第8章微生物遗传2课件.ppt

1、基因的水平转移：基因的水平转移：个体个体A个体个体B遗传物质遗传物质通过基因的重组可使后者（通过基因的重组可使后者（个体个体B）及其后代）及其后代的性状发生改变。的性状发生改变。细菌所特有的基因重组形式，有别于一般细菌所特有的基因重组形式，有别于一般有性过程有性过程中中的亲本和其后代之间遗传信息的的亲本和其后代之间遗传信息的垂直传递垂直传递形式。形式。细菌基因的水平转移和重组细菌基因的水平转移和重组本节重点：本节重点：三种基因水平转移方式及其应用三种基因水平转移方式及其应用 水平基因转移水平基因转移（Horizontal gene transfer,HGT），不仅发生在不同的不仅发生在不同的微

2、生物细胞之间微生物细胞之间，而且也发生在，而且也发生在微生物微生物与与高等动植物高等动植物之间。之间。生物间基因的转移和交换是普遍存在的，是生物进化的生物间基因的转移和交换是普遍存在的，是生物进化的重要动力之一。重要动力之一。第第3节节 细菌基因的水平转移和重组细菌基因的水平转移和重组细菌的三种水平基因转移形式细菌的三种水平基因转移形式接合（Conjugation）转导（Transduction）转化（Transformation）接合接合(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）转导转导(transduction)：由噬菌体介导自然遗传转化自然遗传转化(natural

3、genetic transformation)：游离DNA分子+感受态细胞一、细菌的接合作用(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程1.实验证据1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（Bernard Davis，1950）接合：接合：供体与受体细胞直供体与受体细胞直接接触，借性菌毛传递接接触，借性菌毛传递DNA，在受体细胞中发在受体细胞中发生交换、整合，使之获生交换、整合，使

4、之获得供体菌的遗传性状的得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受接合而获得新性状的受体细胞就称接合子。体细胞就称接合子。2.机制(大肠杆菌的接合机制)接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛（sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛 不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛第第3节节 细菌基因的水平转移和重组细菌基因的水平转移和重组细菌的三种水平基因转移形式细菌的三种水平基因转移形式接合转导转化二、细菌的转导（tra

5、nsduction）由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体转导噬菌体细菌转导的二种类型：普遍性转导普遍性转导局限性转导局限性转导AB-Try+his+Try-his+Try+his-定义：以温和定义：以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，

6、称转导子。获得新遗传性状的受体细胞，称转导子。1、普遍性转导（generalized transduction）噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程(1)意外的发现1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！三、细菌的遗传转化（genetic transformation）定义：同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得

7、到表达的水平方向水平方向的基因转移过程自然遗传转化（自然遗传转化（natural genetic transformation）人工转化（人工转化（artificial transformation）感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞（competent cell）R型型活菌活菌+S型死菌型死菌 S型活菌型活菌定义：受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体定义：受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的部分新的遗传性状的基因转移过

8、程，称为转化。转化后的的受体菌称为转化子（受体菌称为转化子（transformant）。）。有关名词：有关名词：受体菌：受体菌：recipient/receptor，转化基因的接受者转化基因的接受者供体菌：供体菌：donor，转化基因的提供者转化基因的提供者转化因子：来自供体菌的转化因子：来自供体菌的DNA片段片段转化子：转化子：transformant，将转化基因重组进入自身染色将转化基因重组进入自身染色体组的重组子体组的重组子转化（转化（transformation）1、转化及其发现：、转化及其发现：受体细胞要处于感受态受体细胞要处于感受态.感受态感受态：competence，受体细胞能从

9、环境吸取外受体细胞能从环境吸取外源源DNA片段并实现其转化的一种生理状态片段并实现其转化的一种生理状态供体供体DNA片段（片段（转化因子转化因子）大小适宜，分子量一大小适宜，分子量一般为般为1 107 D 左右左右 菌株间的亲缘关系密切菌株间的亲缘关系密切2、转化发生的条件：、转化发生的条件：3、转化的类型：、转化的类型：根据感受态建立的方式，可以分为：自然遗传转化自然遗传转化natural genetic transformation人工转化人工转化artificial transformation 感受态：感受态：出现时间出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受：只在细菌生长的

10、某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期态出现在不同生长时期 Streptococcus pneumoniae的感受态出现在生长曲线中的的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期；指数期的中期；Bacillus的一些种则往往出现在指数期末的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。及稳定期的初期。感受态由细胞的遗传性决定，但同时也受环境因子的影感受态由细胞的遗传性决定，但同时也受环境因子的影响：响：cAMP、Ca2+等最明显。如用等最明显。如用CaCl2 处理处理E.coli可以可以诱发其产生感受态。诱发其产生感受态。感受态细胞的比例：感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态当

11、处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同的细胞因菌种而不同.Bacillus subtilis不超过不超过1015%Streptococcus pneumonia和和Haemophilus influenzae（流（流感嗜血杆菌）达到感嗜血杆菌）达到100%转化转化DNA的最低浓度：的最低浓度：在群体中含有在群体中含有15%感受态细胞时，感受态细胞时，0.1 gDNA/ml细胞悬液即可有效发生转化细胞悬液即可有效发生转化1、自然遗传转化（简称自然转化）1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有

12、自然转化的能力进行自然转化，需要二方面必要的条件：建立了感受态的受体细胞感受态的受体细胞外源游离外源游离DNA分子分子2、人工转化用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态人工感受态”。质粒的转化效率高；接合(conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）转导(transduction)：由噬菌体介导自然遗传转化(natural genetic transformation)：游离

13、DNA分子+感受态细胞诱变育种：诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。株的一种育种方法。l诱变育种具有极其重要的实践意义诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。产性能的。第四节第四节 诱变育种诱

14、变育种可见，设计和采用效率高的筛选方案和方可见，设计和采用效率高的筛选方案和方法极其重要。法极其重要。以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：诱变诱变育种的步骤育种的步骤：原始菌种原始菌种纯化纯化斜面斜面/肉汤培养肉汤培养单孢子单孢子/单细胞悬液单细胞悬液诱变剂处理诱变剂处理平板分离平板分离移至斜面移至斜面小试小试中试中试初筛初筛复筛复筛计算存活率计算存活率观察形态变异，观察形态变异，挑单菌落挑单菌落良种保藏良种保藏原菌种特性鉴定原菌种特性鉴定诱变育种的基本过程：诱变育种的基本过程：选择选择合适的出发菌株选择选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液制备待处理的菌悬液诱变处理诱变处理筛选筛

15、选保藏和扩大试验保藏和扩大试验1.出发菌株的选择：出发菌株的选择：出发菌株出发菌株用来用来育种处理的育种处理的起始菌株起始菌株出发菌株应具备：出发菌株应具备：对诱变剂的敏感性高；对诱变剂的敏感性高；具有特定生产性状的能力或潜力；具有特定生产性状的能力或潜力；出发菌株的来源；出发菌株的来源；自然界直接分离到的野生型菌株：自然界直接分离到的野生型菌株：历经生产考验的菌株：历经生产考验的菌株：已经历多次育种处理的菌株：已经历多次育种处理的菌株：3.诱变处理：诱变剂的作用：提高突变的频率 扩大产量变异的幅度 使产量变异朝着正突变或负突变移动剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度

16、不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在70-80%）l选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。l简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反映的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是

17、：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变种。4.菌种筛选菌种筛选4.1 筛选方案：筛选方案：实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛和复筛两步进行。初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不产性状类似的菌株尽量保留

18、下来，使优良性状的菌株不至于漏网；至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精确因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。应精确测定每个菌株的生产指标。筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.第五节第五节 菌种保藏菌种保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退变异；使原有的优良性状发生负变，即菌种

19、的衰退（degeneration）b）污染；污染；c）死亡；死亡；一、菌种的衰退与复壮1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有 原有典型性状的菌种。2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种 维护工作中不断筛选“正变”个体。大量群体中的自发突变菌种的复壮：a）纯种分离；b）通过寄主体进行复壮；菌种衰退的特点：菌种的复壮措施菌种的复壮措施 菌落纯的分离方法（平板表面涂布法，平板划线分离法，琼脂培养基浇注法）细胞纯的分离方法（分离小室进行单细胞分离，显微操纵器进行单细胞分离，菌丝尖端切割法进行单细胞分离）（如Bacillus thuringiensis的复壮）（采用比较

20、激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）二、防止衰退的措施1）减少传代次数；减少传代次数；2）创造良好的培养条件；）创造良好的培养条件；3）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；4）采用有效的菌种保藏方法；）采用有效的菌种保藏方法；三、菌种保藏三、菌种保藏在一定时间内使菌种不死、不变、不乱在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法*沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类*产孢子微生物各大类36月612月12年110年515年以上简便简便简便简便有效简便、有效三、菌种保藏三、菌种保藏由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。