2021CCK-划痕-transwell侵袭推荐课件.ppt

1、 I、肿瘤细胞的增殖实验、肿瘤细胞的增殖实验II、肿瘤细胞的迁移实验、肿瘤细胞的迁移实验 III、肿瘤细胞的侵袭实验、肿瘤细胞的侵袭实验肿瘤细胞的增殖实验细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。肿瘤的发生和发展过程肿瘤细胞的增殖实验方法DNA合成检测代谢活性检测细胞数量检测细胞增殖相关抗原检测ATP 浓度检测 原理放射性标记的3H-胸腺嘧啶与细胞一同孵育，这样新增殖细胞的DNA中就会掺入放射性标记，经洗脱后可用闪烁计数器检测。在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。通过

2、分光光度计和酶标仪来读取含染料培养基的吸光度，从而衡量细胞的代谢活性，检测细胞增殖的情况。直接检测活细胞数量的变化。有些抗原（如Ki-67）只存在于增殖细胞中，而非增殖细胞缺乏这些抗原，因此可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础，如果有ATP存在荧光素酶就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比。特点最准确可靠耗时长放射性危险灵敏度高操作简便目前细胞增殖应用最为广泛最直接的增殖指标细胞直接计

3、数法操作繁琐费时所需细胞量较多需要组织切片无法进行高通量分析适用于高通量细胞增殖检测和筛选增殖实验各类方法比较肿瘤细胞的增殖实验代谢活性检测各类方法比较7、如果我们投一辈子石块，即使闭着眼睛，也肯定有一次击中成功。1、人最大的阻力是自己，好多想法在实施前往往被自己枪毙了。在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加，因此其底物四唑盐或Alamar Blue在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少，形成能够改变培养基颜色的甲臜染料。效靶比10:1的效应细胞孔Transwell 侵袭实验示意图划横宽度越大，伤口越大，伤口愈合能力越弱，细胞迁移能力越弱。7、如果我们投一辈子石块，即使闭着眼睛，也肯定有一次击中成功。5

4、、一个能从别人的观念来看事情，能了解别人心灵活动的人，永远不必为自己的前途担心。13、用快乐去奔跑，用心去倾听，用思维去发展，用努力去奋斗，用目标去衡量，用爱去生活。15、我们什么都没有，唯一的本钱就是青春。在做加药实验时，如果药物具有还原性，应在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果OD值有增大，则证明药物有影响，应在加CCK-8之前更换培养基，排除药物的影响。肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤转移必须具备的能力。8、沉寂了许久，颓废了许久，感叹了许久，悲伤了许久。7、如果我们投一辈子石块，即使闭着眼睛，也肯定有一次击中成功。Transwell：实验原理在上室准确加入细胞 1

5、105 个/孔，细胞悬液体积200ml，置于5%CO2培养箱于37C培养 24h（注意：细胞量和时间根据实验条件摸索）。Transwell：实验原理细胞直接计数法操作繁琐费时6、春天不播种，夏天就不生长，秋天就不能收茯，冬天就不能品尝。适用于高通量细胞增殖检测和筛选划痕实验（伤口愈合实验，Scratch Assay）肿瘤细胞的增殖实验CCK-8：实验原理肿瘤细胞的增殖实验实验举例：细胞活性检测研究某基因对肿瘤细胞增殖的影响以A450平均值为纵坐标，时间为横坐标绘制生长曲线11、如果你准备结婚的话，告诉你一句非常重要的哲学名言，你一定要忍耐包容对方的缺点。1、人最大的阻力是自己，好多想法在实施前

6、往往被自己枪毙了。13、用快乐去奔跑，用心去倾听，用思维去发展，用努力去奋斗，用目标去衡量，用爱去生活。4、走得最慢的人，只要他不丧失目标，也比漫无目的地徘徊的人走得快。5、一个能从别人的观念来看事情，能了解别人心灵活动的人，永远不必为自己的前途担心。13、只有愚蠢的人会哭着乞求被信任。6、春天不播种，夏天就不生长，秋天就不能收茯，冬天就不能品尝。2、如果你盼望明天，那必须先脚踏现实;如果你希望辉煌，那么你须脚不停步。7、如果我们投一辈子石块，即使闭着眼睛，也肯定有一次击中成功。6、勤劳是财富的源泉，成功没有捷径，只有努力，加油!20、要相信自己，你是最棒的。8、沉寂了许久，颓废了许久，感叹了

7、许久，悲伤了许久。2、大路走尽还有小路，只要不停地走，就有数不尽的风光。15、我们什么都没有，唯一的本钱就是青春。梦想让我与众不同，奋斗让我改变命运!18、人生如烟花，不可能永远悬挂天际;只要曾经绚烂过，便不枉此生。肿瘤细胞的增殖实验实验举例：细胞增殖-毒性检测研究某药物对肿瘤细胞增殖的影响肿瘤细胞的增殖实验实验举例：细胞杀伤效靶比10:1的效应细胞孔效靶比20:1的实验孔靶细胞孔效靶比10:1的实验孔效靶比20:1的效应细胞孔杀伤率计算公式为：杀伤率(%)=1-(A实验孔-A效应细胞孔)/A靶细胞孔100%1当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，增大OD值。在做加药实验时，如果药物具有

8、还原性，应在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果OD值有增大，则证明药物有影响，应在加CCK-8之前更换培养基，排除药物的影响。肿瘤细胞的增殖实验CCK-8：注意事项2接种细胞数：贴壁细胞每孔至少接种1103个细胞/100m ml培养基；白细胞每孔至少接种2.5103个细胞/100m ml培养基；进行预实验，梯度接种细胞，摸索接种细胞的数量。3CCK-8显色时间：贴壁细胞最易显色，加入CCK-8后30min即可肉眼观察显色程度并上机检测；悬浮细胞稍难显色，加入CCK-8后1-4h肉眼观察，若显色困难，则继续培养直到显色完成；白细胞最难显色，需要较长的CCK-8反应时间

9、或增加细胞数量（105个细胞/孔）；不同的细胞需摸索加入CCK-8后的培养时间，以OD值在1左右为最佳。恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道，血管或体腔等途径，到达其他部位继续生长，称肿瘤转移。肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤转移必须具备的能力。肿瘤的转移过程肿瘤细胞的迁移实验肿瘤细胞的迁移实验划痕实验（伤口愈合实验，Scratch Assay）划痕实验是测定肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。划痕实验：实验原理肿瘤细胞的迁移实验划痕实验：实验步骤1先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.51

10、cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。2.在孔中加入约5105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%；肿瘤细胞的迁移实验划痕实验：实验步骤3.用200m ml枪头用力均匀地在培养皿中划痕，PBS洗涤2次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。4放入37 5%CO2培养箱培养。每3h 测量一次细胞运动的距离，拍照(具体时间依实验需要而定)。划横宽度越小，伤口越小，伤口愈合能力越强，细胞迁移能力越强；划横宽度越大，伤口越大，伤口愈合能力越弱，细胞迁移能力越弱。肿瘤细胞的迁移实验1.在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。2.

11、一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（2%）否则细胞增殖就不能忽略。3.按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决前后观察位置不固定的问题。4.实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同的细胞要观察细胞的贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。划痕实验：注意事项肿瘤细胞的迁移实验划痕实验：实验结果举例肿瘤细胞的迁移实验划痕实验：实验步骤肿瘤细胞的迁移实验划痕实验：实验步骤肿瘤细胞的迁移实验划痕实验：实验步骤肿瘤细胞的增殖实验肿瘤细胞的侵袭实验 人工重构基底膜材料Matrigel，是一种细胞外基质，4时是液体，在37

12、 会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连蛋白和型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。滤膜孔径一般为8m mm，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。Transwell：实验原理 Transwell小室 上层培养液 细胞 基质胶 Matrigel 下层培养液 细胞培养板 Transwell 侵袭实验示意图肿瘤细胞的侵袭实验Transwell：实验原理肿瘤细胞的增殖实验肿瘤细胞的侵袭实验1.无菌条件下 Matrigel 于冰浴融化，用PBS（或对应无血清培养基

13、）稀释成1mg/ml，-20C 冻存备用。Transwell：实验步骤2.取出已稀释好的 Matrigel，冰浴融化，以50m ml 的体积铺于Transwell小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），37C 放置1h，使Matrigel 聚合成凝胶（注意：加基质胶时最好将24 孔板放置在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不要有气泡）。肿瘤细胞的增殖实验肿瘤细胞的侵袭实验3.每孔加入200m ml 相应的培养基使胶重构。4.在Transwell下室中加入趋化因子或10%FBS培养基600m ml/孔。5.在上室准确加入细胞 1105 个/孔，细胞悬液体积200

14、m ml，置于5%CO2培养箱于37C培养 24h（注意：细胞量和时间根据实验条件摸索）。6.待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上未穿过膜的细胞。Transwell：实验步骤肿瘤细胞的增殖实验肿瘤细胞的侵袭实验7.4%中性甲醛固定10min，Giemsa 染色10min，PBS 洗涤3次，干燥，取下微孔滤膜，倒置显微镜下观察穿过膜的细胞(200)。8.每张膜中央部分和周围部分各随机取3个视野，计数每个视野内的穿过微孔的细胞数。Transwell：实验步骤肿瘤细胞的增殖实验肿瘤细胞的侵袭实验Transwell：实验结果举例肿瘤细胞的增殖实验肿瘤细胞的侵袭实验Transwell：实验结果举例