第19章补体的检测及应用课件.ppt
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- 19 补体 检测 应用 课件
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1、第第十九十九章章 补体检测及应用补体检测及应用 第一节第一节 概述概述 一、补体成分的含量与理化特性一、补体成分的含量与理化特性 二、补体的活化途径二、补体的活化途径 第二节第二节 补体总活性测定补体总活性测定 第三节第三节 单个补体成分的测定单个补体成分的测定 一、免疫溶血法一、免疫溶血法 二、免疫化学法二、免疫化学法 第四节第四节 补体结合试验补体结合试验 一、试验原理一、试验原理 二、试验方法二、试验方法 三、方法评价三、方法评价 第五节第五节 补体受体的测定补体受体的测定 第六节第六节 补体测定的应用补体测定的应用 思考题思考题 小结小结第一节第一节 概概 述述补体:补体:具酶样活性、
2、不耐热的糖蛋白具酶样活性、不耐热的糖蛋白 其存在与抗原性异物的刺激无关其存在与抗原性异物的刺激无关 在正常人血清中含量相对稳定在正常人血清中含量相对稳定 某些疾病时,含量及其活性可发生改变某些疾病时,含量及其活性可发生改变分分 类类一、一、补体成分的含量与理化特性补体成分的含量与理化特性根据补体系统的生物学功能,可将其分为:根据补体系统的生物学功能,可将其分为:补补体固有成分、补体调节蛋白、补体受体体固有成分、补体调节蛋白、补体受体(complement receptor,CR)三大部分三大部分。补体理化性质补体理化性质 由肝细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生由肝细胞、巨噬细胞以及
3、肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生 均为多糖蛋白,大多数电泳迁移率属均为多糖蛋白,大多数电泳迁移率属、球蛋白球蛋白 含量约占血清球蛋白总量的含量约占血清球蛋白总量的10%,其中,其中C3含量最高、含量最高、D因因子含量最低子含量最低 固有成份间的分子量差异较大,其中固有成份间的分子量差异较大,其中C1q最大、最大、D因子最因子最小。小。对热不稳定,对热不稳定,56C、30min即被灭活,即被灭活,010 C条件下条件下活性只能保持活性只能保持34d。多种理化因素如射线、机械振荡、酒精、胆汁和某些添加多种理化因素如射线、机械振荡、酒精、胆汁和某些添加剂等均可破坏补体剂等均可破坏补体补体补体成分成分分子
4、量分子量电泳电泳区带区带血清含量参考值血清含量参考值(g/ml)补体补体 成分成分分子量分子量电泳电泳区带区带血清含量参考值血清含量参考值(g/ml)C1q390270C979240C1r9535B95210240C1s8535D252C211712030P220225C319011300C1INH150180C41802430600C4bp1100250C5190275I因子因子9350C6128260H因子因子159400480C7120255S因子因子88500C81631200经典途径经典途径二、补体的活化途径二、补体的活化途径经典激活途径经典激活途径替代激活途径替代激活途径MBLMB
5、L途径途径激活物质激活物质抗原抗体复合物抗原抗体复合物肽聚糖、酵母多糖、脂多糖肽聚糖、酵母多糖、脂多糖MBLMBL相关的丝氨酸蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶起始分子起始分子C1qC1qC3C3C2C2、C4C4参与补体成分参与补体成分C1C1、C4C4、C2C2、C3C3、C5-C5-C9C9C3C3、C5-C9C5-C9、B B因子、因子、D D因子因子C2-C9C2-C9、MASPMASP所需离子所需离子CaCa2+2+、MgMg2+2+MgMg2+2+CaCa2+2+C3C3转化酶转化酶C4b2bC4b2bC3bBbC3bBbC4b2bC4b2bC5C5转化酶转化酶C4b2b3bC4b2b3b
6、C3bnBbC3bnBbC4b2b3bC4b2b3b生物学作用生物学作用参与特异性免疫的参与特异性免疫的效应阶段效应阶段,感染后期感染后期发挥作用发挥作用参与非特异性免疫的参与非特异性免疫的效应阶段效应阶段,感染早期感染早期发挥作用发挥作用参与非特异性免疫的参与非特异性免疫的效应阶段效应阶段,感染早期感染早期发挥作用发挥作用第二节第二节 补体总活性测定补体总活性测定 补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示,以补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示,以50%50%溶血溶血为判断终点,称为为判断终点,称为CH50CH50 补体活化途径不同,应用不同的激活物可活化不同的补体补体活化途径不同,应用
7、不同的激活物可活化不同的补体途径途径 基于经典途径的基于经典途径的CP-CH50CP-CH50(临床常规项目)(临床常规项目)应用于应用于C3C3旁路检测的旁路检测的AP-CH50AP-CH50(尚未列入检验常规)(尚未列入检验常规)MBLMBL途径活性测定的可靠方法暂未建立途径活性测定的可靠方法暂未建立(一)(一)CH50CH50测定法的原理测定法的原理 应用绵羊红细胞应用绵羊红细胞(sheep red blood cell,SRBC)和其相应和其相应的抗体(溶血素),作为能诱导补体活化经典途径的指示物的抗体(溶血素),作为能诱导补体活化经典途径的指示物和激活剂。补体能使溶血素特异性结合的绵
8、羊红细胞溶解,和激活剂。补体能使溶血素特异性结合的绵羊红细胞溶解,当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时,溶血程度与补体含量和当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时,溶血程度与补体含量和活性相关。将新鲜待检血清作不同稀释后,加入反应体系,活性相关。将新鲜待检血清作不同稀释后,加入反应体系,测定溶血程度,以测定溶血程度,以50%溶血时的最小血清用量作为判定终点,溶血时的最小血清用量作为判定终点,可测知补体总溶血活性可测知补体总溶血活性溶血程度与补体含量的关系溶血程度与补体含量的关系 在适当、稳定的反应系在适当、稳定的反应系统中,溶血反应与补体的统中,溶血反应与补体的剂量依赖关系呈现剂量依赖关系呈现“S”S”形曲
9、线形曲线 在轻微溶血和接近完全在轻微溶血和接近完全溶血时,补体量的变化对溶血时,补体量的变化对溶血程度的影响不大,即溶血程度的影响不大,即溶血对补体量的依赖不敏溶血对补体量的依赖不敏感。但在感。但在303070%70%溶血溶血时,补体含量仅出现较小时,补体含量仅出现较小的变动,溶血程度也会发的变动,溶血程度也会发生较大的改变生较大的改变 (二)(二)CH50CH50测定方法测定方法1.1.红细胞浓度的调整红细胞浓度的调整绵羊红细胞绵羊红细胞(SRBC)采自绵羊颈静脉,制备脱纤维羊血或)采自绵羊颈静脉,制备脱纤维羊血或用阿氏(用阿氏(Alsever)血液保存液制成抗凝血,)血液保存液制成抗凝血,
10、4保存备用。使保存备用。使用前,调制成用前,调制成2%5%SRBC悬液。为使红细胞浓度标准化,悬液。为使红细胞浓度标准化,可吸取少量红细胞悬液,加入可吸取少量红细胞悬液,加入2030倍的稀释液,在倍的稀释液,在542nm波长处测定吸光值以调整红细胞浓度。波长处测定吸光值以调整红细胞浓度。2.2.溶血素滴定溶血素滴定 溶血素可通过溶血素可通过SRBCSRBC免疫家兔获得,一般无需纯化免疫家兔获得,一般无需纯化 试验试验前需先行加热前需先行加热56 30min56 30min或或60 3min60 3min以灭活补体以灭活补体 溶血素有商品销售,可按标识效价稀释使用溶血素有商品销售,可按标识效价稀
11、释使用 自行制备的溶血素需进行滴定,确定使用浓度,在补体活自行制备的溶血素需进行滴定,确定使用浓度,在补体活性测定中,大多使用性测定中,大多使用2 2个单位。个单位。溶血素效价稳定,一般使用溶血素效价稳定,一般使用3 3个月后再作重新滴定个月后再作重新滴定 3.3.稀释缓冲液稀释缓冲液 4.50%4.50%溶血标准管溶血标准管:0.5ml 2%SRBC +2.0ml D.W (100%0.5ml 2%SRBC +2.0ml D.W (100%溶血溶血)+2.0 ml 1.8%NaCl+0.5ml 2%SRBC+2.0 ml 1.8%NaCl+0.5ml 2%SRBC(50%50%溶血)溶血)5
12、.50%5.50%溶血总补体值的计算溶血总补体值的计算CH50(U/ml)=1/CH50(U/ml)=1/血清用量血清用量 *稀释倍数稀释倍数(三)方法评价与临床意义 方法简便、快速,但敏感性低,补体的活性除与反应体积方法简便、快速,但敏感性低,补体的活性除与反应体积成反比外,还与反应所用的缓冲液、成反比外,还与反应所用的缓冲液、SRBCSRBC的数量以及反应温的数量以及反应温度有关度有关 总补体活性的参考范围为总补体活性的参考范围为5050100U/ml 100U/ml CH50CH50增高见于:增高见于:急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等 CH50CH50降低见于
13、:降低见于:系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎 、急性肾小球肾炎等急性肾小球肾炎等第第三三节节 单个补体成分的测定单个补体成分的测定 常作为单个补体成分的检测指标:常作为单个补体成分的检测指标:C3C3、C4C4、C1qC1q、B B因子和因子和C1C1酯酯酶抑制物等酶抑制物等 测定方法:测定方法:免疫溶血法免疫溶血法 (检测单个补体成分的活性(检测单个补体成分的活性,补体缺失性血清(补体缺失性血清(R R试试剂)剂)免疫化学法(检测单个补体成分的含量,免疫化学法(检测单个补体成分的含量,Ag-AbAg-Ab response respon
14、se)自动化免疫散射比浊法自动化免疫散射比浊法一、免疫溶血法一、免疫溶血法 定义定义:是根据补体参与抗体介导溶细胞作用的级联效应特征是根据补体参与抗体介导溶细胞作用的级联效应特征建立的单一补体成分检测法建立的单一补体成分检测法 指示系统指示系统:以以SRBC-SRBC-抗抗SRBCSRBC为激活物和指示系统为激活物和指示系统 参照体系参照体系:以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照 结果判度结果判度:若有溶血发生,表明待检标本存在参照血清所缺若有溶血发生,表明待检标本存在参照血清所缺乏的补体成分,且溶血程度与此补体成分的量呈正比,仍以乏的补体成分,且溶
15、血程度与此补体成分的量呈正比,仍以5050溶血为终点溶血为终点 参照血清常称之参照血清常称之“R(remove)”试剂试剂,即去除,即去除某种补体成分之意。已能筛选到的血清有人某种补体成分之意。已能筛选到的血清有人C2缺乏、缺乏、豚鼠豚鼠C4缺乏、小鼠缺乏、小鼠C5缺乏和家兔缺乏和家兔C6缺乏的血清缺乏的血清 免疫溶血法常用于免疫溶血法常用于C2、C3、C4、C5、C6等补体等补体成分的检测。其中以成分的检测。其中以C3、C4两成分的检测更为常见两成分的检测更为常见 二、免疫化学法二、免疫化学法免疫化学法分类免疫化学法分类 1.1.单向免疫扩散单向免疫扩散 2.2.火箭免疫电泳火箭免疫电泳 3
16、.3.透射比浊法透射比浊法 4.4.散射比浊法散射比浊法 前两种方法:手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结果重复前两种方法:手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结果重复性差,已趋于淘汰性差,已趋于淘汰 后两种方法:通过仪器对补体的后两种方法:通过仪器对补体的C3C3、C4C4、B B因子等单个成分进行因子等单个成分进行自动化测定自动化测定 比浊法比浊法 比浊法原理比浊法原理 借助补体的抗原性和与相应抗体反应的借助补体的抗原性和与相应抗体反应的前带前带现象现象建立的补体单个成分定量检测法。建立的补体单个成分定量检测法。比浊法不足比浊法不足 必需以过量的某种补体相应抗体为保证必需以过量的某种补体相应
17、抗体为保证 自动免疫比浊法自动免疫比浊法 反映所测补体成分的绝对量反映所测补体成分的绝对量 可进行标准化流程管理与质量控制可进行标准化流程管理与质量控制第第四四节节 补体结合试验补体结合试验补体结合试验补体结合试验(complement fixation test,CFT)将免疫溶血作为指示系统,用以检测另一反将免疫溶血作为指示系统,用以检测另一反应应 系统中抗原或抗体的传统方法。系统中抗原或抗体的传统方法。一、试验原理一、试验原理作用原理:作用原理:利用补体的溶细胞作用进行各种物理利用补体的溶细胞作用进行各种物理状态的抗原抗体测定状态的抗原抗体测定5种成分,种成分,3个系统个系统反应系统:已
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