第15章DNA的生物合成和损伤修复课件.ppt

1、目目 录录CrickWatsonDNA ReplicationTranscriptionTranslationThe Central Dogmaby Francis Crick in 1958 目目 录录 DNA的生物合成的生物合成 和损伤修复和损伤修复 DNA Biosynthesis and DNA Damage Repair第十五章第十五章第三篇第三篇 基因信息传递基因信息传递目目 录录染色体染色体DNA复制的一般特征复制的一般特征The general features of replication of chromosomal DNA第一节第一节目目 录录一、一、DNADNA复制是半

2、保留复制复制是半保留复制目目 录录目目 录录双螺旋双螺旋DNADNA复制时，复制区生长点的结构呈复制时，复制区生长点的结构呈Y Y形或叉形，称之为形或叉形，称之为复制叉复制叉(replication fork)(replication fork)。二、二、DNADNA复制的生长点形成复制叉复制的生长点形成复制叉目目 录录目目 录录三、三、DNADNA复制是双向复制复制是双向复制 一个起点，两个复制叉，双向复制。一个起点，两个复制叉，双向复制。两个起点，两个生长点，单向复制。两个起点，两个生长点，单向复制。一个起点，一个复制叉，单向复制。一个起点，一个复制叉，单向复制。目目 录录3 5 3 5

3、3 5 3 5 前导链前导链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)解链方向解链方向冈崎片段冈崎片段3 5 四、四、DNADNA复制为半不连续复制复制为半不连续复制前导链（前导链（leading strand）后随链（后随链（lagging strand）冈崎片段（冈崎片段（Okazaki fragments)DNA半不连续复制半不连续复制。目目 录录复制起点（复制起点（origin）：五、复制起点由多个短重复序列组成五、复制起点由多个短重复序列组成原核生物单一复制起点原核生物单一复制起点真核生物多个复制起点真核生物多个复制起点复制子（复制子（replico

4、n）从一个从一个DNA复制起点起始的复制起点起始的DNA复制区域。复制区域。目目 录录E.coli 复制起始点复制起始点 oriC复制起点的一般特征复制起点的一般特征:多个短重复序列多个短重复序列;可被复制起始因子所识别可被复制起始因子所识别;一般富含一般富含AT，利于，利于DNA解旋。解旋。Green:initiator binding sitesBlue:unwound regionRed:replication initiation site目目 录录六、六、DNADNA复制必须有引物复制必须有引物（一（一）多数）多数DNADNA复制使用复制使用RNARNA引物引物（二）个别（二）个别D

5、NADNA复制以复制以DNADNA或核苷酸为引物或核苷酸为引物174等噬菌体等噬菌体以双链以双链环形环形DNA的一条链上产生切口处的的一条链上产生切口处的3-OH为引物；为引物；腺病毒及某些线性腺病毒及某些线性DNA病毒病毒以以DNA末端蛋白上的末端蛋白上的dCTP的的3-OH为引物。为引物。(三三)体外体外DNADNA合成采用合成采用DNADNA作引物作引物目目 录录Protein priming as a solution to the end replication problem.目目 录录 DNA聚合酶聚合酶 ：催化合成催化合成DNA DNA解旋酶（解旋酶（helicase）：）：解

6、开解开DNA双螺旋，暴露双螺旋，暴露复制模板链复制模板链 引发酶引发酶：引发，即合成引发，即合成RNA引物，利用引物引物，利用引物3-OH开始延伸开始延伸 DNA连接酶：连接酶：连结冈崎片段连结冈崎片段 其它酶和蛋白因子其它酶和蛋白因子七、七、DNADNA复制需要多种酶参与复制需要多种酶参与如：起稳定作用的单链如：起稳定作用的单链DNA结合蛋白（结合蛋白（SSB）和改变和改变DNA超螺旋状态的超螺旋状态的DNA拓扑异构酶拓扑异构酶（topoisomerase）等。）等。目目 录录lDNA聚合酶的聚合酶的合成前误差控制合成前误差控制(presynthetic error control)和和校正

7、控制校正控制(proofreading control)功能。功能。l细胞修复系统细胞修复系统是是DNA复制高度忠实性的重要因素。复制高度忠实性的重要因素。l复制起始利用引物复制起始利用引物也是确保也是确保DNA复制忠实性的重复制忠实性的重要机制之一。要机制之一。八、八、DNADNA复制具有高度忠实性复制具有高度忠实性目目 录录 DNA聚合酶的特征聚合酶的特征 Features of DNA polymerases第二节第二节目目 录录一、一、DNA聚合酶的底物是聚合酶的底物是dNTP和引和引物物-模板连接处模板连接处dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）引物引物-模板复合物模板复

8、合物/连接处连接处(primer-template junction)目目 录录Correctly paired bases are required for DNA polymerase catalyzed nucleotide addition.二、二、DNA聚合酶的活性中心催化聚合酶的活性中心催化DNA合成合成目目 录录Schematic illustration of WHY rNTP can not be used by DNA polymerase目目 录录三、三、DNA聚合酶半闭合右手结构有聚合酶半闭合右手结构有3个结构域个结构域聚合酶活性中心聚合酶活性中心，位，位于手掌上部，即

9、手指于手掌上部，即手指和拇指接合部；和拇指接合部；35 外切酶活性中外切酶活性中心心，位于手掌底部，位于手掌底部。手掌结构域手掌结构域手指结构域手指结构域拇指结构拇指结构拇拇指指手掌手掌引物链引物链手手指指聚合酶聚合酶活性中心活性中心外切酶外切酶活性中心活性中心模板链模板链目目 录录DNA聚合酶合成的进行聚合酶合成的进行性（性（processivity):DNA夹子（夹子（sliding clamp）可增强可增强DNA聚聚合酶的进行性。合酶的进行性。四、四、可滑动的可滑动的DNA夹子增强夹子增强DNA聚合酶聚合酶的进行性的进行性目目 录录DNA聚合酶聚合酶35 外切外切酶活性酶活性与与校对校对

10、功能功能(proofreading).五、五、DNA聚合酶还有一个聚合酶还有一个35外切酶活性中心外切酶活性中心目目 录录大肠杆菌大肠杆菌DNA复制过程复制过程DNA replication in E.coli第三节第三节目目 录录E.coli DNA复制起始复制起始 一、在复制起点解旋酶和多种因子形成一、在复制起点解旋酶和多种因子形成复合物复合物l识别复制起点；识别复制起点；l解旋解链解旋解链,形成复制叉形成复制叉l单链单链DNADNA形成，形成，SSBSSB结合单链结合单链l引发体组装及引物合成。引发体组装及引物合成。目目 录录DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶（促旋酶（gyras

11、e，即拓扑异构酶，即拓扑异构酶）、）、单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single strand binding protein,SSB)DNA复制起始需要复制起始需要6种蛋白因子：种蛋白因子：目目 录录E.coli 中中DnaB结合引发酶结合引发酶DnaG，催化合成，催化合成RNA引物，其序列始于引物，其序列始于pppAG，模板链序列，模板链序列3-GTC-5，引物长度一般，引物长度一般1112个碱基。个碱基。二、二、引发酶合成引发酶合成RNA引物引物目目 录录负责切除负责切除RNA引物。引物。三、三、DNA聚合酶聚合酶合成合成DNA，DNA聚聚合酶合酶切除引物切除引物DNADNA聚合酶聚合

12、酶可利用损伤尚未修复的可利用损伤尚未修复的DNADNA链链作为模板合成作为模板合成DNADNA，但不能修，但不能修复损伤。复损伤。负责合成负责合成DNA。DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶目目 录录TLS1 Rev 1TLS，体细胞高变，体细胞高变1Pol 相对准确的相对准确的TLS（穿越环丁烷二聚体）（穿越环丁烷二聚体）1Pol TLS1Pol 体细胞高变（体细胞高变（somatic hypermutation）1Pol 减数分裂相关的减数分裂相关的DNA损伤修复损伤修复1Pol TLS1Pol DNA交联损伤修复交联损伤修复1Pol DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复

13、制，核苷酸切除修复，碱基切除修复4Pol DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复23Pol 线粒体线粒体DNA复制和损伤修复复制和损伤修复3Pol 碱基切除修复碱基切除修复1Pol 合成引物合成引物4Pol 功能功能亚基数目亚基数目真核生物真核生物TLS（translesion synthesis）3Pol (UmuC,UmuD)DNA损伤修复，穿越损伤合成（损伤修复，穿越损伤合成（TLS）1Pol (Din B)染色体染色体DNA复制复制9Pol 全酶全酶染色体染色体DNA复制复制3Pol 核心酶核心酶DNA损伤修复损伤修复1Pol 去除去除RNA引物，引

14、物，DNA损伤修复损伤修复1Pol 功能功能亚基数目亚基数目原核生物（原核生物（E.coli）原核、真核细胞原核、真核细胞DNADNA聚合酶的类型和功能聚合酶的类型和功能目目 录录目目 录录DNA聚合酶聚合酶全酶结构全酶结构核心酶核心酶由由、和和 亚基组成：亚基组成：亚基亚基（130 000130 000）主要功能是合成）主要功能是合成DNADNA 亚基亚基具有具有3 35 5 外切酶活性（校正功能）外切酶活性（校正功能）亚基可增强其活亚基可增强其活性性 亚基亚基可能起组装作用可能起组装作用complex/clamp loader目目 录录3 5 3 5 3 5 3 5 前导链前导链(lead

15、ing strand)后随链后随链(lagging strand)解链方向解链方向冈崎片段冈崎片段3 5 在复制叉同时合成前导链和后随链在复制叉同时合成前导链和后随链 同一个聚合酶如何同时合成两条链同一个聚合酶如何同时合成两条链?目目 录录 在复制叉同时合成前导链和后随链在复制叉同时合成前导链和后随链目目 录录目目 录录三、三、DNA聚合酶聚合酶合成合成DNA，DNA聚聚合酶合酶切除引物切除引物目目 录录DNADNA聚合酶聚合酶切除引物切除引物DNADNA连接酶连接酶（ligaseligase）将两个冈崎片段之间的缺口）将两个冈崎片段之间的缺口DNA聚合酶聚合酶 53 外切酶：外切酶：去除去除

16、RNA引物引物 35 外切酶：外切酶：起校正作用起校正作用 DNA聚合酶活性：聚合酶活性：填补缺口填补缺口目目 录录323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段：大片段：Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶DNA-pol 目目 录录Ter(terminus)Tus(terminus utilization substance).四、四、Tus蛋白识别复制终点使复制终止蛋白识别复制终点使复制终止目目 录录1)Parent DNA are fully met

17、hylated;2)Daughter DNA are hemimethylated3)SeqA quickly binds to hemimethylated sequences;4)Inhibits full methylation and binding of OriC by DnaA;Dam methylase methylates DNA at the N6 position of all adenines within GATC sequences.五、五、DNA甲基化保证复制起点在每个复甲基化保证复制起点在每个复制周期中仅起一次作用制周期中仅起一次作用目目 录录目目 录录 复制过程

18、中产生复制过程中产生正超螺旋正超螺旋。拓扑异构酶消除拓扑异构酶消除正超螺旋正超螺旋。六、六、DNA复制需要两类复制需要两类DNA拓扑异构酶拓扑异构酶目目 录录E.coIi的的Topo只作只作用于负超螺旋用于负超螺旋DNA，消除负超螺旋。消除负超螺旋。DNA拓扑异构酶拓扑异构酶的功能：的功能：目目 录录E.coli的的Topo将将前方产生的前方产生的正超正超螺旋转变为负超螺旋转变为负超螺旋螺旋。DNA拓扑异构酶拓扑异构酶的功能的功能目目 录录E.coli 的的Topo分离连环体分离连环体Replication termination in Eukaryotes:The end replicati

19、on problemPage333Solution 1:Protein priming as a solution to the end replication problem.Solution 2:Replication of telomeres by telomeraseReplication of telomeres by telomerase目目 录录线粒体和噬菌体的线粒体和噬菌体的DNA复制复制DNA replication in mitochondria andphages第五节第五节目目 录录一、一、线粒体线粒体DNA按按D环方式复制环方式复制环形、双螺旋环形、双螺旋DNA分子、

20、一条分子、一条H链和一条链和一条L链链dNTPDNA-pol 线粒体线粒体DNA分子特点：分子特点：l两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向；目目 录录二、噬菌体二、噬菌体DNA按按滚环方式复制滚环方式复制环形双螺旋环形双螺旋DNA分子；分子；一条为模板链，另一条为非模板一条为模板链，另一条为非模板链链?E.coli 噬菌体噬菌体DNA的分子结构特点：的分子结构特点：目目 录录3-OH5-P5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5 目目 录录目目 录录目目 录录l DNA Damage:Any changes in the DN

21、A molecule is refered to as.l Mutation:A permanent change in the nucleotide sequence of DNA is called a mutation.目目 录录Importance of DNA Repair DNA is the only biological macromoleculethat is repaired.All others are replaced.More than 100 genes are required for DNA repair,even in organisms with very

22、small genomes.Cancer is a consequence of inadequate DNA repair.目目 录录DNA损伤修复损伤修复The Repair of DNA Damage第六节第六节目目 录录一、一、复制差错和化学复制差错和化学/物理因素造成体内物理因素造成体内DNA损伤损伤DNA复制产生误差复制产生误差 化学或物理损伤化学或物理损伤 转座子（转座子（transposons）的转座作用）的转座作用自发突变自发突变遗传信息的突变来源：遗传信息的突变来源：目目 录录首先，在基因组中迅速首先，在基因组中迅速找到找到错配的核苷酸；错配的核苷酸；然后，准确地然后，准确

23、地校正校正错配核苷酸。错配核苷酸。二、二、错配修复系统修复错配修复系统修复DNA复制中出现复制中出现的差错的差错错配修复系统（错配修复系统（mismatch repair system）能能够发现和修复够发现和修复DNA复制中错配的核苷酸，提高复复制中错配的核苷酸，提高复制准确率。制准确率。错配修复系统：错配修复系统：目目 录录E.coliE.coli错配修复系统修复复制差错错配修复系统修复复制差错（一）（一）E.coli依赖依赖Dam甲基化酶识别错配碱基甲基化酶识别错配碱基所在的所在的DNA链链目目 录录模板链模板链的的GATC序列甲基化序列甲基化 MutH仅切割仅切割新新合成的合成的DNA

24、链链 MutH仅切割仅切割新合成的新合成的DNA链链 目目 录录MSH（MutS homologs）蛋白）蛋白与与MutL同源的同源的MLH和和PMS蛋白蛋白（二）（二）真核细胞利用冈崎片段连接前的真核细胞利用冈崎片段连接前的DNA缺口辨别错配碱基所在的缺口辨别错配碱基所在的DNA链链真核细胞错配修复系统无真核细胞错配修复系统无MutH，也无半甲基化，也无半甲基化标记母链。标记母链。错配修复系统错配修复系统利用冈崎片段连接前的利用冈崎片段连接前的DNA缺口缺口辨别错配碱基所在的辨别错配碱基所在的DNA链。链。真核细胞核苷酸修复错配系统：真核细胞核苷酸修复错配系统：目目 录录三、多种化学或物理因

25、素造成细胞三、多种化学或物理因素造成细胞DNA损伤损伤碱基丢失碱基丢失碱基改变碱基改变核苷酸插入或缺失核苷酸插入或缺失DNA链断裂链断裂DNA链间共价交联链间共价交联DNA损伤类型损伤类型其一，导致复制或转录障碍其一，导致复制或转录障碍其二，导致复制后产生基因其二，导致复制后产生基因突变突变DNA损伤的结果损伤的结果:目目 录录四、四、DNA损伤损伤修复系统有多种类型修复系统有多种类型DNA聚合酶（Y-家族），如E.coli：UmuC嘧啶二聚体，无嘌呤位点跨损伤DNA合成E.coli：RecA和RecBCD双链断裂重组修复E.coli：UvrA,UvrB,UvrC,UvrD人：XPC,XPA,

26、XPD,ERCCI-XPF,XPG嘧啶二聚体，碱基烷基化核苷酸切除修复DNA糖苷酶（即DNA糖基水解酶）碱基损伤碱基切除修复E.coli：DNA光裂合酶等嘧啶二聚体直接修复E.coli：MutS,MutL,MutH人：MSH,MLH,PMS复制差错错配修复酶损伤修复系统的类型目目 录录修复对象：修复对象：将将DNA中因紫外线照射而形成的中因紫外线照射而形成的嘧啶嘧啶二聚体分解二聚体分解。分布：分布：分布广泛，除哺乳动物外均有之。分布广泛，除哺乳动物外均有之。（一）（一）直接修复（直接修复（direct repair）系统利用酶）系统利用酶简单地逆转简单地逆转DNA损伤损伤光复活修复系统：光复活

27、修复系统：目目 录录修复对象：修复对象：DNA中被甲基化修饰的鸟嘌呤（中被甲基化修饰的鸟嘌呤（O6-甲甲基鸟嘌呤，与基鸟嘌呤，与T配对）。配对）。特点：特点：DNA甲基转移酶一旦接受甲基就不再具有甲基转移酶一旦接受甲基就不再具有催化活性催化活性，修复代价高昂，修复代价高昂。O O6 6-甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤DNADNA甲基转移酶修复甲基转移酶修复目目 录录E.coli碱基切除修复系统碱基切除修复系统切除胞嘧啶自发脱氨基产生的尿嘧啶切除胞嘧啶自发脱氨基产生的尿嘧啶（二）碱基切除系统修复切除受损碱基（二）碱基切除系统修复切除受损碱基Base excision repair,BER目目 录录l 胞嘧

28、啶脱氨基产生的尿嘧啶；胞嘧啶脱氨基产生的尿嘧啶；l 氧化的鸟嘌呤（氧化的鸟嘌呤（oxoG）；）；l 脱氨基的腺嘌呤；脱氨基的腺嘌呤；l 开环碱基；开环碱基；l 碳原子之间双键变成单键的碱基等。碳原子之间双键变成单键的碱基等。DNADNA糖苷酶识别的异常碱基包括：糖苷酶识别的异常碱基包括：目目 录录（三）核苷酸切除修复系统（三）核苷酸切除修复系统识别识别DNA双螺旋双螺旋变形变形nucleotide excision repair,NERNER识别识别DNA双螺旋结构变双螺旋结构变形形而非特殊碱基而非特殊碱基 UvrA识别识别DNA双螺旋结构双螺旋结构变形变形 UvrB负责解链，募集核酸负责解链

29、，募集核酸内切酶内切酶UvrC UvrC在损伤部位的两侧切在损伤部位的两侧切断断DNA链链 UvrD去除这两个切点之间去除这两个切点之间的的DNA片段片段 DNA聚合酶聚合酶和连接酶填和连接酶填补缺口补缺口目目 录录（四）重组修复系统能够修复双链断裂损伤（四）重组修复系统能够修复双链断裂损伤目目 录录E.coli 跨损伤跨损伤DNA合成合成（五）（五）跨损伤跨损伤DNA聚合酶能够跨越损伤部位聚合酶能够跨越损伤部位合成合成DNA目目 录录：在逆转录酶的作用下以在逆转录酶的作用下以RNA为模为模板合成板合成DNA的过程。的过程。Reverse transcriptionRNA肿瘤病毒肿瘤病毒 DN

30、A原病毒（或前病毒）原病毒（或前病毒）RNA肿瘤病毒肿瘤病毒1964年年,Temin等提等提出，原病毒（出，原病毒（provirus）DNA是是RNA肿瘤病毒在肿瘤病毒在复制过程中的中间物。复制过程中的中间物。目目 录录逆转录酶的结构与功能逆转录酶的结构与功能逆转录酶有逆转录酶有3种酶的活性：种酶的活性：RNA指导的指导的DNA聚合酶活性；聚合酶活性；DNA指导的指导的DNA聚合酶活性；聚合酶活性；RNAse H的活性。的活性。目目 录录目目 录录逆转录病毒逆转录病毒RNA基因组和原病毒基因组和原病毒目目 录录二、二、逆转录酶以逆转录酶以tRNA为引物合成双链为引物合成双链cDNA目目 录录逆

31、转录酶的发现发展了中心法则。逆转录酶的发现发展了中心法则。该酶是分子生物学研究中常用的工具酶该酶是分子生物学研究中常用的工具酶.Reverse transcription目目 录录David Baltimore Renato Dulbecco Howard Martin Temin The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1975目目 录录目目 录录Figure 16.6 Minus strand DNA is generated by switching templates during reverse transcription.16.2 The retrovirus life cycle involves transposition like events目目 录录Figure 16.7 Synthesis of plus strand DNA requires a second jump.16.2 The retrovirus life cycle involves transposition like events目目 录录目目 录录