离子通道与受体主讲课件.ppt
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1、 离子通道与受体离子通道与受体 主讲:张玉芹主讲:张玉芹 离子通道离子通道 电压门控性通道电压门控性通道 离子通道离子通道 包括包括 化学门控性通道化学门控性通道 机械门控性通道机械门控性通道 在活细胞中,离子通道可将不同刺激的能在活细胞中,离子通道可将不同刺激的能量转换成电信号,每个可兴奋细胞膜中都量转换成电信号,每个可兴奋细胞膜中都有很多离子通道。有很多离子通道。一、为什么离子不能通过脂质双分子层而必一、为什么离子不能通过脂质双分子层而必须通过离子通道?须通过离子通道?水分子是双极性分子,氧原子吸引电子带水分子是双极性分子,氧原子吸引电子带负电荷,氢原子趋向失去电子带正电荷。负电荷,氢原子
2、趋向失去电子带正电荷。水溶液是一种极性环境,阳离子水溶液是一种极性环境,阳离子吸引在氧原子上,阴离子吸引在吸引在氧原子上,阴离子吸引在氢原子上。离子与水相互吸引,氢原子上。离子与水相互吸引,离子被带静电的水包绕着,被水离子被带静电的水包绕着,被水包绕着的离子与细胞膜中的疏水包绕着的离子与细胞膜中的疏水区是不相溶的补可能从膜中自由区是不相溶的补可能从膜中自由通过。通过。二、离子通道的现代研究方法:二、离子通道的现代研究方法:结构和功能的研究结构和功能的研究(一)功能研究:(一)功能研究:膜片钳膜片钳patch clamp技术应用技术应用 膜片钳技术膜片钳技术是研究单通道功能的重要方是研究单通道功
3、能的重要方法。法。20世纪世纪70年代年代(1976年)德国的年)德国的科学家科学家 Bert Sakmann 在电压钳技在电压钳技术的基础上,发明了膜片钳技术,术的基础上,发明了膜片钳技术,80年年代代得到进一步改进和完善。得到进一步改进和完善。1、膜片钳技术要点:膜片钳技术要点:对被测细胞进行预处理对被测细胞进行预处理(酶消化)保持膜清(酶消化)保持膜清洁。洁。用直径用直径0.53微米尖端抛光的玻璃微电极与微米尖端抛光的玻璃微电极与被测细胞接触。被测细胞接触。封接封接 使微电极与一小片细胞膜接触通过电极使微电极与一小片细胞膜接触通过电极内负压吸引而封接封接电阻可达几亿兆欧,与内负压吸引而封
4、接封接电阻可达几亿兆欧,与细胞的其它部分在电学上完全隔离开来,用微细胞的其它部分在电学上完全隔离开来,用微电极记录到的膜电流只与这一小片膜通道分子电极记录到的膜电流只与这一小片膜通道分子功能有关。功能有关。人为钳制膜电位人为钳制膜电位可定量分析通道性质和功能。可定量分析通道性质和功能。举例:举例:2、膜片钳构型、膜片钳构型(configuration)膜片钳是一种能测定单离子通道(膜片钳是一种能测定单离子通道(single ion channels)电生理新研究技术电生理新研究技术(1)细胞贴附式)细胞贴附式(cell attached mode):这种构型适用于在完整的细胞膜上这种构型适用于
5、在完整的细胞膜上(全细全细胞胞)测定单通道电流,用于研究某些特殊测定单通道电流,用于研究某些特殊物质,如神经递质物质,如神经递质(加入到细胞浸溶液中加入到细胞浸溶液中),引起通道的改变引起通道的改变(调制或调节作用调制或调节作用)。(2)全细胞膜片钳或称穿孔膜片钳全细胞膜片钳或称穿孔膜片钳(perforated patch whole cell mode):这种构型是将玻璃微电极下的膜吸穿这种构型是将玻璃微电极下的膜吸穿(负压负压),通过电极记录的电流是整,通过电极记录的电流是整个细胞每个通道电流的总和。因此,个细胞每个通道电流的总和。因此,全细胞膜片钳测定的电流为大电流全细胞膜片钳测定的电流
6、为大电流(macroscopic current)(全细胞电全细胞电流流)。(3)膜外向外膜片钳膜外向外膜片钳(outside-out patch clamp):这是微电极下膜片与细胞脱离,但膜片这是微电极下膜片与细胞脱离,但膜片与微电极尖顶仍保持高电阻封接的,研与微电极尖顶仍保持高电阻封接的,研究单通道电流的两种膜片钳中的一种。究单通道电流的两种膜片钳中的一种。这种膜片钳适用于研究配体,如神经递这种膜片钳适用于研究配体,如神经递质、激素或通过膜外作用的药物对通道质、激素或通过膜外作用的药物对通道产生影响。配体必须加入浸浴液中,其产生影响。配体必须加入浸浴液中,其原因是浸浴液比微电极中的溶液更
7、易于原因是浸浴液比微电极中的溶液更易于更换。这一种膜型适用于一些较为复杂更换。这一种膜型适用于一些较为复杂的实验研究,如剂量一效应关系等。的实验研究,如剂量一效应关系等。(4)膜内向外膜片钳膜内向外膜片钳 (inside-out patch clamp):这是膜片与细胞脱离,研究单通道的第二种这是膜片与细胞脱离,研究单通道的第二种模式。通常用于特定细胞研究第二信使参与模式。通常用于特定细胞研究第二信使参与通道活性的调制作用,将所要研究的物质加通道活性的调制作用,将所要研究的物质加入浸浴液,直接作用于细胞浆膜的内侧面。入浸浴液,直接作用于细胞浆膜的内侧面。(二)结构研究分子生物学方法(二)结构研
8、究分子生物学方法 生物膜上的离子通道是什么样子?怎样跨越生物膜上的离子通道是什么样子?怎样跨越膜?通道开或关结构发生了什么变化?药物膜?通道开或关结构发生了什么变化?药物和递质与通道什么部位结合和递质与通道什么部位结合?这是结构研究的这是结构研究的主要内容。主要内容。离子通道是较大的糖蛋白分子(分子量离子通道是较大的糖蛋白分子(分子量2.525万)。所有通道都跨过整个膜的厚万)。所有通道都跨过整个膜的厚度。有四级结构。二级结构主要是指度。有四级结构。二级结构主要是指螺旋、螺旋、折叠和折叠和转角等。转角等。(1)结构的测定:结构的测定:通道的一级结构可用通道的一级结构可用Edman降解法和重组降
9、解法和重组DNA方法方法分析测定;利用计算机可从一级结构预期二级结构;分析测定;利用计算机可从一级结构预期二级结构;x线晶体衍射图象可确定三级结构。线晶体衍射图象可确定三级结构。(2)结构的检验)结构的检验:免疫组化法:免疫组化法:因为抗体可选择性结合于通道分子中相因为抗体可选择性结合于通道分子中相应的肽,从抗体结合发生的部位可确定通道的特异区应的肽,从抗体结合发生的部位可确定通道的特异区域在膜的内表面或外表面。域在膜的内表面或外表面。基因工程法:基因工程法:根据不同种族的同一通道基因产生想象根据不同种族的同一通道基因产生想象中的通道再与最初的通道进行比较分析通道不同部分中的通道再与最初的通道
10、进行比较分析通道不同部分的功能。的功能。(3)制造离体定点突变制造离体定点突变(site-directed mutagenesis)三、通道状态及开闭的控制因素三、通道状态及开闭的控制因素(一)(一)通道的状态:通道的状态:备用、激活、失活备用、激活、失活 备用备用 激活激活 失活失活(二)控制通道开闭的因素有:(二)控制通道开闭的因素有:1、门控机制、门控机制 (1)电压门控)电压门控通道结构中有一个特定的电荷通道结构中有一个特定的电荷区当跨膜电位改变时,电荷区受电场影响而区当跨膜电位改变时,电荷区受电场影响而移位,从而导致通道构象改变。引起开闭。移位,从而导致通道构象改变。引起开闭。(2)
11、化学(配基)门控)化学(配基)门控 特定的化学物质与通特定的化学物质与通道受体结合导致通道开闭。道受体结合导致通道开闭。(3)机械门控机械门控 当细胞收到牵拉时通道蛋白勾象改变。当细胞收到牵拉时通道蛋白勾象改变。2、失活机制、失活机制电压门控通道和化学门控通道都电压门控通道和化学门控通道都有不应期。有不应期。处于不应期则为失活状态。备用处于不应期则为失活状态。备用状态和失活状态通道的构象是不状态和失活状态通道的构象是不同的。同的。3、通道开闭的速度、通道开闭的速度 小于小于10 s四、离子通道的特性四、离子通道的特性1、无论是电压门控通道还是配基门控通道、无论是电压门控通道还是配基门控通道 其
12、其“开放开放”和和“关闭关闭”都是突然发生的。都是突然发生的。2、通道只有、通道只有“开开”和和“关关”两种状态很少有两种状态很少有 “半开半开”或部分或部分“开开”的情况。的情况。3、离子通过通道都是被动的,不消耗能量。、离子通过通道都是被动的,不消耗能量。4、通过通道的离子流有饱和性。、通过通道的离子流有饱和性。5、通道可被某些物质阻断。、通道可被某些物质阻断。6、离子通道有电荷选择性(特异性)。、离子通道有电荷选择性(特异性)。五、电压门控通道五、电压门控通道(1)Na+通道通道 由一个由一个亚单位和亚单位和2个个亚单位构成。亚单位构成。亚单位是一个跨膜多肽,可与河豚毒结亚单位是一个跨膜
13、多肽,可与河豚毒结合,从而阻断合,从而阻断Na+通道。通道。2个个亚单位附亚单位附在在亚单位上。亚单位上。Na+通道有通道有、型,型,在在CNS中多为中多为型。型。Na+通道有备用、激活和失活三种状态。通道有备用、激活和失活三种状态。有髓纤维有髓纤维Na+通道主要密集在郎飞氏结处通道主要密集在郎飞氏结处(2)K通道通道 有电压依赖性有电压依赖性K通道通道如延迟外向整流如延迟外向整流K通道(与通道(与AP 复极有关)内向整流复极有关)内向整流K通道通道Ca2激活激活K通道、通道、受体耦联受体耦联K通道、通道、其它其它K通道(如通道(如ATP敏感敏感K通道)通道)Na激活激活K通道通道细胞容积敏感
14、细胞容积敏感K通道(细胞肿胀时开放)通道(细胞肿胀时开放)(3)Ca2通道通道电压依赖性电压依赖性Ca2通道通道有有L-型、型、T-型、型、N-型、型、P-型型。受体活化受体活化Ca2通道通道第二信使活化第二信使活化Ca2通道通道机械活化机械活化Ca2通道通道静息活化静息活化Ca2通道通道 (4)电压依赖性钙通道的分子生物学电压依赖性钙通道的分子生物学在各种钙通道中,对在各种钙通道中,对L-型通道的分子型通道的分子结构研究较深入。利用与双氢吡啶结构研究较深入。利用与双氢吡啶类化合物(类化合物(DHP)特异性结合的特特异性结合的特性,将通道蛋白纯化、克隆,进行性,将通道蛋白纯化、克隆,进行分子结
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