应用基因工程课件.ppt

1、应用基因应用基因工程工程什么是基因工程什么是基因工程v分子水平v提取/合成生物的遗传物质：DNA(基因）/RNA生物供体v体外切割与载体拼接DNA重组v重组DNA引入受体细胞或生物体，使这种外源DNA（基因）复制与表达v又称遗传工程、DNA重组技术、分子克隆、基因克隆什么是基因工程药物什么是基因工程药物v基因工程v制备v具有疾病治疗或预防价值v重组蛋白质/多肽vDNA或RNAv根据人类的需要根据人类的需要v繁殖基因、或表达其产物、或创造新性繁殖基因、或表达其产物、或创造新性状状v并稳定遗传给下代并稳定遗传给下代人类细胞细胞核一、基因的获取一、基因的获取染色体被切成小片段，鉴定“目的基因”染色体

2、片段目的基因含有目的基因的片段聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR）v1985年Mullis发明PCR（polymerase chain reaction）快速扩增DNA的方法v模仿体内模仿体内DNADNA的复制过程的复制过程首先使DNA变性，两条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。v重复此过程，DNA以指数方式扩增靶序列靶序列变性和引变性和引物复物复性性循环循环1循环循环2循环循环3变性和引变性和引物复物复性性链延伸链延伸Taq酶酶链延伸链延伸PCRPCR原理示意图原理示意图二、切割二、切割DNAD

3、NA的酶的酶 限制性内切酶限制性内切酶v限制性内切酶（II型）v特异识别和切割4-8个bp长度且具有回文序列的DNA片段v数百种v产生粘性末端三、连接三、连接DNADNA的酶的酶 DNADNA连接酶连接酶v将目的基因与载体连接起来，完成基因重组的过程“重组质粒重组质粒”v“载体载体”：基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具v表达载体与克隆载体v细菌、酵母、植物细胞、动物细胞四、导入四、导入/表达表达v重组DNA（重组质粒）导入受体细胞（生物体），目的基因得以复制和表达细细 菌菌酵酵 母母植植 物物 细细 胞胞动动 物物 细细 胞胞基因枪基因枪绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（GFP

4、GFP）基因工程在工业领域的应用基因工程在工业领域的应用v环保工业残留农药降解、降解石油v酶制剂工业v食品工业v化学与能源工业基因工程在农业领域的应用基因工程在农业领域的应用v农作物新品种抗寒、抗旱、抗盐碱、抗病v除草剂v转基因动物、转基因植物基因工程在医药领域的应用基因工程在医药领域的应用v基因工程药物转基因植物、转基因动物v基因诊断和基因治疗转基因植物转基因植物传统的杂交技术传统的杂交技术基因工程技术基因工程技术一、农作物基因工程一、农作物基因工程v（一）抗虫转基因作物v（二）抗病毒作物v（三）抗细菌和真菌作物v（四）抗除草剂转基因作物（一）抗虫转基因作物（一）抗虫转基因作物v苏云金杆菌（

5、BT）毒素蛋白：苏云金杆菌（Bt）产生的毒素蛋白v有高度特异杀鳞翅目昆虫的活性v毒素蛋白被摄食进入昆虫中肠，在昆虫的中肠消化酶的作用下，原毒素降解成有毒性的多肽，结合到中肠上皮细胞表面的特异受体上，致使细胞膜产生一些穿孔，破坏细胞的渗透平衡，引起细胞的肿胀裂解，最后导致细胞死亡苏云金芽胞杆菌（苏云金芽胞杆菌（BTBT）毒素蛋白基因）毒素蛋白基因 抗 病 基 因 抗 虫 基 因 优 质 基 因抗 病 基 因 抗 虫 基 因 优 质 基 因 （二）抗病毒作物（二）抗病毒作物v植物病毒感染后，被感染的植株常出现矮化、枯死；被感染的叶子常出现花叶（斑点叶、黄叶）、卷叶或畸形v经济作物减产或绝收经济作物

6、减产或绝收烟草花叶病毒烟草花叶病毒水稻病毒病水稻病毒病v花生病毒病：花生病毒病：影响我国花生产量的重要病害。一般年份，病毒病引起减产5%-10%，大流行年份能减产20%-30%v小麦丛矮病小麦丛矮病：平均造成30%的产量损失v油菜病毒病：油菜病毒病：造成的产量损失常年达20-30%v自1986年Powel-Abel首次将烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白（CP）基因导入烟草，培育出抗TMV植株以来，已经针对许多病毒成功的构建了多种抗病毒植株，如抗番茄花叶病毒（TOMV）、马铃薯Y病毒（PVY）、苜蓿花叶病毒（ALMV）、黄瓜花叶病毒（CNV）、水稻条纹病毒（RSV）等抗性植株。（三）抗细菌和真菌作

7、物（三）抗细菌和真菌作物v将“抗菌肽”基因导入植物v将“溶菌酶”基因导入植物（四）抗除草剂转基因作物（四）抗除草剂转基因作物 除草剂的作用机制是破坏氨基酸的合成途径和破坏植物光合电子传递链蛋白质的功能。通过改变除草剂靶酶的水平、修改靶酶的敏感性和解除除草剂毒性酶基因，将解除除草剂的编码蛋白基因导入宿主植物，使宿主植物免受伤害。（五）抗非生物胁迫作物（五）抗非生物胁迫作物1.抗旱2.抗寒3.抗盐4.抗氧化5.抗早熟(六）其他转基因农作物六）其他转基因农作物v黃金米黃金米(Golden Rice)(Golden Rice)：一种转基因大米品种,含有可合成胡萝卜素的基因,可合成維生素A 的前体物，可

8、缓解发展中国家维生素A缺乏的问题。v莎弗西红柿（转基因延熟番茄）：将“延熟基因”转入西红柿，延长西红柿的的成熟期。二、二、生物反应器生物反应器 转基因植物作为一种新型的生物反应器，可以生产过去只能从稀有植物乃至其它生物体才能获得的，或者收获量甚微的一些具有商业价值的物质。如激素、抗体、疫苗、营养蛋白、酶、生长因子、药物及保健品等。三、三、转基因植物的安全性转基因植物的安全性 随着转基因技术的飞速发展以及转基因生物的大面积推广，在关注转基因生物所带来的巨大社会、经济和生态效益的同时，转基因生物及其产品的安全性问题也引起世界范围内的广泛关注。农业转基因生物及其产品对人类健康和生态环境是否会带来潜在

9、不良影响，已引起人们的普遍关注。在人类的科技发展史上，除了40年代中期发展起来的核技术外，恐怕没有像基因工程技术一样，在全世界引起如此大的关注和争议了。（一）标记基因的安全性（一）标记基因的安全性（二）转基因植物的安全评价和争论的问题（二）转基因植物的安全评价和争论的问题1.1.环境安全环境安全（1）生存竞争（2）生殖隔离距离（3）与近缘野生种的可交配性（4）对非靶生物的影响（5）病毒发生变异重组或异源包装的可能性2.2.转基因植物食品安全性及对人健康的影响转基因植物食品安全性及对人健康的影响转基因动物转基因动物利用基因工程技术将目的基因导入动物受精卵或早期胚胎内，使目的基因随细胞分裂而增殖并

10、在体内表达，且稳定地遗传给后代的动物v加速动物育种v建立人类疾病模型v提供人体移植器官v研究基因表达调控v转基因动物作为生物反应器一、动物转基因技术一、动物转基因技术v关键技术v目的基因的获取vDNA重组目的基因与“载体”的连接v重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞v胚胎移植技术v转基因动物的鉴定（一）显微注射法（一）显微注射法（microinjection)microinjection)（二）逆转录病毒法（二）逆转录病毒法逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期卵裂和胚泡的形成（三）胚胎干细胞法（三）胚胎干细胞法v胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES细胞）全能性vES细胞在

11、解除分化抑制的条件下，具有（生殖腺等）各种组织的发育潜力，即ES细胞具有发育成完整动物体的能力（四）精子载体法（四）精子载体法（五）体细胞核移植法（五）体细胞核移植法Dolly二、转基因动物的应用二、转基因动物的应用v动物育种中的应用v提高动物的抗病能力v提高动物生长速度v提高动物产毛性能v改善乳品品质v在基因功能等生命科学基础研究中的应用v基因敲除技术（knock-out)v医药科学研究中的应用v药理学中的应用v人类疾病模型v动物生物反应器动物生物反应器（从转基因动物体液或血液中收获基因产物）v原理：将编码活性蛋白的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内以制备转基因动物，并使外源基因在动物体内（乳

12、汁、血液等）高效表达，然后再分离提取目的基因编码产物v乳腺生物反应器（mammary bioreactor)动物药厂动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的基因通过转基因动物生产感兴趣的基因把把YFGYFG放在放在乳球蛋白的启动子下乳球蛋白的启动子下注入羊卵细胞注入羊卵细胞植入借腹怀孕的母羊体植入借腹怀孕的母羊体内内YFGYFG在乳腺中表达在乳腺中表达乳汁中提纯乳汁中提纯YFGYFG蛋白。蛋白。产品名称产品名称 治疗功能与医药范围治疗功能与医药范围 人胰岛素人胰岛素 治疗糖尿病治疗糖尿病 人生长激素人生长激素 治疗侏儒症，加速创口愈合治疗侏儒症，加速创口愈合 干扰素干扰素 治疗癌症、病毒感染治疗癌症

13、、病毒感染 干扰素干扰素 治疗带状疱疹，眼结、角膜炎治疗带状疱疹，眼结、角膜炎 干扰素干扰素 治疗癌症、病毒感染治疗癌症、病毒感染 人组织纤溶酶原激活因子人组织纤溶酶原激活因子(tPA(tPA)溶解血栓，治疗急性心肌梗塞溶解血栓，治疗急性心肌梗塞 红细胞生成素红细胞生成素 (Epo(Epo)治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死 凝血因子凝血因子 治疗治疗A A型血友病型血友病 神经生长因子神经生长因子 维持神经元细胞存活、生长和分化维持神经元细胞存

14、活、生长和分化蛋白质和多肽类活性物质蛋白质和多肽类活性物质基因治疗v疾病基因的发现疾病基因的发现v19901990年美国科学家首先启动人类基因组计划年美国科学家首先启动人类基因组计划（HGPHGP），计划历时），计划历时1515年，至年，至20052005年完成年完成v20012001年年2 2月月1212日由日由科学科学和和自然自然杂志同时向杂志同时向世界宣布，人类基因组世界宣布，人类基因组3X109bp3X109bp的最新图谱，约含的最新图谱，约含3 3 4 4万个基因万个基因v揭示人类揭示人类4 4万个基因功能的任务非常艰巨万个基因功能的任务非常艰巨v已知人类遗传性疾病约有已知人类遗传性

15、疾病约有30003000种种一、基因治疗的概念一、基因治疗的概念v改变人遗传物质改变人遗传物质为基础的生物医学治疗为基础的生物医学治疗v通过一定方式一定方式将人正常基因人正常基因或有治疗作用有治疗作用的的DNADNA片段片段导入人体靶细胞人体靶细胞以矫正或置换矫正或置换致病基因的治疗方法疾病的根源疾病的根源异常的基因异常的基因 基因治疗概念的扩展基因治疗概念的扩展凡是采用分子生物学技术和凡是采用分子生物学技术和原理，在原理，在核酸水平核酸水平上展开的对疾病的治疗上展开的对疾病的治疗二、基因治疗的策略二、基因治疗的策略v基因置换：用正确的基因原位置换错误的基因最理想的策略v基因修复v基因修饰（基

16、因增补）：不删除突变的致病基因，而在基因组的某一位点额外插入正常基因，弥补基因的功能最主要的策略v基因失活v免疫调节三、基因治疗中治疗基因三、基因治疗中治疗基因导入病人体内的方式导入病人体内的方式v直接体内疗法:治疗基因体内靶细胞v间接体内疗法:从体内取出靶细胞导入治疗基因筛选扩增回输体内治疗基因的导入方式治疗基因的导入方式四、基因治疗的基本程序四、基因治疗的基本程序v治疗性基因的选择治疗性基因的选择v基因载体的选择：基因载体的选择：病毒载体，非病毒载体v靶细胞的选择：靶细胞的选择：体细胞（干细胞），生殖细胞（X）v基因转移：基因转移：间接体内疗法，直接体内疗法v外源基因表达的筛选外源基因表达

17、的筛选v（一）治疗性基因的选择（一）治疗性基因的选择v单基因（疾病）单基因（疾病）v多基因（疾病）：多基因（疾病）：心血管疾病、代谢性疾病v恶性肿瘤：恶性肿瘤：原癌基因，抑癌基因v病毒性疾病病毒性疾病v（二）基因载体的选择（二）基因载体的选择v病毒载体系统病毒载体系统(70%)v定向感染性、寄生性v剔除致病基因和复制相关基因v逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒v非病毒载体系统非病毒载体系统(30%)(30%)v效率低，安全性高腺腺 病病 毒毒 作作 为为 载载 体体 导导 入入 治治 疗疗 基基 因因v（三）（三）靶细胞的选择靶细胞的选择v体细胞体细胞:造血干细胞、皮肤成纤维细胞、肌细

18、胞、神经细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞v生殖细胞（生殖细胞（X)X)四、基因治疗的临床应用四、基因治疗的临床应用v（一）遗传病的基因治疗（一）遗传病的基因治疗v血友病：人凝血因子v地中海贫血:珠蛋白v（二）肿瘤的基因治疗（二）肿瘤的基因治疗v针对癌基因的治疗v针对抑癌基因的基因治疗：P53v针对免疫系统的基因治疗v（三）代谢性遗传病（三）代谢性遗传病 ADA与严重联合免疫缺陷综合症v（四）心脑血管病的基因治疗（四）心脑血管病的基因治疗 血管内皮生长因子VEGFv（五）病毒性疾病的基因治疗（五）病毒性疾病的基因治疗RNARNA干扰干扰vHIV感染的基因治疗v病毒性肝炎的基因治疗HIV的基因治疗RNA干扰