第8章遗传变异和育种下课件.ppt

1、第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组转化转化转导转导接合接合原生质体融合原生质体融合自然条件下自然条件下的基因重组的基因重组接合接合(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）因子介导）转导转导(transduction)：由噬菌体介导由噬菌体介导自然遗传转化自然遗传转化(natural genetic transformation)：游离游离DNA分子分子+感受态细胞感受态细胞一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组（一）细菌的遗传转化（一）细菌的遗传转化定义：定义：同源或异源的游离同源

2、或异源的游离DNA分子分子(质粒和染色体质粒和染色体DNA)被自然被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程自然遗传转化（自然遗传转化（natural genetic transformation）人工转化（人工转化（artificial transformation）感受态细胞：感受态细胞：具有摄取外源具有摄取外源DNA能力的细胞能力的细胞（competent cell）一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组自然感受态与人工感受态的不同？自然感受态与人工感受态的不同？自然感受态自然感受态的出现是细胞一定生长阶段

3、的生理特性，的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制；受细菌自身的基因控制；人工感受态人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有则是通过人为诱导的方法，使细胞具有 摄取摄取DNADNA的能力，或人为地将的能力，或人为地将DNADNA导入细胞内。导入细胞内。（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）（该过程与细菌自身的遗传控制无关！）（一）细菌的遗传转化（一）细菌的遗传转化1、自然遗传转化（简称自然转化）、自然遗传转化（简称自然转化）1928年，年，Griffith发现肺炎链球菌（发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象的转化现象目前已知有二十多个

4、种的细菌具有自然转化的能力目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行自然转化，需要二方面必要的条件：进行自然转化，需要二方面必要的条件：建立了感受态的受体细胞建立了感受态的受体细胞外源游离外源游离DNA分子分子枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）细菌的转化模型细菌的转化模型（一）细菌的遗传转化（一）细菌的遗传转化外源外源DNADNA单链的整合单链的整合（一）细菌的遗传转化（一）细菌的遗传转化自然转化过程的特点：自然转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；对核酸酶敏感；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（转化是否成功

5、及转化效率的高低主要取决于转化（DNA）给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；通常情况下质粒的自然转化效率要低得多；提高质粒的自然转化效率的二种方法：提高质粒的自然转化效率的二种方法：1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有 活性的质粒的几率大大提高；活性的质粒的几率大大提高；2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-重组

6、获救重组获救b）不需要活的不需要活的DNA给体细胞；给体细胞；噬菌体噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒转染转染(transfection)：现在把现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染转移至动物细胞的过程也称转染提纯的噬菌体提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。并表达后产生完整的病毒颗粒。特点：特点：自然遗传转化的进行涉及到细菌染色体上几十个自然遗传转化的进行涉及到细菌染色体上几十个基因的功能及彼此间的相互协调，因此被认为是基因的功能及彼此间的相互协调，因此被认为是名

7、副其实名副其实 的细菌水平基因转移途径。的细菌水平基因转移途径。目前的研究热点：目前的研究热点：1）细菌为什么要耗费如此多的染色体遗传资源来进行自然转化，）细菌为什么要耗费如此多的染色体遗传资源来进行自然转化，即该过程的生物学意义到底何在？它对细菌自身有什么好处？即该过程的生物学意义到底何在？它对细菌自身有什么好处？（人们已提出了一些假说，但均不圆满）（人们已提出了一些假说，但均不圆满）2）自然转化过程的很多细节仍不清楚，包括细菌如何协调感受态）自然转化过程的很多细节仍不清楚，包括细菌如何协调感受态 的建立，外源的建立，外源DNA进入和重组的具体过程等等进入和重组的具体过程等等3）细菌中具有自

8、然转化能力的范围，到底有那些菌具有自然）细菌中具有自然转化能力的范围，到底有那些菌具有自然 转化能力？转化能力？4）转化）转化DNA的来源和在自然环境中发生的自然转化的来源和在自然环境中发生的自然转化水环境和陆地环境中通过游离水环境和陆地环境中通过游离DNADNA进行的基因转移（转化）进行的基因转移（转化）（一）细菌的遗传转化（一）细菌的遗传转化2、人工转化、人工转化用用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。是

9、基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源种可以摄取外源DNA的的“人工感受态人工感受态”。质粒的转化效率高；质粒的转化效率高；（二）细菌的转导（二）细菌的转导（transduction）由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒D

10、NA带到另一个细菌的噬菌体称为带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体转导噬菌体细菌转导的二种类型：细菌转导的二种类型：普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导1、普遍性转导（、普遍性转导（generalized transduction）噬菌体可以转导噬菌体可以转导给体染色体的任何部分给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程到受体细胞中的转导过程(1)意外的发现意外的发现19511951年，年，Joshua Joshua LederbergLederberg和和Norton Norton ZinderZinder为了证实大肠杆菌以外为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同

11、的多重营养缺陷型的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：用用“U”U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！不接触的情况下，同样出现原养型细菌！沙门氏菌沙门氏菌LT22A是携带是携带P22噬菌体的溶源性细菌噬菌体的溶源性细菌 另另一株是非溶源性细菌一株是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过基因的传递很可能是由可透

12、过“U”型管滤板型管滤板的的P22噬菌体介导的噬菌体介导的（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）(2)转导模型转导模型转导噬菌体为什么转导噬菌体为什么“错错”将宿主的将宿主的DNADNA包裹进去包裹进去?噬菌体的噬菌体的DNADNA包装酶包装酶酶也能识别染色体酶也能识别染色体DNADNA上类似上类似pacpac的位点的位点并进行切割，以并进行切割，以“headfulheadful”的包装机制包装进的包装机制包装进P22P22噬菌体外壳，噬菌体外壳，形成只含宿主形成只含宿主DNADNA的转导噬菌体颗粒的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）（假噬菌体）。因为染色

13、体上的因为染色体上的pacpac与与P22 DNAP22 DNA的的pacpac序列不完全相同，序列不完全相同，利用效率较低，这种利用效率较低，这种“错装错装”机率一般仅约机率一般仅约1010-6-6-10-10-8-8形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主但必须具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿的包装机制并在宿主基因组完全降解以前进行包装。主基因组完全降解以前进行包装。普遍性转导的基本要求：普遍性转导的基本要求：普遍性转导的三种后果：进入受体的外源进入受体的外源DNA通过与细胞染色体通过与细胞染色体的重组

14、交换而形成稳定的转导子的重组交换而形成稳定的转导子流产转导（流产转导（abortive transduction）转导转导DNA不能进行重组和复制，但其不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落特点：在选择培养基平板上形成微小菌落外源外源DNA被降解，转导失败。被降解，转导失败。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。2、局限性转导（、局限性转导（specialized transdu

15、ction）温和噬菌体感染温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时，溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主在前噬菌体二侧的少数宿主基因因偶尔发生的不正常切基因因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体割而连在噬菌体DNA上上部分缺陷的温和噬菌体部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中2、局限性转导（、局限性转导（specialized transduction）温和噬菌体温和噬菌体裂解时的裂解时的不正常切割：不正常切割：包含包含galgal或或bio

16、bio基因基因（几率一般仅有（几率一般仅有1010-6-6）缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的缺陷噬菌体在宿主细胞内能够象正常的DNADNA分子一样进行复制、分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。但没有正常噬菌体的但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过，感染受体细胞后，通过DNADNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。局限性转导与普遍性转导的主要区别：局限性转导与普遍性转导的主要区别：a）被转导的基因共价地与噬菌体被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体

17、连接，与噬菌体DNA一起一起 进行复制、包装以及被导入受体细胞中。进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的而普遍性转导包装的 可能全部是宿主菌的基因。可能全部是宿主菌的基因。b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因 导入受体，故称为局限性转导。导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基而普遍性转导携带的宿主基 因具有随机性。因具有随机性。2、局限性转导（、局限性转导（specialized transduction）溶源转变（溶源转变（lysogenic conversion）：）：一个与转导相似又不同

18、的现象一个与转导相似又不同的现象温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。溶源转变与转导的不同？溶源转变与转导的不同？a）不携带任何供体菌的基因；不携带任何供体菌的基因；b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；(三三)细菌的接合作用细菌的接合作用(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程遗传信息的转移和重组过程1.实验证据实验证据1946年

19、，年，Joshua Lederberg 和和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验细菌的多重营养缺陷型杂交实验中间平板上长出的原养型中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！遗传交换和重组所致！证实接合过程需要细胞间的直接接触的证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（型管实验（Bernard Davis，1950）2.机制机制(大肠杆菌的接合机制大肠杆菌的接合机制)接合作用是由一种被称为接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导因子的质粒介导F因子上面有编码细菌产生性菌毛（因子上面有编码细菌产生性菌毛（sex pili）及控

20、制接合过程进行的及控制接合过程进行的20多个基因。多个基因。含有含有F因子的细胞：因子的细胞：“雄性雄性”菌株（菌株（F+），），其细胞表面有性菌毛其细胞表面有性菌毛 不含不含F因子的细胞：因子的细胞：“雌性雌性”菌株（菌株（F-），），细胞表面没有性菌毛细胞表面没有性菌毛F因子为附加体质粒因子为附加体质粒既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上F F因子的四种细胞形因子的四种细胞形式式a）F-菌株，菌株，不含不含F因子，没有性菌毛，但可以通过因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收接合作用接收 F因子而变成雄性

21、菌株（因子而变成雄性菌株（F+）；）；b）F+菌株，菌株，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c c）HfrHfr菌株，菌株，F F因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上上，细胞表面有性菌毛。，细胞表面有性菌毛。d d）FF菌株，菌株，Hfr菌株内的菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为因子，特称为F因因 子。子。细胞表面同样有性菌毛。细胞表面同样有性菌毛。1）F+F-杂交杂交杂交的结果：杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为给体细胞和受体细

22、胞均成为F+细胞细胞理化因子的处理可将理化因子的处理可将F因子消除而使因子消除而使F+菌株变成菌株变成F-菌株菌株F+菌株的菌株的F因子向因子向F-细胞转移，但含细胞转移，但含F因子的宿主细胞因子的宿主细胞的染色体的染色体DNA一般不被转移。一般不被转移。HfrHfr菌株的菌株的F F因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上，因此上，因此只要发生接合转移只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F F-细胞并发生重组细胞并发生重组，由此而得名为，由此而得名为高频重组菌株高频重组菌株。2 2）HfrHfr F-杂交杂交Hfr菌株仍然

23、保持着菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有细胞的特征，具有F性菌毛，并象性菌毛，并象F+一样与一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，缺口后，F因子的先导区因子的先导区(leading region)结合着染色体结合着染色体DNA向受体细向受体细胞转移，胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故因子不易转入受体细胞中，故HfrF-杂交后的受体细胞杂交

24、后的受体细胞(或接合子或接合子)大多数仍然是大多数仍然是F-。染色体上越靠近染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。中出现重组子的的时间就越早，频率也高。F因子不易转入受体细胞中，故因子不易转入受体细胞中，故HfrF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是数仍然是F-。中断杂交实验中断杂交实验中断杂交实验结果分析及定位中断杂交实验结果分析及定位大肠杆菌大肠杆菌K12K12的遗传图谱的遗传图谱3 3）FFF-杂交杂交Hfr菌株内的菌株内的F因子因不正常切割而脱离

25、染色体时，因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，因子，特称为特称为F因子。因子。FF-与与F+F-的不同：的不同：给体的给体的部分染色体基因随部分染色体基因随F一起转入受体细胞一起转入受体细胞a）与染色体发生重组；与染色体发生重组；b）继续存在于继续存在于F因子上，因子上，形成一种部分二倍体；形成一种部分二倍体；细胞基因的这种转移过程又常称为性导（细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、）、F因子转导因子转导（F-duction），），或或F因子媒介的转导（因子媒介的转导（F-mediated trans

26、duction）。）。接合接合(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）因子介导）转导转导(transduction)：由噬菌体介导由噬菌体介导自然遗传转化自然遗传转化游离游离DNA分子分子+感受态细胞感受态细胞“接合接合”“转导转导”及及“自然转化自然转化”这三种在自然界中这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：存在的细菌遗传重组过程各自的特点：a）外源外源DNA的来源及进入途径有差异；的来源及进入途径有差异；b）决定因素也各有不同；决定因素也各有不同；如何设计实验对三种途径进行区分？如何设计实验对三种途径进行区分？原生质体融合：原生质

27、体融合：通过人为的方法，使遗传性状不同的两通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。双亲遗传性状的稳定重组子的过程。技术路线：技术路线：亲本菌株亲本菌株A亲本菌株亲本菌株B脱壁脱壁方法？方法？原生质体原生质体A、B遗传标记遗传标记遗传标记遗传标记助融剂助融剂等渗培养基，再生出菌落等渗培养基，再生出菌落选择培养基，选择培养基，筛选目标菌筛选目标菌第五节第五节 菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，

28、否则生产或科研都无法正常进行。生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；变异；b）污染；污染；c）死亡；死亡；一、菌种的衰退与复壮一、菌种的衰退与复壮1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有 原有典型性状的菌种。原有典型性状的菌种。2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种 维护工作中不断筛选维护工作中不断筛选“正变正变”个体。个体。大量群体中的自发突变大量群体中的自发突变菌种的复壮：菌种的复壮：a）纯种分离；纯

29、种分离；b）通过寄主体进行复壮；通过寄主体进行复壮；菌种衰退的特点：菌种衰退的特点：二、防止衰退的措施二、防止衰退的措施1）减少传代次数；减少传代次数；2）创造良好的培养条件；）创造良好的培养条件；3）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；4）采用有效的菌种保藏方法；）采用有效的菌种保藏方法；三、菌种保藏三、菌种保藏在一定时间内使菌种不死、不变、不乱在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本要求：基本方法：基本方法：生活态生活态休眠态休眠态培养基传代培养培养基传代培养寄主传代培养寄主传代培养冷冻冷冻干燥干燥斜面、平板斜面、平板液氮、

30、低温冰箱液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥沙土管、冷冻真空干燥三、菌种保藏三、菌种保藏由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏

31、，以免因生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。某种方法的失败而导致菌种的丧失。思考题：思考题：1、如果二个不同营养缺陷标记（如果二个不同营养缺陷标记（a-b-c+d+和和 a+b+c-d-）的菌株经混合后能产生在基本培养基平板上生长的原养型重的菌株经混合后能产生在基本培养基平板上生长的原养型重组菌株，请设计一个实验来决定该遗传转移过程是转化、转组菌株，请设计一个实验来决定该遗传转移过程是转化、转导还是接合导还是接合?2、自然遗传转化与人工转化之间有什么关系自然遗传转化与人工转化之间有什么关系?为什么在一般为什么在一般情况下它们转化质粒的成功率有如此大的差别情况下它们转化质粒的成功率有如此大的差别?