第八章 核酸化学与代谢课件.ppt

1、第八章、核酸化学第八章、核酸化学核酸的组成成分核酸的组成成分DNA的结构的结构DNA和基因组和基因组RNA的结构的结构核酸生物合成核酸生物合成核酸的生物学功能核酸的生物学功能核酸的分子生物学核酸的分子生物学2一、核酸的生物学功能一、核酸的生物学功能（一）核酸与遗传信息的传递（一）核酸与遗传信息的传递DNA是基本遗传物质 一定结构的DNA产生一定结构的蛋白质，才有一定形态和生理特征，所以DNA的特定遗传密码产生的蛋白质就代表特定生物的遗传性。在遗传过程中DNA的具体作用的具体作用：（1）在细胞分裂时按照自己的结构精确复制传给后代；（2）作为模板将所贮遗传信息传给mRNA。3RNA在传递遗传信息上

2、的作用 1)mRNA是蛋白质合成的模板；2)tRNA识别mRNA上的遗传密码，转运特定氨基酸到核糖体上合成肽链；3)rRNA是核糖体的主要成分，是翻译工作的场所。（二）核酸与蛋白质的生物合成（二）核酸与蛋白质的生物合成DNA转录为mRNA是有选择的，tRNA和rRNA也是DNA的转录产物。（三）核酸结构改变与生物变异（三）核酸结构改变与生物变异一切生物的变异和进化都可以说是由于DNA的结构改变而引起蛋白质改变的结果。4生物遗传的变异起源于DNA碱基配对的改变。）有的由于DNA碱基的颠倒（如TA被颠倒为AT）或被调换（如GC被换为TA）；）有的由于在DNA复制过程中被遗漏了一对或多了一对核苷酸，

3、）或者在转译时发生了差误，如氨酰tRNA合成酶错将一个结构与正常氨基酸十分相似的物质交给tRNA。）还有一些生物的遗传性状发生了突变。5（四）（四）DNA与细菌转化与细菌转化一种细菌的遗传性状因吸收了另一种细菌的DNA而发生改变的现象，称为细菌的转化。（五）核酸与病变（五）核酸与病变遗传性疾病是由于遗传缺陷而产生的，也就是DNA结构改变的结果。镰刀型红细胞贫血镰刀型红细胞贫血和白化病白化病(albinism)。病毒对活细胞的侵染是寄主发生疾病，主要是由于核酸的作用。如流感、肝炎、带状疱疹、脊髓灰质炎、白血病、烟草斑纹病。6（六）遗传工程（六）遗传工程遗传工程是用人工方法改组DNA，从而培育新型

4、生物品种的技术。实验室中将细菌作材料研究遗传工程过程可分为：（1）重组DNA分子（基因重组）；（2）将重组DNA引入受体细胞（转化或转导）。有利有利：（1）改良改良微生物品种使产生人工难以制得的生物活性物质如胰岛素、干扰素等；（2）解决解决某些疾病病因和控制这些疾病。（一）核糖和脱氧核糖（一）核糖和脱氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12-D-2-核糖-D-2-脱氧核糖O核糖+H+糠醛甲基间苯二酚FeCl3绿色产物绿色产物脱氧核糖+H+-羟基-酮戊醛二苯胺蓝色产物蓝色产物RNA和和DNA定性、定量测定定性、定量测定（二）嘌呤碱和嘧啶碱（二）嘌呤碱和嘧啶碱NNNNHHHHNN

5、NNHHHH123 456789嘌呤NH2腺嘌呤 adenine（A）NNNNHHHHOH2N鸟嘌呤 guanine（G）NNHHHH123645嘧啶NNHHHHNH2OH胞嘧啶 Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶 uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶 thymine（T）NNOOHHH酮式HNNOOHHH酮式HHH烯醇式（三）核苷（三）核苷OHOH2COHOHOH12345核 糖NNNNHHHH9腺嘌呤胸 苷OHOH2COHOHOH12345核 糖OHOH2COHOH12345核 糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷NCOONHHH51OH假尿苷（）（四）核苷酸（四）

6、核苷酸OHOH2COHOHOH12345核 糖NNNNHHHH9腺嘌呤胸 苷PO-OO胸苷-5-磷酸AMPP O-OOADPATPP O-OO各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的直接原料。在体内能量代谢中的作用在体内能量代谢中的作用：ATP能量“货币”UTP参加糖的互相转化与合成CTP参加磷脂的合成GTP参加蛋白质和嘌呤的合成第二信使第二信使cAMPOHO-O OCH2 TO=PO-35OHOHO-O OCH2 GO=PO-35OHO OCH2OHOH AO=POO-35351PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-ApGTA三、三、DNA的结构的结构（一）（一）DN

7、A的一级结构的一级结构1)因为DNA的脱氧核苷酸只在它们所携带的碱基上有区别，所以脱氧核苷酸的序列常被认为是碱基序列碱基序列（base sequence)。2)通常碱基序列由DNA链的53方向方向写。3)DNA中有4种类型的核苷酸，有n个核苷酸组成的DNA链中可能有的不同序列总数为4n。1.双螺旋结构的主要依据双螺旋结构的主要依据（）DNA中AT、CG。后发现：与T生成2个氢键、C与G生成3个氢键。（）电位滴定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接。（二）（二）DNA的双螺旋结构的双螺旋结构 1953年，Watson 和Crick 提出。2021鸟嘌呤胞嘧啶碱基对腺嘌呤胸腺嘧啶碱基对22磷酸二

8、酯键磷酸二酯键232.双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点（1）两条多核苷酸链反向平行。（2）碱基内侧，A与T、G与C配对，分别形成3和2个氢键。（3）双螺旋每转一周有10个bp，螺距3.4nm，直径2nm。3.双螺旋结构的稳定因素双螺旋结构的稳定因素 （1）氢键氢键（太弱）；（2）碱基堆积力碱基堆积力（base stacking force，由芳香族碱基电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心疏水核心，是稳定DNA最重要的因素；（3）离子键离子键（减少双链间的静电斥力）。242526（三）（三）DNA的三级结构的三级结构线形分子、双链环状(dcDNA)超螺旋染色体包装染色体包装染色体包装的结构

9、模型染色体包装的结构模型多级螺旋模型多级螺旋模型压缩倍数 7 6 40 5 DNA 核小体 螺线管 超螺线管 染色单体 2nm 10nm 30(10)nm 400nm 210m 一级包装 二级包装 三级包装 四级包装 四、四、DNA与基因组织与基因组织DNATranscription RNA（mRNA、tRNA、rRNA）TranslationProtein基因基因基因基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能单位。结构基因调节基因基因组基因组30五、五、RNA结构结构l、其基本结构同DNA，主要区别：l）核糖为：RNA；l）含氮碱基中有，没有。l、RNA主要有三种：l）结构 RNA

10、（rRNA)；l）信使 RNA(mRNA)；l）转运 RNA（tRNA).313233主要特征主要特征：1.1.四臂四环；四臂四环；2.2.氨基酸臂氨基酸臂33端有端有CCACCAOHOH的的共有结构；共有结构；3.3.D D环上有二氢尿嘧啶环上有二氢尿嘧啶(D)(D)；4.4.反密码环上的反密码子与反密码环上的反密码子与mRNAmRNA相互作用；相互作用；5.5.可变环上的核苷酸数目可可变环上的核苷酸数目可以变动；以变动；6.6.T TC C环含有环含有T T和和；7.7.含有修饰碱基和不变核苷含有修饰碱基和不变核苷酸酸。3435六六 核酸的生物合成核酸的生物合成一）一）DNADNA的生物合

11、成的生物合成二）二）RNARNA的生物合成的生物合成36一）一）DNA的生物合成的生物合成（一）一）DNA的半保留复制的半保留复制371、原核微生物的单链环状DNA主要采用滚环式滚环式复制53535一）一）DNA的生物合成的生物合成-半保留半保留DNA复制的起点和方向复制的起点和方向382、真核生物、真核生物DNA的多起点复制的多起点复制n39（三）原核细胞的（三）原核细胞的DNA复制复制1.DNA聚合酶聚合酶（Pol）（dNMP）n+dNTPMg2+（dNMP）n+1+PPi特点特点（1）不能催化从无到有的聚合反应。（2）催化的反应只能在引物的3延伸。（3）3接上的核苷酸决定于模板链。（4）

12、具有53和35外切酶活性。402.Pol和和Pol PCR（多聚酶链式反应）551 热变性热变性2 退火退火55553 DNA聚合酶聚合酶5555重复重复1，2，3PCR反应全过程反应全过程413.双链双链DNA复制的分子机制复制的分子机制（1）冈崎片段和半不连续复制）冈崎片段和半不连续复制533553355335复制叉上复制叉上DNA合成的三种可行性合成的三种可行性42（2）冈崎片段的）冈崎片段的RNA引物引物利福酶素利福酶素对RNA聚合酶有抑制作用。氯霉素氯霉素对蛋白质合成有抑制作用。引物RNA在复制过程中暂时存在，最后通过Pol的53外切酶活力水解。（3）DNA连接酶连接酶 催化一条DN

13、A链的3末端与相邻的另一条DNA链的5末端之间的磷酸二酯键的合成。43 其它功能：其它功能：（1）修补双螺旋DNA中单股的缺口；（2）连接线状双螺旋DNA以产生环状DNA；（3）重组过程中将几段DNA链连接起来。（4）母本）母本DNA双链的分离双链的分离DNA解螺旋酶（DNAhelicase）拓扑异构酶（type topoisomerase）44（5）DNA聚合酶的聚合酶的“校对校对”作用作用 DNA聚合酶的35外切酶活力是校对新生DNA链和改正聚合酶活性所造成“错配”的一种手段。4.真核细胞真核细胞DNA的复制的复制（1）真核细胞DNA复制有多个起始点。（2）至少有5种DNA聚合酶，即、。（

14、3）端粒由端粒酶催化复制。生物细胞生物细胞DNA复制分子机制的基本特点复制分子机制的基本特点455.反转录作用反转录作用 利用反转录酶可制造与任何RNA（mRNA、tRNA、rRNA）的互补DNA（cDNA）。6.DNA的损伤与修复的损伤与修复（1）DNA损伤的各种结构变化损伤的各种结构变化碱基缺失或插入碱基改变形成TT二聚体46（2）修复机制）修复机制光复活；切除修复；重组修复；SOS修复（3）修复缺陷和疾病）修复缺陷和疾病癌症；着色性干皮病；贫血病。47重组修复重组修复55重组重组修复修复5487.细菌的限制细菌的限制修饰系统修饰系统限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶酶切产生平头末端或粘性末

15、端。5GTTAAC33CAATTG55GTT AAC33CAA TTG5平头末端Hpa 495GAATTC33CTTAAG55G TTAAC33CAATT G5粘性末端EcoR50二二 RNA的生物合成的生物合成（一）转录（一）转录转录产物有mRNA、tRNA、rRNA。1.原核细胞的转录原核细胞的转录E.coli 的RNA聚合酶中，2称为核心酶。因子辨认模板DNA的起始位点。512.真核细胞的转录真核细胞的转录真核细胞RNA聚合酶有、三类。3.转录过程的选择性抑制转录过程的选择性抑制放线菌素放线菌素D是原核和真核细胞RNA聚合酶的专一抑制剂。利福平利福平是原核细胞RNA聚合酶的抑制剂。-鹅膏

16、蕈碱鹅膏蕈碱是真核细胞RNA聚合酶的抑制剂。4.转录产物的加工转录产物的加工（1）rRNA前体的转录后加工前体的转录后加工原核细胞原核细胞30S前体17S25S16S23S5S52真核细胞45S前体18S28S5.8S（2）tRNA前体的加工前体的加工（3）真核细胞）真核细胞mRNA的加工的加工537、DNA的分子生物学技术的分子生物学技术(后面我来讲）后面我来讲）方法应用局限性变形梯度凝胶电泳(DGGE)利用基因序列和长度差异分析群落多样性，适于分析较多种微生物条带序列较短，灵敏度有限，不能定量末端限制性片段长度多态性分析(TRFLP)利用限制性位点差异分析群落多样性，快速，半定量分析限制性

17、酶切不完全；高效高通量需要多次反复酶切克隆文库(Cloning library)利用序列差异和测序可知群落中各种群系统分类；为新引物和探针设计提供信息克隆步骤耗时较长,不适合大量分析,不适合反应器监测荧光原位杂交(FISH)原位定量和识别特定菌群背景荧光会干扰检测，探针的穿透性差会造成假阴性实时荧光定量PCR(QRT-PCR)目标基因的扩增和定量分析不适合各种基因的快速同时分析；PCR 高灵敏度易造成污染基因芯片(Microarray)高通量快速检测群落多样性，鉴定微生物并明确其生态作用环境样品特异性和灵敏度低，不能定量，样品处理复杂，仪器贵重541.变形梯度凝胶电泳变形梯度凝胶电泳l1）变性

18、梯度凝胶电泳(DGGE)原理：l在碱基序列上存在差异的不同DNA 双链解链时需要不同的变性剂浓度，DNA 双链解链后，在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降。将PCR 扩增得到的等长的DNA 片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。在不同泳道中停留在相同位置的条带，一般可视为具有相同的DNA 序列。l该技术可以分辨具有相同大小片段的序列差异，可以用于检测单一碱基的变化，微生物群落遗传多样性以及 PCR 扩增 DNA 片段的多态性。l该技术主要操作过程如下（图1）:55DGGE技术主要操作过程如下技术主要操作过程如下:l样品预处理;l 样品DNA(或RNA

19、)提取及纯化;l16S rDNA 或基因片段的PCR(或RT-PCR)扩增;l预实验(DGGE 条件优化);l 制胶;l样品的DGGE 分析;l图谱分析;l条带序列分析。56DGGE过程示意图过程示意图57DGGE特点：特点：lGC 夹板(GCclamp)使用。为取得好的分离效果，常在 DNA 片段上连接一段长为3050 碱基富含 GC 的核苷酸序列GC 夹板(GCclamp)，可分辨相差一个碱基的序列。l DGGE 技术快速简便、分离效果好。从理论上讲，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，DGGE 技术对于DNA 片段的分辨率可以达到一个碱基差异水平，lDGGE 法只能

20、对微生物群落中数量上大于1%的优势种群进行分析。lDGGE 技术无法提供代谢活性、细菌数量和基因表达水平方面的信息。58l1、微生物取样l 稳定运行条件下，不同温度条件（冬季、夏季）的生物强化一体化反应器的厌氧区、好氧区填料上生物膜，HPES生物滤塔填料上的生物膜。l2、样品的预处理l 高速离心处理生物膜样品，用PBS（磷酸盐缓冲液）洗脱与固定生物膜。59土壤基因组提取试剂盒快速提取生物膜中的总DNA。60Marker60Marker23130bp9416bp6559bp2322bp2927bp611、反应体系：试剂50ul体系终浓度Foward primer（F468）2ul0.4uMRev

21、erse primer（R468）2ul0.4uM22Taq MasterMix25ul1Template DNA1ug1ug/reactionRNase-free WaterUp to 50ul6262Primer名称名称序列序列(5to3)碱基数碱基数细菌通用引物F 468CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG ACT CCT ACG GGA GGC AG56细菌通用引物R 468GAC TAC CAG GGT ATC TAA TCC2163步骤温度时间预变性942min变性9430s退火55-6530s延伸7230s终延伸7

22、22min变性延伸，25-35个循环；2、PCR反应条件：643、琼脂糖电泳后紫外成像。Marker65 DGGE 紫外成像 DGGE 成像切胶四、测序过程与结果四、测序过程与结果l一）测序过程l1、对回收的DGGE条带进行二次PCR扩增二 l 及产物回收；l 2、目的片断TA克隆；l3、蓝白斑筛选；l4、质粒提取l5、M13+/-测序（见测序图谱）66二）测序结果二）测序结果DGGE条带编号条带编号测序编号测序编号V3区区菌种属名菌种属名14.19X1323-1198bpNovosphingobium新鞘氨醇杆菌属24.19X1324-4193bpDeltaproteobacteria-变形

23、菌纲30514X1554-1174bpActinomycetales放线菌44.19X1326-6194bpNitrosomonadaceae亚硝化单胞菌科54.19X1327-5 164bpOceanibaculum海洋细菌64.19X1328-2168bpThalassobacter-变形菌纲一种74.19X1329-2188bpFlavobacteriales黄杆菌目一属84.23X1386-1193bpPseudomonas asplenii铁角蕨假单胞菌6768DGGE条带编号条带编号测序编号测序编号V3区区菌种属名菌种属名94.19X1331-1193bpAquabacterium

24、纤发菌属104.19X1332-2 188bpCrocinitomix黄杆菌目一属114.23X1387-1 193bpPseudomonaspsychrophila124.19X1334-4168bpAsticcacaulis不粘柄菌属 or Sphingomonas aurantiaca 单胞菌属134.19X1335-5192bpMethylococcus 甲基球菌属144.19X1336-7 170bpFusibacter小纺锤状菌154.19X1337-4 193bpAeromonas气单胞菌属 or Shewanella希瓦氏菌属164.25X1338-5168bpParacoccus，-变形菌纲，副球菌属，五、结论五、结论l1、生物强化一体化反应器、HPES反应生物滤塔中的微生物优势种类相同；但前者中的生物多样性要高一些，约高20%。l2、生化反应器中的微生物以耐盐性菌类为主。如，新鞘氨醇杆菌属、-变形菌纲的红螺菌、纤发菌属等；l3、生物中存在着一些硝化细菌，如：甲基球菌属、亚硝化单胞菌等。l4、在冬季取样中发现有耐寒性微生物，如单胞菌属一种Sphingomonasaurantiaca。69