免疫组织化学[1]课件.ppt
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- 免疫 组织化学 课件
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1、2023-2-9免疫组织化学1免疫组织化学免疫组织化学免疫组织化学1何谓免疫组化 免疫组织化学是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织呈色反应,借助可见的标记物,对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法。免疫组织化学1免疫组化的全过程抗原的提取与纯化免疫动物或细胞融合,制备特异性抗体及纯化标记物与抗体集合形成标记抗体标本的处理抗原抗体反应和呈色反应显微镜下观察结果免疫组织化学1组织抗原组织抗原抗体抗体标记物标记物 标记抗体标记抗体1 1 荧光荧光2 2 酶酶3 3 亲和技术亲和技术4 4 金标金标免疫组织化学1组织抗原组织抗原 免疫细胞化学反应原理:免疫细胞化学反应原理:标
2、记抗体标记抗体标记的抗原抗体复合物标记的抗原抗体复合物免疫组织化学1间接法间接法 直接法直接法 两种免疫细胞化学反应方法两种免疫细胞化学反应方法免疫组织化学1标本的处理v标本的主要来源:活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞v标本的固定与保存v酶消化处理 组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障,必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。免疫组织化学1标本的固定与保存 固定的目的:是细胞内蛋白质凝固,终止胞内酶活化反应,防止细胞自溶,保持细胞固有形态与结构,防止细胞脱落,去除干扰抗原抗体反应的类脂,最主要的是保存组织细胞的抗原性,在染色和反
3、复清洗的过程中使抗原不致释放。好的固定剂:(1)能快速固定抗原(2)防止抗原物质扩散(3)固定后的抗原能被抗体识别,不影响抗原抗体反应免疫组织化学1标本的固定与保存抗原固定剂固定温度与时间蛋白质95乙醇室温,315min免疫球蛋白丙酮4,30min酶四氯化磺4 ,30min激素1聚甲醛4 ,45h细菌丙酮、甲醇室温,310min病毒丙酮,无水乙醇室温,510min四氯化磺4 ,3060min类脂质10甲醛室温,310min细胞悬液1聚甲醛室温,2min各种抗原的固定免疫组织化学1标本的固定与保存 冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的制片方法。冰冻切片制片方法简单,可避免石蜡切片因固定、脱水、
4、浸蜡等步骤造成的抗原损失。迅速冷冻可防止冰晶的形成,避免组织细胞结构的破坏。石蜡切片是观察组织细胞结构的理想方法,可用于陈旧石蜡包埋材料的回顾性免疫组化研究,切片薄,有连续性,蜡块可长期保存,但是抗原的保存量不如冰冻切片。免疫组织化学1酶消化处理 石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存,固定过程中由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭,染色不理想,甚至出现假阴性,因而在进行免疫组化反应之前,需要酶消化处理切片,可使抗原决定簇重新裸露。常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。免疫组织化学1抗体处理与保存抗体是免疫组化技术的首要试剂,通常选用的高特异性、高效价的第一抗体为多克隆抗体。抗体稀释的原则是阳
5、性(抗原)物质着色应鲜明,背景应钱或不着色。抗体效价越高,孵育时间越长,方法越敏感抗体稀释度应越高。免疫组织化学1免疫染色v标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物;v用缓冲液冲洗去未结合的成分;v直接在显微镜下观察结果(免疫荧光直接法),或待标本显色后再用显微镜观察结果(免疫酶直接法)免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。免疫组织化学1免疫染色 对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加检测的敏感性和特异性,减少非特异性干扰。1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原,增加细胞和组织的通透性,以利于抗体与抗原最大限度的结合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。2.非特异吸附法免疫组
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