第七章微生物遗传变异课件.ppt

1、遗传遗传：亲代与子代相似亲代与子代相似变异变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同亲代与子代、子代间不同个体不完全相同遗传（遗传（inheritance）和变异（和变异（variation）是生命的最本质特性之一是生命的最本质特性之一遗传型遗传型：表型表型：生物的全部遗传因子所携带的遗传信息生物的全部遗传因子所携带的遗传信息具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。表型饰变：表型饰变：

2、表型的差异只与环境有关表型的差异只与环境有关特点：特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为遗传型变异（基因变异、基因突变）遗传型变异（基因变异、基因突变）：遗传物质改变，导致表型改变遗传物质改变，导致表型改变特点：特点：遗传性、群体中极少数个体的行为遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为自发突变频率通常为1010-6-6-10-10-9-9）粘质沙雷氏菌粘质沙雷氏菌25C的斜面培养基；的斜面培养基；37C的斜面培养基的斜面培养基；25C的液体培养基的液体培养基；37C的液体培养基的液体培养基.第一节第一节遗传变异的物质基础遗传变异的物质

3、基础一、三个证明一、三个证明DNA是遗传物质的经典实验是遗传物质的经典实验（一）（一）经典转化实验经典转化实验肺炎链球菌：肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）致病能力）R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）致病能力）小鼠注入活的小鼠注入活的S型菌株，小鼠死亡，说明型菌株，小鼠死亡，说明S型菌株有致病性。型菌株有致病性。1928年，年，F.Griffth作了作了3组实验组实验:1 1、动物试验、动物试验小鼠注入活的小鼠注入活的R型菌株，小鼠存活，说明型菌株，小鼠存活，说明R型菌株不具有致病性。型菌株不具有致

4、病性。小鼠注入热致死的小鼠注入热致死的S型菌株，小鼠存活，说明热致死的型菌株，小鼠存活，说明热致死的S型菌株不型菌株不具有致病性。具有致病性。说明说明R型菌株和型菌株和S型菌株之间有转化现象。型菌株之间有转化现象。小鼠注入活的小鼠注入活的R型菌株和热致死的型菌株和热致死的S型菌株，小鼠死亡。型菌株，小鼠死亡。实验证明，实验证明，R R菌和菌和S S菌之间有转化现象菌之间有转化现象2 2、细菌培养实验、细菌培养实验3 3、S S型菌的无细胞抽提液试验型菌的无细胞抽提液试验以上实验说明：加热杀死的以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入存在一

5、种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞型细胞使其转变为使其转变为S型细胞。型细胞。热死热死S菌菌不生长不生长活活R菌菌长出长出R菌菌热死热死S菌菌+活活R菌菌长出大量长出大量R菌和菌和10-6S菌菌活活R菌菌+S菌无细胞抽提液菌无细胞抽提液长出大量长出大量R菌菌和少量和少量S菌菌平皿培养平皿培养肺炎链球菌肺炎链球菌1944年，年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子精确重复了转化实验，确定了转化因子实验证明，将实验证明，将R菌转化为菌转化为S菌的转化因子是菌的转化因子是DNA加加S菌菌DNA加加S菌菌DNA及及DNA酶以外的酶酶以外的酶加加S菌的菌的DNA和和DNA酶酶加加S菌的菌的

6、RNA加加S菌的菌的蛋白质蛋白质加加S菌的菌的荚膜多糖荚膜多糖活活R菌菌长出长出S菌菌只有只有R菌菌只有只有S型细菌的型细菌的DNA才能将才能将R型转化为型转化为S型型以以32P标记核酸做噬菌体感染实验标记核酸做噬菌体感染实验（1）含）含32P-DNA的一组：放射性的一组：放射性85%在沉淀中在沉淀中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含15%放射性放射性沉淀中含沉淀中含85%放射性放射性沉淀中含沉淀中含25%放射性放射性（2）含）含35S-蛋白质的

7、一组：放射性蛋白质的一组：放射性75%在上清液中在上清液中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含75%放射性放射性证明遗传物质是证明遗传物质是DNADNA而不是而不是蛋白质蛋白质（三）植物病毒重建实验（三）植物病毒重建实验实验证明，在实验证明，在RNA病毒中遗传物质是病毒中遗传物质是RNA通过三个具有历史意义的经典试验证明：只有核酸通过三个具有历史意义的经典试验证明：只有核酸才是负载遗传信息的真正物质。才是负载遗传信息的真正物质。二、遗传物质在微生物

8、细胞内存在的部位和方式二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式（一）遗传物质在（一）遗传物质在7个水平上的形式个水平上的形式1、细胞水平细胞水平2、细胞核水平细胞核水平3、染色体水平染色体水平4、核酸水平核酸水平5、基因水平基因水平6、密码子水平密码子水平7、核苷酸水平核苷酸水平（二）原核生物的质粒（二）原核生物的质粒1、定义、定义质粒（质粒（plasmid）：）：凡游离于原核生物核基因组以外，凡游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制的能力的小型共价闭合环状的具有独立复制的能力的小型共价闭合环状的dsDNA分分子。子。质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；质粒所含的基因对宿主细胞一般是非

9、必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。的机能，从而使宿主得到生长优势。2、结构特点、结构特点通常以通常以共价闭合环状共价闭合环状简称简称CCC)的的超螺旋超螺旋双链双链DNA分子存在于细胞中；分子存在于细胞中；质粒分子的大小范围从质粒分子的大小范围从1kb左右到左右到1000kb；（细菌质粒多在（细菌质粒多在10kb以内）以内）1SC构型构型:共价闭合环形共价闭合环形DNA（cccDNA)2OC构型构型:开环开环DNA（ocDNA)3L构型构型:线形分子（线形分子（LDNA）质粒质粒DNA分子具有三种

10、不同的构型分子具有三种不同的构型：在琼脂糖凝胶电泳中，不同构在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒型的同一种质粒DNA，电泳迁，电泳迁移速度不同。移速度不同。超螺旋超螺旋线形线形开环开环 3、质粒的类型、质粒的类型严谨型质粒严谨型质粒(stringentplasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数低拷贝数松弛型质粒松弛型质粒(relaxedplasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数高拷贝数窄宿主范围质粒窄宿主范围质粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）（只能在

11、一种特定的宿主细胞中复制）广宿主范围质粒广宿主范围质粒(broadhostrangeplasmid)（可以在许多种细菌中复制）（可以在许多种细菌中复制）4、质粒在基因工程中的应用、质粒在基因工程中的应用质粒的优点：质粒的优点：（1）相对分子量小，易分离和）相对分子量小，易分离和操作操作（2）环状，稳定）环状，稳定（3）独立复制）独立复制（4）拷贝数多）拷贝数多（5）存在标记位点，易筛选）存在标记位点，易筛选E.coli的的pBR322质粒质粒5、质粒的检测、质粒的检测t提取所有胞内提取所有胞内DNA后电镜观察；后电镜观察；t超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；t对于

12、实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。如抗药性初步判断。6、质粒的主要种类、质粒的主要种类质粒所编码质粒所编码的功能和赋的功能和赋予宿主的表予宿主的表型效应型效应致育因子致育因子（Fertilityfactor，F因子）因子）抗性因子抗性因子（Resistancefactor，R因子）因子）Col质粒质粒（colicinplasmid）Ti质粒质粒（tumorinducingplasmid）Ri质粒质粒（rotinducingplasmid）降解性质粒（降解性质粒（degradativeplasmid)Mega质粒质粒（megapla

13、smid）第二节第二节基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种一、基因突变一、基因突变指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。基因突变基因突变狭义：点突变狭义：点突变广义：基因突变和染色体畸变广义：基因突变和染色体畸变野生型（原始性状）野生型（原始性状）基因突变基因突变突变型（新性状）突变型（新性状）（一）突变类型（一）突变类型1、根据突变的原因分为、根据突变的原因分为自发突变自发突变诱发突变诱发突变2、根据突变株的、根据突变株的表型分为表型分为营养缺陷型营养缺陷

14、型抗性突变型抗性突变型条件致死突变型条件致死突变型选择性突变株选择性突变株非选择性突变株非选择性突变株形态突变型形态突变型抗原突变型抗原突变型产量突变型产量突变型（二）突变率（二）突变率某一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。某一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。（三）（三）基因突变的特点基因突变的特点1、自发性、自发性2、不对应性、不对应性3、稀有性、稀有性4、独立性、独立性5、可诱变性、可诱变性6、稳定性、稳定性7、可逆性、可逆性（四）基因突变及其机制（四）基因突变及其机制基基因因突突变变自发突变自发突变诱发突变诱发突变点突变点突变转换：转换：AGTC颠换：颠换：ATACGCCT

15、碱基碱基置换置换移码移码突变突变缺失：缺失：ABCABABCA.添加添加:ABCABCABCA.染色染色体畸体畸变变缺失缺失:abcghijkl添加添加重复重复:abcabcdef插入插入:abcpqrdef易位（转座）易位（转座）abcpqrghi.倒位倒位:abcfedghi.1、诱发突变：是通过人为的方法、诱发突变：是通过人为的方法,利用物理、化学利用物理、化学和生物的因素显著提高突变频率的作法和生物的因素显著提高突变频率的作法.（1）碱基的置换）碱基的置换包括转换和颠换包括转换和颠换碱基的置换引起的突变碱基的置换引起的突变同义同义突变突变：密码子虽然改变，然而所编码的氨基酸还是原来的：

16、密码子虽然改变，然而所编码的氨基酸还是原来的氨基酸，那么这一密码子称为同义密码子，这样的突变为同义突氨基酸，那么这一密码子称为同义密码子，这样的突变为同义突变或沉默突变。它对该蛋白质的功能没有影响变或沉默突变。它对该蛋白质的功能没有影响.无义无义突变突变：由于某一碱基的替换，使原来编码某一氨基酸的密由于某一碱基的替换，使原来编码某一氨基酸的密码子突变成为终止密码子码子突变成为终止密码子UAA、UGA、UAG中的一种，致使中的一种，致使肽键的合成提前终止，肽键缩短，成为没有活性的多肽片段。肽键的合成提前终止，肽键缩短，成为没有活性的多肽片段。错义错义突变突变：在基因中由于碱基对的替换，使在基因中

17、由于碱基对的替换，使mRNA分子中分子中编码某一氨基酸的密码子变成编码另一氨基酸的密码子。编码某一氨基酸的密码子变成编码另一氨基酸的密码子。酪氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸天冬氨酸天冬氨酸（2）移码突变：）移码突变：指诱变剂会使指诱变剂会使DNA序列中的一个或少数几个核序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添（插入），从而使该处后面的全部遗传密码的阅读苷酸发生增添（插入），从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和翻译错误的一类突变。框架发生改变，并进一步引起转录和翻译错误的一类突变。（3）染色体畸变：）染色体畸变：某些强烈理化因子（电离辐射和烷化剂、某些强烈理化因子（电离辐射和烷

18、化剂、亚硝酸）等引起的亚硝酸）等引起的DNA分子的大损伤。分子的大损伤。包括包括:缺失、重复、插入、易位、倒位缺失、重复、插入、易位、倒位2、自发突变：是指生物体在无人为干预下自然发生、自发突变：是指生物体在无人为干预下自然发生的低频率突变的低频率突变.原因：原因：（1）背景辐射和环境因素）背景辐射和环境因素（2）有害产物积累）有害产物积累（3）碱基错配）碱基错配（4）由转座子引起的插入或缺失）由转座子引起的插入或缺失（五）紫外线对（五）紫外线对DNA的损伤及其修复的损伤及其修复嘧啶嘧啶嘧啶二聚体嘧啶二聚体UV1、光复活作用、光复活作用嘧啶二聚体嘧啶二聚体嘧啶嘧啶光解酶光解酶黑暗黑暗光照光照2

19、、切除修复切除修复1、由、由核酸内切酶核酸内切酶切开二聚体切开二聚体的的5末端，形成末端，形成3-OH和和5-P的单链缺口的单链缺口2、核酸外切酶核酸外切酶从从5-P到到3-OH方向切除二聚体，并扩大方向切除二聚体，并扩大缺口。缺口。3、DNA聚合酶聚合酶以另一条互补以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合成缺失片段。端起合成缺失片段。4、连接酶连接酶将新合成的将新合成的3-OH与原有的与原有的5-P相连接。相连接。3、重组修复、重组修复这是一种越过损伤而进这是一种越过损伤而进行的修复，通过复制后，行的修复，通过复制后，经染色体减缓，使子链经染色体减缓，使

20、子链上的空隙并不为不再对上的空隙并不为不再对着嘧啶二聚体，而是面着嘧啶二聚体，而是面对正常的单链，在这种对正常的单链，在这种情况下，情况下，DNA聚合酶和聚合酶和连接酶便能起作用，把连接酶便能起作用，把空隙部分进行修复。空隙部分进行修复。4、SOS修复修复是一种旁路系统，它允许新生的是一种旁路系统，它允许新生的DNA链越过嘧啶二聚体而生长。链越过嘧啶二聚体而生长。二、突变与育种二、突变与育种（一）自发突变与育种（一）自发突变与育种：从生产中选育从生产中选育定向培育优良菌株定向培育优良菌株（二）诱变育种（二）诱变育种1、诱变育种的基本环节、诱变育种的基本环节2、诱变育种的原则、诱变育种的原则（1

21、）使用简便有效的）使用简便有效的诱变剂诱变剂诱变剂诱变剂物理因素物理因素化学因素化学因素紫外线紫外线激光激光离子束离子束X射线射线r射线射线快中子快中子烷化剂（烷化剂（NTG）碱基类似物碱基类似物吖啶化合物吖啶化合物（2）选用优良的出发菌株）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液处理单细胞或单孢子悬浮液（4）使用最佳诱变剂量）使用最佳诱变剂量（5）充分利用复合处理协同效应）充分利用复合处理协同效应（6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标（7）设计高效率筛选方案）设计高效率筛选方案（8）创造新型、高效筛选方法）创造新型、高效筛选方法3、诱变育

22、种的基本过程：、诱变育种的基本过程：选择合适的出发菌株选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液制备待处理的菌悬液诱变处理诱变处理筛选筛选保藏和扩大试验保藏和扩大试验诱变处理：诱变处理：诱变剂的作用：诱变剂的作用：提高突变的频率提高突变的频率 扩大产量变异的幅度扩大产量变异的幅度 使产量变异朝着正突变或负突变移动使产量变异朝着正突变或负突变移动选择诱变剂的种类：选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用效果下，应选用最方便最方便的因素；而在同样方便的情况的因素；而在同样方便的情况下，则应选择下，则应选择最高效最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以的因

23、素。在物理诱变剂中，尤以紫外线紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的变效果最为显著的“超诱变剂超诱变剂”，如，如NTG。诱变处理方式：诱变处理方式：单一因子处理：单一因子处理：重复使用重复使用复合因子处理：复合因子处理：两种以上因素两种以上因素先后使用先后使用同时使用同时使用实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初初筛筛和和复筛复筛两步进行。两步进行。初筛的目的初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株删去明确不符合要求的大部分菌株，把生，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，

24、使优良性状的菌株不产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；至于漏网；因此，初筛工作以因此，初筛工作以量量为主，测定的精确为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。复筛的目的：复筛的目的：确认符合要求的菌株确认符合要求的菌株；复筛以复筛以质质为主，为主，应精确测定每个菌株的生产指标。应精确测定每个菌株的生产指标。筛选是筛选是最为艰难的也是最为重要最为艰难的也是最为重要的步骤的步骤.定义：定义：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途经转移在一起，形成新的稳定基因组的过的途经转移在一起，形成

25、新的稳定基因组的过程称为基因重组或遗传重组。程称为基因重组或遗传重组。作用：作用：重组可使生物体在未发生突变的情况下，重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。也能产生新遗传型的个体。第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组（一）转化（一）转化受体菌直接摄取供体菌的受体菌直接摄取供体菌的DNA片段，而获得后者部分遗传片段，而获得后者部分遗传性状的的现象，称为转化。性状的的现象，称为转化。供体菌供体菌受体菌受体菌DNA片段片段1928年，年，Griffith发现肺炎链球菌（发现肺炎链球菌（Streptococcus pneu

26、moniae）的转化现象的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力力1、建立了感受态的受体细胞、建立了感受态的受体细胞感受态细胞：感受态细胞：具有摄取外源具有摄取外源DNA能力的细胞能力的细胞 自然感受态自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌 自身的基因控制；自身的基因控制；人工感受态人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNADNA的的 能力，或人为地将能力，或人为地将DNADNA导入细胞内导入细胞内2、外源游离、外源游离DNA分子（

27、转化因子）分子（转化因子）进行自然转化，需要二方面必要的条件：进行自然转化，需要二方面必要的条件：转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）指用提纯的病毒核酸（指用提纯的病毒核酸（DNA或或RNA）去感染其宿主）去感染其宿主细胞或其原生质，可增殖出一群病毒的后代，这种现细胞或其原生质，可增殖出一群病毒的后代，这种现象称为转染（象称为转染（transfection）。）。转染转染(transfection)：（二）细菌的转导（二）细菌的转导（transduction）以以缺陷噬菌体缺陷噬菌体为媒介，将供体细胞的为媒介，将供体细胞的DNADNA片段携带到受体细胞中，片段携

28、带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。称为转导。细菌转导的类型：细菌转导的类型：普遍转导普遍转导局限转导局限转导完全普遍转导完全普遍转导流产普遍转导流产普遍转导低频转导低频转导高频转导高频转导溶源转变溶源转变（三）接合（三）接合(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程和重组过程1946年，年，JoshuaLederbergEdwardL.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验细菌的多重营养缺陷型杂交实验中间平板

29、上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。交换和重组所致。（四）原生质体融合（四）原生质体融合通过人为的方法，通过人为的方法，使遗传性状不同使遗传性状不同的两个细胞的原的两个细胞的原生质体进行融合，生质体进行融合，即以获得兼有双即以获得兼有双亲遗传性状的稳亲遗传性状的稳定重组子定重组子（一）有性杂交（一）有性杂交w一般指不同遗传型的一般指不同遗传型的两性细胞两性细胞间发生的接合和随之进行的染色间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。细胞（细胞（）细胞（）细胞

30、（）有性接合有性接合染色体重组染色体重组新遗传型新遗传型能产生有性能产生有性孢子的酵母孢子的酵母菌、霉菌和菌、霉菌和蕈菌都可以蕈菌都可以进行有性杂进行有性杂交交二、真核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组主要有：有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化主要有：有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化（二）准性杂交（二）准性杂交同种生物的两个不同的同种生物的两个不同的体细胞体细胞发生融合，以有丝分裂的方式而发生融合，以有丝分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子的杂交方式。导致低频率的基因重组并产生重组子的杂交方式。细胞（细胞（）细胞（）细胞（）准性接合准性接合基因重组基因重组新遗传

31、型新遗传型菌丝联结菌丝联结质配质配核配核配有丝分裂交换有丝分裂交换单倍体杂合子单倍体杂合子半半知知菌菌的的准准性性生生殖殖第四节第四节 基因工程基因工程 特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性特点：可设计性、稳定性、远缘性、风险性一、基因工程的概念和特点一、基因工程的概念和特点定义：是指人们利用分子生物学的理论和技术，定义：是指人们利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核心自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核心-基因，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，基因，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，以最大限度地满足人类活动的需要。以最大限度地满足人类活动的需要。获得目的

32、基因获得目的基因选择基因载体选择基因载体体外重组体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）筛选和鉴定筛选和鉴定工程菌或工程细胞的大规模培养工程菌或工程细胞的大规模培养二、基因工程的基本操作二、基因工程的基本操作第五节第五节 菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；变异；b）污染；污染；c）死亡。死亡。一、菌种的衰退与复壮一、菌种的

33、衰退与复壮菌种衰退的原因菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变大量群体中的自发突变纯菌种纯菌种自发突变自发突变不纯菌种不纯菌种突变个体突变个体传代增殖传代增殖原始个体原始个体衰退衰退菌种菌种衰退：菌种出现或表现出负变性状衰退：菌种出现或表现出负变性状菌种衰退的具体表现：菌种衰退的具体表现：1、原有的形态、性状变得不典型了、原有的形态、性状变得不典型了2、生长速度变慢，产生孢子变少、生长速度变慢，产生孢子变少3、代谢产物生产能力下降、代谢产物生产能力下降4、致病菌对宿主的侵袭力的下降、致病菌对宿主的侵袭力的下降5、对外界不良条件包括低温、高温等抵抗力下降、对外界不良条件包括低温、高温等抵抗力下降1

34、）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。得具有原有典型性状的菌种。a）纯种分离；纯种分离；b）通过寄主体进行复壮；通过寄主体进行复壮；c）淘汰已衰退的个体）淘汰已衰退的个体2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选日常的菌种维护工作中不断筛选“正变正变”个体。个体。菌种的复壮：菌种的复壮：二、防止衰退的措施二、防止衰退的措施1）减少传代次数；）减少传代次数；2）创造良好的培养条件；）创造良好的培养条件；3）利用不易衰退的细胞后代）利用不易衰退

35、的细胞后代4）采用有效的菌种保藏方法；）采用有效的菌种保藏方法；基本方法基本方法培养基传代培养（培养基传代培养（斜面、平板）斜面、平板）寄主传代培养寄主传代培养低温（低温（液氮、低温冰箱）液氮、低温冰箱）干燥（干燥（沙土管、真空干燥）沙土管、真空干燥）生活态生活态休眠态休眠态三、菌种保藏三、菌种保藏目的：目的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用以供研究、生产、交换之用基本原则：基本原则：1、挑选典型菌种的优良纯种、挑选典型菌种的优良纯种2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体3、创造有利于休眠的保藏环境（如

36、干燥、低温）、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温）4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株要的微生物菌株遗遗传传变变异异和和育育种种物质基础：物质基础：DNA或或RNA存在的部位和方式存在的部位和方式质粒质粒定义定义构型构型优点优点种类种类基因突变：定义和特点以及分类基因突变：定义和特点以及分类遗传遗传变异变异和育和育种种DNA损伤的修复机制损伤的修复机制诱变育种的原则诱变育种的原则诱变育种的基本过程诱变育种的基本过程知识结构知识结构基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种原核生物的基因重组原核生物的基因重组真核微生物的基因重组真核微生物

37、的基因重组基因工程基因工程概念概念基本操作基本操作菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退、复壮和保藏1、已、已知知DNA的的碱碱基基序序列列为为CATCATCAT，什什么么类类型型的的突突变变可可使使其其突突变变为：为：CTCATCAT()A.缺缺失失B.插插入入C.颠颠换换D.转转换换2、已、已知知DNA的的碱碱基基序序列列为为CATCATCAT，什什么么类类型型的的突突变变可可产产生生如如下下碱碱基基序序列列的的改改变：变：CACCATCAT？()A.缺缺失失B.插插入入C.颠颠换换D.转转换换3、不、不需需要要细细胞胞与与细细胞胞之之间间接接触触的的基基因因重重组组类类型型有有()A.接接合合

38、和和转转化化B.转转导导和和转转化化C.接接合合和和转转导导D.接接合合4、转、转化化现现象象不不包包括括()A.DNA的的吸吸收收B.感感受受态态细细胞胞C.限限制制修修饰饰系系统统D.细细胞胞与与细细胞胞的的接接触触5、以、以下下碱碱基基序序列列中中哪哪个个最最易易受受紫紫外外线线破破坏？坏？A.AGGCAAB.CTTTGAC.GUAAAUD.CGGAGA6、一、一个个大大肠肠杆杆菌菌(E.coli)的的突突变变株，株，不不同同于于野野生生型型菌菌株，株，它它不不能能合合成成精精氨氨酸，酸，这这一一突突变变株株称称为：为：A.营营养养缺缺陷陷型型B.温温度度依依赖赖型型C.原原养养型型D.

39、抗抗性性突突变变型型7、在、在普普遍遍性性转转导导中，中，同同源源DNA分分子子的的交交换换要要求：求：A.转转座座子子B.插插入入序序列列C.DNA链链的的断断裂裂和和重重新新连连接接D.反反转转录录8、抗药性质粒（、抗药性质粒（R因子）在医学上很重要是因为它们：（因子）在医学上很重要是因为它们：（）A.可引起某些细菌性疾病可引起某些细菌性疾病B.携带对某些抗生素的特定抗性基因携带对某些抗生素的特定抗性基因C.将非致病细菌转变为致病菌将非致病细菌转变为致病菌D.可以将真核细胞转变为癌细胞可以将真核细胞转变为癌细胞9、证明核酸是遗传物质的三个经典实验是、证明核酸是遗传物质的三个经典实验是_、_

40、和和_；而证明基因突变自发性和不对应性的三个经典实验又是而证明基因突变自发性和不对应性的三个经典实验又是_、_和和_。10、质粒根据分子结构可有、质粒根据分子结构可有_、_和和_三种构型三种构型1、细胞水平、细胞水平真核微生物：细胞核真核微生物：细胞核原核微生物：核区原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的2、细胞核水平、细胞核水平真核生物真核生物细胞核细胞核核染色体核染色体原核生物原核生物核区核区DNA链链核基因组核基因组在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质3、染色体水平、染色体水

41、平染色体是由组蛋白与染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构构成的线状结构染色体的数目在不同的生染色体的数目在不同的生物中是不同的物中是不同的染色体的倍数在同一生物染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的的不同生活时期是不同的4、核酸水平、核酸水平核酸种类：核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链；核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异长度：因种而异5、基因水平、基因水平基因是生物体基因是生物体内一切具有自内一切具有自主复制能力的主复制能力的最小遗传功能最小遗传功能单位单位6、密码子水平、密码子水平7、核苷酸水平、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位

42、和交换单位核苷酸是最小突变单位和交换单位（1）致育因子）致育因子(Fertilityfactor，F因子因子)又称又称F质粒，其大小约质粒，其大小约100kb，决定性别并有转移能力决定性别并有转移能力u携带携带F质粒的菌株称为质粒的菌株称为F+菌株（相菌株（相当于雄性）当于雄性）u无无F质粒的菌株称为质粒的菌株称为F-菌株（相当菌株（相当于雌性）。于雌性）。存在状态存在状态游离状态游离状态(F+)与染色体相结合的与染色体相结合的(Hfr)（2）抗性因子（）抗性因子（Resistancefactor，R因子）因子）包括抗药性和抗重金属二大类，简称包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。质粒。抗性

43、质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。R质粒质粒抗性转移因子（抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因转移和复制基因抗性决定因子抗性决定因子：抗性基因：抗性基因R100质粒质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（汞（mercuricion，mer）磺胺磺胺(Sulfonamide,Sul)、链霉素链霉素(Streptomycin,Str)、夫西地酸（夫西地酸（fusidicacid，fus）、氯霉素氯霉素(Chlorampenicol,Cml)、四环素（四环素（tetracycl

44、ine，tet）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。大肠菌素是一种细菌蛋白，只杀死近缘且不含大肠菌素是一种细菌蛋白，只杀死近缘且不含Col质质粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素的影响。粒的菌株，而宿主不受其产生的细菌素的影响。（3）Col质粒（大肠杆菌素质粒）质粒（大肠杆菌素质粒）（4）诱癌质粒（）诱癌质粒（Ti质粒）质粒）是引起双子叶植冠瘿瘤的致病因子。是一种是引起双子叶植冠瘿瘤的致病因子。是一种200kb的环的环状质粒。状质粒。包括：毒性区、接合转移区、复制起始区和包括：毒性区、接合转移区、复制起始区和T-DNA区区4部分部分（5

45、）Ri质粒（质粒（rotinducingplasmid是在发根土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形是在发根土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链双链DNA分子。可侵染双子叶植物的根部，幷诱生大量毛状的分子。可侵染双子叶植物的根部，幷诱生大量毛状的不定根。不定根。在实践中成为外源基因的良好载体在实践中成为外源基因的良好载体（6）降解性质粒（）降解性质粒（degradativeplasmid)将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。，环境保护方面具有重要的意义。只存在于假

46、单胞菌属只存在于假单胞菌属具有降解一些有毒化合物，具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物如芳香簇化合物(苯苯)、农药、农药、辛烷和樟脑等的能力。辛烷和樟脑等的能力。（7）mega质粒质粒（megaplasmid）巨大质粒巨大质粒根瘤菌属中存在的与共生固氮有关的大型质粒，根瘤菌属中存在的与共生固氮有关的大型质粒，分子量为分子量为23108.基因突变自发性和不对应性的实验证明基因突变自发性和不对应性的实验证明三个经典实验三个经典实验变量实验变量实验涂布实验涂布实验影印实验影印实验证明突变是自发产生证明突变是自发产生的，并且突变的的，并且突变的性状性状与引起突变的与引起突变的原因原因间间无直接对应关

47、系无直接对应关系。变量实验（变量实验（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969变量实验（变量实验（fluctuationanalysis）Newcombe的涂布实验（的涂布实验（1949）影印实验（影印实验（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）JoshuaLederbergJ.Lederberg is awarded the Nobl

48、e Prize in J.Lederberg is awarded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 1958Medicine and Physiology in 19581、普遍转导、普遍转导噬菌体可以转导噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分供体菌染色体的任何部分到受体细胞中到受体细胞中的转导过程的转导过程普遍性转导的三种后果：普遍性转导的三种后果：外源外源DNA被降解，被降解，转导失败转导失败。完全普遍转导完全普遍转导流产转导流产转导普遍转导普遍转导2、局限转导、局限转导指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到指通过部

49、分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中受体菌中,并获得表达的转导现象。并获得表达的转导现象。局限转导与普遍转导的主要区别：局限转导与普遍转导的主要区别：a）局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，连接，与噬菌体与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。的个别基因导入受体，故称为

50、局限性转导。而普遍性而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。转导携带的宿主基因具有随机性。是一个与转导相似又不同的现象是一个与转导相似又不同的现象温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象新性状的现象3、溶源转变、溶源转变复制子复制子限制性内切酶位点限制性内切酶位点选择性遗传标记选择性遗传标记可大量增殖可大量增殖载体的特性载体的特性常用载体常用载体原核受体细胞：原核受体细胞：松弛型细菌质粒、松弛型细菌质粒、噬菌体噬菌体真核细胞受体：真核细胞受体：SV40病毒（