目的基因的克隆—PCR法扩增目的基因片断课件.ppt

1、目的基因的克隆 PCR法扩增目的基因片断PCR(Polymerase Chain Reaction)，聚合酶链式反应,模拟了发生在细胞内的DNA复制的过程DNA的结构（的结构（1）三磷酸核糖核苷NTP三磷酸脱氧核糖核苷dNTP三磷酸双脱氧核糖核苷ddNTPDNA的结构（的结构（2）A腺嘌呤G鸟嘌呤C胞嘧啶U尿嘧啶T胸腺嘧啶 五种碱基A-T C-GDNA的结构（的结构（3）氢键维持了DNA的双螺旋结构DNA的复制（的复制（1）3-OH进攻5-PiDNA聚合酶催化DNA的延伸方向:5-3DNA的复制（的复制（2）DNA复制相关蛋白在复制起始点打开双链DNA然后DNA解链酶结合到单链DNA上进一步解

2、开双链DNA DNA的复制（的复制（3）DNA的复制的复制 和和 体外的模拟体外的模拟模板（母链）细胞内源 外源加入打开双链 解链酶 加热变性维持单链 单链结合蛋白 高温引物 引物合成酶 外源加入底物dNTP 细胞内源 外源加入聚合酶 细胞内源 外源加入反应环境 细胞内环境 缓冲液PCR循环循环-变性变性PCR循环循环-变性变性PCR循环循环-变性变性PCR循环循环退火退火PCR循环循环延伸延伸PCR循环循环延伸延伸PCR循环循环延伸延伸PCR循环循环延伸延伸PCR整个过程整个过程讨论讨论1：为何酶促反应需要那么高的温度：为何酶促反应需要那么高的温度v为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板

3、v防止非特异性的引物退火v延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度 vDNA聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合酶 常规用的PCR DNA聚合酶是从一种嗜热细菌分离出来的DNA聚合酶。酶活性在100 0C条件下，能保持几个小时。而其最适合酶促温度在72 0C左右。讨论讨论2：影响：影响PCR质量的一些因素质量的一些因素模板:选用纯度较高的DNA作模板，杂质蛋白和RNA的存在都会影响到DNA聚合酶与引物和模板的结合。目的片断：目的片断或者目的片断相邻的DNA含GC量较高，或者有重复序列存在，都会导致二级结构的存在。可在反应体系里加入DMSO，破坏模板的二级结构。引物的设计：引物太短，要求退火

4、的温度就低，错配的可能性就大，再者，两条引物不能存在较长的互补片断。酶：纯度、可信度，碱基错配率1/10000。讨论讨论3：PCR的应用的应用q从蓝藻里面克隆从蓝藻里面克隆SODSOD(超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶)清除人体内细胞中自由基抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰食品、保健品、药品、化妆品基因库检索 SOD的序列 设计引物以蓝藻总DNA位模板做PCR获得的基因片断连接在表达载体原核表达蛋白讨论讨论3：PCR的应用的应用q检测粉末样品是否含检测粉末样品是否含有炭疽杆菌有炭疽杆菌 炭疽菌恐慌，降临美国，席卷全球生命力强、传染快、发作快、死亡率高。有两对引物是

5、根据编码炭疽杆菌EF因子的基因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的EF因子同源。PCR产物是1247bp和208bp的片断。非炭疽杆菌均呈阴性。用营养肉汤培养2小时取培养液直接作PCR讨论讨论3：PCR的应用的应用q基因测序基因测序基因组计划首要任务就是测序Sanger双脱氧法ddATP-绿色荧光ddTTP-红色荧光ddCTP-蓝色荧光ddGTP-橙色荧光讨论讨论3：PCR的应用的应用q基因测序基因测序实验步骤：实验步骤：1.取一个干净PCR专用小管2.往PCR管里面加入各种试剂3.设定好机器各种参数4.开始PCR5.电泳检测PCR结果无菌去离子水 34ul10X PCR缓冲液 5uldNTP混合液 4ulMg+溶液 3ul引物1 1ul引物2 1ul模板基因组DNA 1ulrTag聚合酶 1ul