第四章项目三微生物的生长与控制复制课件.ppt
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1、1第四章第四章 微生物的生长与控制微生物的生长与控制 微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映互作用下的综合反映 生长繁殖情况可以作为研究各种生理、生化和生长繁殖情况可以作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标遗传等问题的重要指标 生产实践中的各种应用、对致病微生物和霉腐生产实践中的各种应用、对致病微生物和霉腐微生物的防治与其生长繁殖和抑制密切相关微生物的防治与其生长繁殖和抑制密切相关 2 测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法 微生物的生长规律微生物的生长规律 影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的主要因素 微生物培养法微生物培养
2、法 有害微生物的控制有害微生物的控制3三三 微生物的连续培养微生物的连续培养(continuous culture)分批培养分批培养(batch culture):将微生物置于一定:将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养,培养基一次性加入。容积的定量的培养基中培养,培养基一次性加入。不再补充和更换,最后一次性收获。不再补充和更换,最后一次性收获。连续培养连续培养(continuous culture):在微生物培养:在微生物培养的过程中,不断地供给新鲜的营养物质,同时排的过程中,不断地供给新鲜的营养物质,同时排除含菌体及代谢产物的发酵液,让培养的微生物除含菌体及代谢产物的发酵液,让培养的微生
3、物长时间地处于对数生长期,以利于微生物的增殖长时间地处于对数生长期,以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养连续培养理论基础理论基础:由于对典型生长曲线中稳定:由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识,采取相应有效措施推迟其来期到来原因的认识,采取相应有效措施推迟其来临,从而发展出现在的连续培养技术。临,从而发展出现在的连续培养技术。4连续发酵(连续发酵(continuous fermentation)连续培养在生产上的应用,相对于单批发酵而言。连续培养在生产上的应用,相对于单批发酵而言。优点:优点:高效,简化了操作高效,简化了操作装料、灭菌、
4、出料、清洗发酵罐等装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作;单元操作;自控:便于利用各种仪表进行自动控制;自控:便于利用各种仪表进行自动控制;产品质量稳定产品质量稳定节约大量动力、人力、水和蒸汽,且使水、汽、电负荷均节约大量动力、人力、水和蒸汽,且使水、汽、电负荷均衡合理。衡合理。缺点:菌种易于退化;易于遭到杂菌污染;营养物利用率低于缺点:菌种易于退化;易于遭到杂菌污染;营养物利用率低于单批培养。单批培养。连续发酵生产时间受以上因素限制,一般只能维持数月连续发酵生产时间受以上因素限制,一般只能维持数月 1年。年。5描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况,需描述不同种类、不同生长状态的微生物生
5、长情况,需选用不同的测定指标。选用不同的测定指标。(一)计数法(一)计数法 直接法直接法(血球计数板)(血球计数板)间接法间接法(平板计数法、(平板计数法、膜过滤法、膜过滤法、比浊法)比浊法)(二)生长量法(二)生长量法 直接法直接法(干重法干重法)间接法间接法(碳、氮含量法,其它生理指标)(碳、氮含量法,其它生理指标)第三节第三节 测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法6原理:将原理:将1cm20.1mm的薄层空间划分为的薄层空间划分为400小格,小格,从中均匀分布地选取从中均匀分布地选取80或或100小格,计数其中的细胞小格,计数其中的细胞数目,换算成单位体积中的细胞数。数目,换算成单位体积
6、中的细胞数。适用范围:个体较大细胞或颗粒,如真菌孢子、酵适用范围:个体较大细胞或颗粒,如真菌孢子、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞,因为(母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞,因为(1)细菌细胞太小,不易沉降;(细菌细胞太小,不易沉降;(2)在油镜下看不清网)在油镜下看不清网格线,超出油镜工作距离。格线,超出油镜工作距离。特点:快速,准确,对酵母菌可同时测定出芽率,特点:快速,准确,对酵母菌可同时测定出芽率,或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。1.1.直接计数法直接计数法血球计数板血球计数板72.间接计数法8平平 板板 菌菌 落落 计计 数
7、数 法法最 常 用 的 活 菌 计 数 法。将 适 当 稀 释 的 菌 液 倾 注 平 板 或 涂 布 在 平 板 表 面,经 保温 培 养 后,以 平 板 上 出 现 的 菌 落 数 乘 以 稀 释 度 就 可以 计 算 出 原 菌 液 的 含 菌 量。直 径 9cm的 培 养 皿 平 板 上 出 现 菌 落 数 一 般 以 50500为宜。按 照 国 家 标 准 规 定 的 样 品 菌 落 总 数 测 定 的 计 数原 则,以 平 板 菌 落 数 在 30300之 间 为 报 告 依 据。9m l 9m l9m l9m l1m l1m l1m l1m l1m l1m l1m l222(1)
8、稀释平板计数法)稀释平板计数法9技术要求:样品充分混匀,操作熟练快速(技术要求:样品充分混匀,操作熟练快速(1515-20min-20min完完成操作),严格无菌操作;成操作),严格无菌操作;注意事项:每一支吸管只能用于一个稀释度,样品混匀注意事项:每一支吸管只能用于一个稀释度,样品混匀处理,倾注平板时的培养基温度;处理,倾注平板时的培养基温度;适用范围:中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生适用范围:中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物,长的微生物,误差:多次稀释造成的误差是主要来源,其次还有由于误差:多次稀释造成的误差是主要来源,其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作样
9、品内菌体分布不均匀、以及不当操作A standard plate count(viable count)reflects the number of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony;plate counts are reported as number of colony-forming units(CFU)per ml(CFU/ml)or per g(CFU/g)of sample.10(2)薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生常用该法测定含菌
10、量较少的空气和水中的微生物数目。物数目。将定量的样品通过薄膜(硝化纤维素薄膜、醋将定量的样品通过薄膜(硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜)过滤,菌体被阻留在滤膜上,取酸纤维薄膜)过滤,菌体被阻留在滤膜上,取下滤膜进行培养,然后计算菌落数,可求出样下滤膜进行培养,然后计算菌落数,可求出样品中所含菌数。品中所含菌数。11(3)比浊法)比浊法原理是在一定范围内,菌悬液中的细胞浓度与混浊度成原理是在一定范围内,菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比,即与吸光度成正比,菌数越多,吸光度越大。因正比,即与吸光度成正比,菌数越多,吸光度越大。因此,借助于分光光度计,在一定波长下测定菌悬液的吸此,借助于分光光度计,在一定
11、波长下测定菌悬液的吸光度,就可反应出菌液的浓度。光度,就可反应出菌液的浓度。特点:快速、简便;但易受干扰。特点:快速、简便;但易受干扰。12二、生长量法131、干重法干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来出来,然后烘干然后烘干(干燥温度可采用干燥温度可采用105105、100100或或80)80)、称重。一般干重为湿重的、称重。一般干重为湿重的10%10%-20%-20%,而一个细菌细胞一般重约而一个细菌细胞一般重约1010-12-12-10-10-13-13g g。该法适合菌浓较高的样品。该法适合菌浓较高的样品。举例:大肠杆菌一个细胞一般重
12、约举例:大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g,液体液体培养物中细胞浓度达到培养物中细胞浓度达到2109个个/ml时,时,100ml培养物培养物可得可得1090mg干重的细胞。干重的细胞。142.生理指标法生理指标法测含氮量测含氮量蛋白质是细胞的主要物质,含量稳定,而氮是蛋白质的主蛋白质是细胞的主要物质,含量稳定,而氮是蛋白质的主要成分,通过测含氮量就可推知微生物的浓度。要成分,通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的一般细菌含氮量为干重的12.5%12.5%,酵母菌为,酵母菌为7.5%7.5%,霉菌为,霉菌为6.0%6.0%,根据一定体积培养液中的含氮量再乘以,根据一定体
13、积培养液中的含氮量再乘以6.256.25,就可,就可测得粗蛋白的含量。测得粗蛋白的含量。其他方法其他方法含碳、磷、含碳、磷、DNADNA、RNARNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等,都可用于生长量的测定。产酸、产热、粘度等,都可用于生长量的测定。15 微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和相互作用相互作用:一方面一方面,各种各样的环境因素对微生物的生长各种各样的环境因素对微生物的生长和繁殖有影响和繁殖有影响,另一方面另一方面,微生物生长繁殖也会影响和改微生物生长繁殖也会影响和改变环境变环境.研究
14、环境因素与微生物之间的关系研究环境因素与微生物之间的关系,可以通过控可以通过控制环境条件来利用微生物有益的一面制环境条件来利用微生物有益的一面,同时防止它有害同时防止它有害的一面的一面.第三节第三节 环境因素对微生物的影响环境因素对微生物的影响影响微生物生长的外界因素很多,除了前面讲过的营养影响微生物生长的外界因素很多,除了前面讲过的营养因素之外,还有许多物理化学条件。因素之外,还有许多物理化学条件。本节主要内容:本节主要内容:一、温度对微生物生长的影响一、温度对微生物生长的影响二、氧气对微生物生长的影响二、氧气对微生物生长的影响三、三、pH值对微生物生长的影响值对微生物生长的影响16 温度是
15、影响微生物生长的最重要因素之温度是影响微生物生长的最重要因素之一。一。温度对微生物的影响具体表现在:温度对微生物的影响具体表现在:影响酶活性,温度变化影响酶促反应速影响酶活性,温度变化影响酶促反应速率,最终影响细胞合成。率,最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性,温度高,流动性影响细胞膜的流动性,温度高,流动性大,有利于物质的运输,温度低,流动大,有利于物质的运输,温度低,流动性降低,不利于物质运输,因此,温度性降低,不利于物质运输,因此,温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。分泌。影响物质的溶解度,对生长有影响。影响物质的溶解度,对生长有影响。一、温度对
16、微生物生长的影响一、温度对微生物生长的影响17从微生物整体来看从微生物整体来看:生长的温度范围一般在生长的温度范围一般在-10 100 极端下限为极端下限为-30,极端上限为,极端上限为105300 但对于特定的某一种微生物:但对于特定的某一种微生物:只能在一定温度范围内生长,在这个范围内,每种微生物都有只能在一定温度范围内生长,在这个范围内,每种微生物都有自己的自己的生长温度三基点生长温度三基点,即,即最低、最适、最高生长温度最低、最适、最高生长温度处于最适生长温度时,生长速度处于最适生长温度时,生长速度最快,代时最短。最快,代时最短。超过最低生长温度时,微生物不超过最低生长温度时,微生物不
17、生长,温度过低,甚至会死亡。生长,温度过低,甚至会死亡。超过最高生长温度时,微生物不超过最高生长温度时,微生物不生长,温度过高,甚至会死亡。生长,温度过高,甚至会死亡。(一)微生物生长的三个温度基点(一)微生物生长的三个温度基点181、高温对微生物的影响、高温对微生物的影响高温下蛋白质不可逆变性,膜受热出现小孔,破坏高温下蛋白质不可逆变性,膜受热出现小孔,破坏细胞结构(溶菌)。细胞结构(溶菌)。(三)高温与低温对微生物的影响(三)高温与低温对微生物的影响19 当环境温度低于微生物的最适生长温度时,微生物的生当环境温度低于微生物的最适生长温度时,微生物的生长繁殖停止,当微生物的原生质结构并未破坏
18、时,不会很长繁殖停止,当微生物的原生质结构并未破坏时,不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力,当温度提高时,快造成死亡并能在较长时间内保持活力,当温度提高时,可以恢复正常的生命活动。可以恢复正常的生命活动。低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4的冰箱中。的冰箱中。当温度过低,造成微生物细胞冻结时,有的微生物会死当温度过低,造成微生物细胞冻结时,有的微生物会死亡,有些则并不死亡。亡,有些则并不死亡。2、低温对微生物的影响、低温对微生物的影响20微生物对氧的
19、需要和耐受力在不同的微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大,根据微生物与氧的类群中变化很大,根据微生物与氧的关系关系,可把它们分为几种类群可把它们分为几种类群:专性好氧菌专性好氧菌 好氧菌好氧菌 微好氧菌微好氧菌 兼性厌氧菌兼性厌氧菌 耐氧厌氧菌耐氧厌氧菌 厌氧菌厌氧菌 (专性专性)厌氧菌厌氧菌二、氧气对微生物生长的影响二、氧气对微生物生长的影响21专性好氧菌(专性好氧菌(strict aerobe)必须在有分子氧的条件下才能生长,有完整的呼吸链,必须在有分子氧的条件下才能生长,有完整的呼吸链,以分子氧作为最终氢受体,细胞含有超氧物歧化酶(以分子氧作为最终氢受体,细胞含有超氧物歧化酶(
20、SOD,superoxide dismutase)和过氧化氢酶。和过氧化氢酶。在有氧或无氧条件下均能生长,但有氧情况下生长得在有氧或无氧条件下均能生长,但有氧情况下生长得更好,在有氧时靠呼吸产能,无氧时接发酵或无氧呼吸产更好,在有氧时靠呼吸产能,无氧时接发酵或无氧呼吸产能;细胞含有能;细胞含有SOD和和过氧化氢酶。过氧化氢酶。微好氧菌(微好氧菌(microaerophilic bacteria)只能较低的氧分压下才能正常生长,通过呼吸链并以只能较低的氧分压下才能正常生长,通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能,氧为最终氢受体而产能,兼性厌氧菌(兼性厌氧菌(facultative aerobe)22
21、耐氧菌(耐氧菌(aerotolerant anaerobe)可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧,分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链,依靠专性发酵要氧,分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链,依靠专性发酵获得能量。细胞内存在获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶,但缺乏过氧化和过氧化物酶,但缺乏过氧化氢酶。氢酶。厌氧菌(厌氧菌(anaerobe)分子氧对它有毒害,短期接触空气,也会抑制其生长分子氧对它有毒害,短期接触空气,也会抑制其生长甚至致死;在空气或含有甚至致死;在空气或含有10%CO2的空气中,在固体培养的空气中,在固体培养基表面上不能
22、生长,只有在其深层的无氧或低氧化还原电基表面上不能生长,只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长;生命活动所需能量通过发酵、无氧势的环境下才能生长;生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供;细胞内缺乏呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供;细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶,大多数还缺乏过氧化氢酶。和细胞色素氧化酶,大多数还缺乏过氧化氢酶。23严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死,而是由于不能严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死,而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。在氧还原为水的过程中,可形成某些有毒的中间产物,例在氧还原为水
23、的过程中,可形成某些有毒的中间产物,例如,过氧化氢(如,过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子()、超氧阴离子(O2)等。超氧阴)等。超氧阴离子为活性氧,兼有分子和离子的性质,反应力极强,极离子为活性氧,兼有分子和离子的性质,反应力极强,极不稳定,可破坏膜和重要生物大分子,不稳定,可破坏膜和重要生物大分子,对微生物造成毒害对微生物造成毒害或致死。或致死。好氧微生物具有降解这些产物的酶,如过氧化氢酶、过氧好氧微生物具有降解这些产物的酶,如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等,化物酶、超氧化物歧化酶等,而严格厌氧菌缺乏而严格厌氧菌缺乏SOD,故易被生物体内极易产生的超氧,故易被生物体内极易产生的超氧
24、阴离子自由基毒害致死。阴离子自由基毒害致死。厌氧菌的氧毒害机制厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说:学说:24各类菌所含对氧解毒酶各类菌所含对氧解毒酶专性好氧菌专性好氧菌 SOD,过氧化氢酶,过氧化氢酶 兼性厌氧菌兼性厌氧菌 SOD,过氧化氢酶过氧化氢酶 专性厌氧菌专性厌氧菌 二种酶均无二种酶均无 微好氧菌微好氧菌 少量少量SOD 耐氧菌耐氧菌 SOD,过氧化物酶过氧化物酶25在培养不同类型的微生物时,要采用相应的措施保证不同在培养不同类型的微生物时,要采用相应的措施保证不同微生物的生长。微生物的生长。培养好氧微生物:培养好氧微生物:需震荡或通气,保证充足的氧气。需震荡或通气,保证充足的氧气。培养专
25、性厌氧微生物:培养专性厌氧微生物:需排除环境中的氧气,同时需排除环境中的氧气,同时 在培养基中添加还原剂,降低在培养基中添加还原剂,降低 培养基中的氧化还原电位势。培养基中的氧化还原电位势。培养兼性厌氧或耐氧微生物:培养兼性厌氧或耐氧微生物:可深层静止培养。可深层静止培养。26三、三、pHpH值与值与微生物生长的相互影响微生物生长的相互影响27微生物的生长微生物的生长pH值范围极广,从值范围极广,从pH8都有微生物能生长。都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在但是绝大多数种类都生活在pH5.09.0之间。之间。微生物生长的微生物生长的pH值三基点:值三基点:各种微生物都有其生长的最低、最适
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