殖速度快繁殖速度快C遗传物质含量少、简单遗传物质含量少、简单D性状稳定、变异少性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有、基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌枯草杆菌支原体支原体动植物细胞动植物细胞ABCDBD3、基因工程是在、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合

21、成基因人工合成基因 B.目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达C第三十三页，共45页。4.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是正确的是将毒素蛋白质注射到棉受精卵中将毒素蛋白质注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中序列注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNA序序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中将编码毒素蛋白的将编码毒素

22、蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养的体细胞，再进行组织培养ABCDC5.下列属于基因工程中导入目的基因方法的是下列属于基因工程中导入目的基因方法的是农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管道法花粉管道法显微注射法显微注射法胚胎移植胚胎移植DNA分子杂交法分子杂交法ABCDC第三十四页，共45页。(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法方法DNADNA分子杂交分子杂交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗体抗原

23、抗体杂交杂交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定第三十五页，共45页。知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。第三十六页，共45页。第三十七页，共45

24、页。1、用、用-珠蛋白的珠蛋白的DNA探针可以检测出的遗传病是探针可以检测出的遗传病是 A镰刀状细胞贫血症镰刀状细胞贫血症B白血病白血病C坏血病坏血病D苯丙酮尿症苯丙酮尿症A2、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 A用于检测疾病的医疗器械用于检测疾病的医疗器械B用放射性同位素或荧光分子等标记的用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子分子C合成合成-珠蛋白的珠蛋白的DNAD合成苯丙羟化酶的合成苯丙羟化酶的DNA片段片段B第三十八页，共45页。思考与探究

25、：思考与探究：2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中若将一个抗病基因导入小麦中,理理论上讲你应该怎样做论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和

26、激活农杆菌的活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色转移并插入到染色体体DNA上。上。3.3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细尔基复合

27、体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。这种糖蛋白是不可能的。第三十九页，共45页。4.-4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想珠蛋白，想一想，应如何进行设计？一想，应如何进行设计？（1 1）从

28、小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNA)cDNA)。（2 2）将）将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉

29、；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4 4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取从中提取-珠蛋白。珠蛋白。第四十页，共45页。复习题复习题1）将目的基因导入受体细胞有哪些方法）将目的基因导入受体细胞有哪些方法?(试试举例说明举例说明)2）简述农杆菌转化法）简述农杆菌转化法第四十一页，共45页。第四十二页，共45页。6 6）（）（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到（

30、岛素，这一过程涉及到（）A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接B.把重组后的把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增分子导入受体细菌内进行扩增C.检测重组检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状分子是否导入受体细菌内并表达出性状D.筛选出能产生胰岛素的筛选出能产生胰岛素的“工程菌工程菌”7 7）下列哪项不属于基因工程技术的步骤下列哪项不属于基因工程技术的步骤（）A基因转移基因转移B基因扩增基因扩增C基因检测基因检测D基因表达基因表达第四十三页，共45页。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子基因的结构基因的结构启动子启动子原核原核真核真核第四十四页，共45页。谢谢！第四十五页，共45页。