Western-Blot操作解析概述课件.ppt

1、细胞与分子生物学实验教学平台细胞与分子生物学实验教学平台 Western BlotWestern blot(immunoblotting)1.What is Western blot?A technique for detecting specific proteins separated by electrophoresis by use of labeled antibodies.So called since it has some similarity to a Southern blot.2.Why we have to use it?We can use this techniqu

2、e to identify a target protein in a complex mixture,and we can also use it to measure its expression level.3.How to do it?步骤：步骤：Separate proteins by gel electrophoresis Transfer proteins onto a membrane Wet tank transfer system Semi-dry transfer system Identify proteins Immunodetection优点：优点：高分辨率的电泳技

3、术高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原特异敏感的抗原-抗体反应抗体反应 1-5 ng1-5 ng中等大小的靶蛋白中等大小的靶蛋白蛋白提取蛋白提取 Total protein standard lysis buffer（lipa）Nuclear cytoplasmic extraction(NER-PER,extraction kit,Pierce)To prevent degradation always centrifuge samples at 4and include a protease inhibitor Protein Qantification:Standard BCA assay

4、(Pierce)Bradford reagentSDS-PAGE不连续电泳不连续电泳 Poly Acrylamide Gel Electrophoresis（PAGE）is the best method in protein separate。Use PAGE to separate proteins by MW。SDS：阴离子去污剂阴离子去污剂 变性剂变性剂氨基酸侧链与氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。胶束。蛋白质蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不量，消

5、除了不 同分子之间原有的电荷差异。同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。性化。蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束的特点：胶束的特点：（1 1）具有相同的形状，）具有相同的形状，形状像形状像 一个长椭圆棒一个长椭圆棒（2 2）平均）平均1 g 1 g 蛋白质结合蛋白质结合1.4 g1.4 g SDS SDS（3 3）短轴对不同的蛋白质亚基）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS SDS胶束基本上是相同的。胶束基本上是相同的。（4 4）长轴的长度则与亚基分子）长轴的长度则与亚基分子 量的大小成正比量的大

6、小成正比PAGEPAGE：聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide(polyacrylamide gel)gel)是由单体丙烯酰是由单体丙烯酰胺胺(acrylamide(acrylamide，简称，简称AcrAcr)和交联剂和交联剂(crosslinker(crosslinker)N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide(N,N-methylenebisacylamide，简称简称BisBis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的

7、凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。度。是良好的电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：单体：丙烯酰胺（单体：丙烯酰胺（AcrAcr）；）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（交联剂：甲叉双丙烯酰胺（BisBis）；）；催化剂：过硫酸胺或核黄素（催化剂：过硫酸胺或核黄素（APAP）；）；加速剂：四甲基乙二胺（加速剂：四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）；）；产物：三维网状结构凝胶产物：三维网状结构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals

8、)(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox(catalyst-redox systems)systems)来来完成的。催化体系主要有化学催化（完成的。催化体系主要有化学催化（APAPTEMEDTEMED）和光化学催化）和光化学催化（核黄素（核黄素TMTEDTMTED）体系。）体系。试剂的纯度试剂的纯度 温度温度 氧气氧气 APAPTEMEDTEMED原则：尽量少的催化剂原则：尽量少的催化剂并在最佳时间内聚合并在最佳时间内聚合。影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素 不同分子量范围的蛋白质应选用不同

9、的凝胶浓度。不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择不连续电泳：不连续电泳：作用作用缓冲液缓冲液PHPH凝胶浓度凝胶浓度积层胶使蛋白样品浓缩PH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离PH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小电泳缓冲液：电泳缓冲液：PH8.3Tris-PH8.3Tris-甘氨酸系统甘氨酸系统。浓缩效应：浓缩效应：三种离子：三种离子：ClCl-前导离子前导离子 GlyGly-尾随离子尾随离子PI=5.97PI=5.97 pro pro 积层胶积层胶 分离胶分离胶 大孔大孔 小孔小孔 阻力阻力 配制：配制：5ml10%分离胶3ml5%积层

10、胶ddH2O 1.9 2.130%Acr 1.7 0.5PH8.8Tris 1.3 PH6.8Tris 0.3820%SDS 0.025 0.01510%AP 0.05 0.03TEMED 0.002 0.003灌制分离胶灌制分离胶 隔绝空气隔绝空气ddH2O0.1SDS:8%灌制积层胶灌制积层胶 插入梳子插入梳子 电泳后染色电泳后染色Reversible IrreversibleCoomassie Brilliant BluePonceauS red蛋白质的电转移蛋白质的电转移（electrotransferelectrotransfer blot)blot)Wet transfer 蛋白质

11、带负电荷，蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，凝胶在负极一侧，硝酸纤维素膜在正硝酸纤维素膜在正极一侧，接通电源极一侧，接通电源以后，蛋白质以后，蛋白质由负由负极向正极极向正极转移至膜转移至膜上。上。半干式转膜半干式转膜注意：注意：转移单元无气泡转移单元无气泡注意方向注意方向戴手套，防止引入污染蛋白戴手套，防止引入污染蛋白胶、膜大小一致，半干转注意短路。胶、膜大小一致，半干转注意短路。膜、滤纸要先平衡膜、滤纸要先平衡20%20%甲醇改善电转移效果。甲醇改善电转移效果。转移效果：转移效果：Ponceau-S Red固相支持物的选择：固相支持物的选择：硝酸纤维素膜（硝酸纤维素膜（nitrocellulo

12、se,NC)nitrocellulose,NC)NC NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；小；非特异性本底显色浅；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。价格低廉，使用方便。结合在结合在NCNC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NCNC韧性较差，易损坏。韧性较差，易损坏。PolyvinylidenePolyvinylidene fluoride(PVDF)fluoride(PVDF)与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡,以活化膜上的正电基团，以活

13、化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。使其更容易与带负电荷蛋白结合。封闭：封闭：-5%BSA5%BSA或或non-fat-dry-milk(RT or 4)non-fat-dry-milk(RT or 4)-incubation time:60 min-O/N-incubation time:60 min-O/N Tween-20Tween-20的作用：减少非特异性吸附不影响的作用：减少非特异性吸附不影响 抗体与抗原的结合抗体与抗原的结合 为避免为避免NCNC与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对特异性结合，使非特

14、异性背景提高，需对NCNC上的潜在结上的潜在结合位点进行封闭处理。合位点进行封闭处理。靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测1.Chromogenic Detection:HRP:Diaminobenzidine(DAB)-brown precipitateAP:BCIP/NTP-purple/blue precipitate2.Chemiluminescent detectionHRP:Luminol-oxidised luminol emits blue lightSubstrateProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking Agen

15、tMembranePrimary AntibodySecondaryAntibody/Enzyme(E)sssssssssProductPPPPPPoor TransferAdjust composition of the transfer bufferMethanol SDSEquilibrate gel and the membrane in the transfer buffer-Equilibrate for 5-30 minsTransfer of a broad MW range of proteins may require a multi-step transfer.Start

16、 at low current/voltage to give good binding of low molecular weight proteins After 30 minutes increase current/voltage to promote elution of high molecular weight proteinsCitation:Two Step Electrotransfer Procedure-T.Otter et al,Anal.Biochem.162:370-377(1987)Transfer of a range of proteins with different molecular weightsPrimary antibody dilution:higher specificitySecondary antibody dilution:lower background Noisy Background：Optimizing Ab concentration,Optimizing blocking reagent,Optimize washing Extensive washingHigh salt washLow Specificity with High BackgroundSome examples：