第三章微生物工业菌种的选育与扩大培养课件.ppt

1、1 1、写出生产以下产品的主要菌种：、写出生产以下产品的主要菌种：啤酒、黄酒、味精、柠檬酸、食醋、酸奶啤酒、黄酒、味精、柠檬酸、食醋、酸奶2 2、发酵工艺控制中，主要应监控、发酵工艺控制中，主要应监控 、泡沫、氧化还原电位等。泡沫、氧化还原电位等。温故知新温故知新第三章第三章 微生物工业菌种的选育与扩大培养微生物工业菌种的选育与扩大培养 o 第一节第一节 微生物工业菌种微生物工业菌种 o 第二节第二节 微生物工业菌种的选育与保藏微生物工业菌种的选育与保藏o 第三节第三节 微生物工业种子扩大培养微生物工业种子扩大培养 第一节第一节 微生物工业菌种微生物工业菌种 野生菌野生菌 变异菌变异菌 自然选

2、育自然选育 代谢控制育种代谢控制育种 诱变育种诱变育种 基因重组定向育种基因重组定向育种 一、发展总趋势一、发展总趋势 生长能力强、对原料要求低、原料转化率高；生长能力强、对原料要求低、原料转化率高；选择抗噬菌体能力强的菌株；选择抗噬菌体能力强的菌株；菌种纯，不易变异退化；菌种纯，不易变异退化；菌种不是病原菌，不产生任何有害物质；菌种不是病原菌，不产生任何有害物质；发酵副产物少，产物容易分离；发酵副产物少，产物容易分离；选择单产高的选择单产高的营养缺陷型营养缺陷型突变株、突变株、调节突变株调节突变株或野生菌株或野生菌株 二、选择原则二、选择原则 生产苏氨酸菌株转变成生产赖氨酸：生产苏氨酸菌株转

3、变成生产赖氨酸：高丝氨酸缺陷型高丝氨酸缺陷型 四大类微生物四大类微生物:细菌、酵母菌、霉菌和放线菌都可以用来生产细菌、酵母菌、霉菌和放线菌都可以用来生产工业产品。工业产品。(见见P8-9P8-9表表1-1)1-1)微生物的开发潜力很大。微生物的开发潜力很大。目前人们已知的微生物只占自然界微生物总数的不到目前人们已知的微生物只占自然界微生物总数的不到10%10%。而微生物代谢产物据统计已超过而微生物代谢产物据统计已超过13001300多种，但进行工业规模生多种，但进行工业规模生产的还不到产的还不到100100种。种。三、工业上常用微生物三、工业上常用微生物 第二节第二节 菌种的选育与保藏菌种的选

4、育与保藏 1 1、菌种来源、菌种来源 根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门部门索取或购买索取或购买；通过通过菌种选育菌种选育获得新的微生物菌种。获得新的微生物菌种。一、工业菌种选育一、工业菌种选育 第二节第二节 菌种的选育与保藏菌种的选育与保藏 2 2、菌种选育定义、菌种选育定义(p11)(p11)按照生产要求，根据微生物遗传变异理论，利用按照生产要求，根据微生物遗传变异理论，利用自然菌自然菌 种筛选种筛选、人工诱变育种、代谢控制育种人工诱变育种、代谢控制育种或或基因重组定向育种基因重组定向育种等等方法方法得到优良菌种得到

5、优良菌种的工作。的工作。一、工业菌种选育一、工业菌种选育 菌种购买指南视频菌种购买指南视频3、方法、方法(1)自然选育自然选育定义定义从自然界土壤、水、从自然界土壤、水、空气、动物、植物、空气、动物、植物、矿物等样品中分离筛矿物等样品中分离筛选得到菌种的方法。选得到菌种的方法。如：土壤如：土壤如：如：选择培养基选择培养基如：划线分离法、稀释分离法等如：划线分离法、稀释分离法等饱浸含某种饱浸含某种指示剂指示剂的的滤纸片滤纸片变色圈（如淀变色圈（如淀粉降解菌筛选）粉降解菌筛选）指示剂指示剂直接掺入或喷洒直接掺入或喷洒固体固体培养基培养基，菌落周围形成变色，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀圈

6、。如淀粉的平皿上喷上稀碘液（如淀粉降解菌筛选）碘液（如淀粉降解菌筛选）固体培养基中固体培养基中掺掺入溶解性差、入溶解性差、可被特定菌可被特定菌(如如磷细菌磷细菌筛选筛选)利用的营养成分，造成利用的营养成分，造成不不透明的培养基背景透明的培养基背景。菌落。菌落利用此物质形成透明圈。利用此物质形成透明圈。利用有特别营养要求（如利用有特别营养要求（如营养缺陷型营养缺陷型菌株）作为工菌株）作为工具菌，如待筛选菌具有具菌，如待筛选菌具有合合成该营养物成该营养物能力，工具菌能力，工具菌就能围绕该菌生长。就能围绕该菌生长。待筛选的菌株能待筛选的菌株能分泌产生某些能分泌产生某些能抑制工具菌生长抑制工具菌生长的

7、物质（如的物质（如抗生抗生素产生菌素产生菌筛选）筛选）(2)(2)诱变育种诱变育种 采用物理、化学采用物理、化学诱变因素处理微生物诱变因素处理微生物细胞，提高基因的随细胞，提高基因的随机突变几率，然后通机突变几率，然后通过定向筛选获得所需过定向筛选获得所需优良菌株。优良菌株。3、方法方法 (3)(3)代谢控制育种代谢控制育种 通过改变微生物菌种的通过改变微生物菌种的代谢途径或代谢自动调代谢途径或代谢自动调节系统节系统（如（如增加特定基因拷增加特定基因拷贝数来提高限速酶含量）贝数来提高限速酶含量）而而使微生物发生异常代谢，使微生物发生异常代谢，使所需中间代谢产物过使所需中间代谢产物过量积累。量积

8、累。3 3、方法、方法生物进化过程中微生物形生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制成完善的代谢调节机制 代谢产物不会过量积累代谢产物不会过量积累 解除或控制微生物的代谢调节解除或控制微生物的代谢调节目的产物积累目的产物积累 (4)(4)基因重组定向育种基因重组定向育种 通过通过转化、转导、杂交转化、转导、杂交和和原生质体融合原生质体融合等遗传学方法和技术定向等遗传学方法和技术定向地地重组微生物重组微生物DNADNA，使微生物的，使微生物的功能发生定向的改变功能发生定向的改变。3、方法、方法让生命永存一让生命永存一37-43微生物学第六章微生物学第六章 4 4、方法、方法基因重组定向育种先进

9、技术能取代基因重组定向育种先进技术能取代传统育种方法吗？传统育种方法吗？先进育种技术需在先进育种技术需在优良原始菌种基础优良原始菌种基础上应用才有效。上应用才有效。基因基因重组重组产品主要还是一些产品主要还是一些较短的多肽和小分子蛋白质较短的多肽和小分子蛋白质。蛋白质类以外的很多发酵产物（如糖类、有机酸及次级蛋白质类以外的很多发酵产物（如糖类、有机酸及次级代谢产物等）产生往往受到代谢产物等）产生往往受到多个基因的控制多个基因的控制，尤其是还有，尤其是还有许多发酵产物的代谢途径还没有被确证许多发酵产物的代谢途径还没有被确证。1 1、菌种衰退的概念、菌种衰退的概念 指菌种整体在多次接种传代过程中逐

10、渐造成指菌种整体在多次接种传代过程中逐渐造成生产能生产能力降低力降低，表现为，表现为发酵力发酵力（如对培养基的利用）或（如对培养基的利用）或繁繁殖力殖力（如孢子的产生）下降或（如孢子的产生）下降或发酵产物得率降低发酵产物得率降低的的现象。现象。二、工业菌种的衰退与防止二、工业菌种的衰退与防止 2 2、菌种衰退的常见现象、菌种衰退的常见现象 !菌落和细胞形态的改变菌落和细胞形态的改变 !生长速度缓慢，产孢子越来越少生长速度缓慢，产孢子越来越少 !抵抗力、抗不良环境能力减弱等抵抗力、抗不良环境能力减弱等!代谢产物生产能力或其对宿主寄代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降生能力下降 二、工业菌种的衰

11、退与防止二、工业菌种的衰退与防止 3 3、菌种衰退产生的原因、菌种衰退产生的原因 保藏不恰当保藏不恰当传代次数过多传代次数过多 发生回复突变发生回复突变 培养条件不适合培养条件不适合 二、工业菌种的衰退与防止二、工业菌种的衰退与防止 4 4、防止菌种衰退的方法、防止菌种衰退的方法 作好菌种作好菌种保藏保藏工作工作尽可能使每次尽可能使每次培养条件适合而一致培养条件适合而一致尽量尽量减少传代减少传代次数次数 应使用应使用幼龄菌幼龄菌培养培养 二、工业菌种的衰退与防止二、工业菌种的衰退与防止 三、菌种的复壮三、菌种的复壮 概念概念在菌种在菌种已衰退已衰退情况下情况下，通过纯种分离和生产性，通过纯种分

12、离和生产性能测定等方法，从衰退群体中找出少数未衰退的个体，能测定等方法，从衰退群体中找出少数未衰退的个体，以以恢复原有典型性状恢复原有典型性状的措施。的措施。在菌种在菌种未衰退未衰退前经常有意识地进行纯种分离和前经常有意识地进行纯种分离和生产性状测定工作，以期从中生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正变个体选择到自发的正变个体。衰退菌种复壮的方法衰退菌种复壮的方法 单细胞菌株分离法单细胞菌株分离法 沸水筛选法沸水筛选法 菌液用沸水处理后进行单细胞菌株分离，从而挑选出优良菌体。菌液用沸水处理后进行单细胞菌株分离，从而挑选出优良菌体。改变培养条件法改变培养条件法 采用有利于高产菌株而不利于低产菌

13、株的条件来选出高产菌株。采用有利于高产菌株而不利于低产菌株的条件来选出高产菌株。通过宿主体复壮通过宿主体复壮 如如Bacillus Bacillus thuringiensisthuringiensis的复壮的复壮诱变处理法诱变处理法 对发生回复突变进行重新诱变育种。对发生回复突变进行重新诱变育种。三、菌种的复壮三、菌种的复壮 1 1、原理、原理 根据菌种的生理、生化特点，人为地创造条件，使菌种的代根据菌种的生理、生化特点，人为地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态谢活动处于不活泼状态(最好是休眠状态最好是休眠状态)。四、工业菌种的保藏四、工业菌种的保藏 2 2、原则、原则 挑选挑选优良纯

14、种优良纯种，最好是，最好是休眠体休眠体（如孢子、芽孢等），（如孢子、芽孢等），创造一个创造一个最有利于休眠的环境条件最有利于休眠的环境条件（如低温、干燥、（如低温、干燥、缺氧、营养物质缺乏等），就可以达到菌种保藏的缺氧、营养物质缺乏等），就可以达到菌种保藏的目的目的。同时，作为可行的方法，还要考虑方法的同时，作为可行的方法，还要考虑方法的经经济济和和简便简便。三、工业菌种的保藏三、工业菌种的保藏 u斜面低温保藏法斜面低温保藏法 菌种在斜面培养基上培养，生长旺盛后存放在菌种在斜面培养基上培养，生长旺盛后存放在4-84-8的冰箱中，一般的冰箱中，一般半半年年要移植一次。适合保藏实验室要移植一次。适

15、合保藏实验室常用菌种常用菌种。u低温冰箱保藏法低温冰箱保藏法 菌种经液体培养后，加入无菌甘油，使甘油含量为菌种经液体培养后，加入无菌甘油，使甘油含量为30-40%，置于，置于-80低温冰箱中保存，低温冰箱中保存，保存期为保存期为1-10年年。适用于保存。适用于保存各类微生物菌体各类微生物菌体。u石蜡油封保藏法石蜡油封保藏法 医用医用石蜡油石蜡油灭菌冷却后加在斜面菌种上灭菌冷却后加在斜面菌种上,超过斜面顶部超过斜面顶部1cm1cm，在，在室温下室温下或冰箱或冰箱里可保存里可保存1-101-10年。年。几乎所有微生物几乎所有微生物都适用。都适用。三、工业菌种的保藏三、工业菌种的保藏3 3、方法、方

16、法 砂土保藏法砂土保藏法 将干的孢子、芽孢与将干的孢子、芽孢与彻底灭菌彻底灭菌的砂土混合后装入砂土管，放入装有吸湿剂的干的砂土混合后装入砂土管，放入装有吸湿剂的干燥器或大试管中，加橡皮塞用蜡封严，置燥器或大试管中，加橡皮塞用蜡封严，置阴凉干燥处阴凉干燥处或或冰箱冰箱中可保藏中可保藏1-10年。适年。适合于合于孢子、芽孢孢子、芽孢等的保存。等的保存。冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法 瓶中加入菌体或孢子悬液，瓶中加入菌体或孢子悬液，-40-40低温冰箱冷冻低温冰箱冷冻1h1h，室温真空干燥室温真空干燥固封，固封，可保存可保存10-10-数数1010年年。适用于保存。适用于保存各类微生物菌体各类微生物菌

17、体。保存运输方便。保存运输方便。液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 菌种密封于安踣瓶中菌种密封于安踣瓶中,慢速冻结器中以每分慢速冻结器中以每分钟下降钟下降11的速度下降到的速度下降到-35-35，再迅速降温至，再迅速降温至-196196，并，并在该温度下的在该温度下的液氮超低温罐液氮超低温罐中保存，中保存，保存期为保存期为3-9年年。适用于保存。适用于保存各类微生物菌体各类微生物菌体。第三节 微生物工业种子扩大培养 获得获得活力旺盛的、接种数量足够、纯而壮活力旺盛的、接种数量足够、纯而壮的培养物的培养物。一、目的与任务一、目的与任务 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状种子扩大培

18、养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的态的生产菌种生产菌种接入接入试管斜面活化试管斜面活化后，再经过后，再经过扁瓶或摇瓶及种扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的最终获得一定数量和质量的纯种纯种过程。过程。斜面斜面摇瓶摇瓶种子罐种子罐发酵罐发酵罐 二、工艺二、工艺 斜面菌种斜面菌种一级种子摇瓶培养一级种子摇瓶培养二级种子罐培养二级种子罐培养发酵发酵罐罐 （二级）（二级）斜面菌种斜面菌种一级种子摇瓶培养一级种子摇瓶培养二级种子罐培养二级种子罐培养三级三级种子罐培养种子罐培养发酵罐发酵罐 （三级）（三级）尽量采用二级发酵尽量采用二级发酵 三、级数的确定三、级数的确定 菌种发展总趋势，如何理解菌种发展总趋势，如何理解工业菌种选育的定义、方法工业菌种选育的定义、方法工业菌种衰退的定义、防止方法工业菌种衰退的定义、防止方法菌种复壮的概念与方法菌种复壮的概念与方法工业菌种保藏原则与方法工业菌种保藏原则与方法工业菌种扩大培养工艺与级数工业菌种扩大培养工艺与级数 课后思考题课后思考题